pMD19-T载体说明书

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1、TaKaRa Code： D102A pMD®19-T Vector TaKaRa 宝生物工程（大连）有限公司 内容 Page •制品说明 1 •制品内容 1 •保 存 1 •纯 度 1 •用 途 1 • pMD®19-T Vector的结构 1 •实验操作 2 ■Control DNA片段的克隆实验 2 ■一般DNA片段的克隆实验 2 •相关说明 3 •使用注意 4 •Q&A •制品说明 pMD®19-T Vector*-种高效克隆PCR产物(TA Cloning)的专用第体。本載体由pUC19«体改建而成, 在PUC19載体的多克騒位点处的加£ I和如I识

2、别位点之间插入了EcoR V识别位点，用尿oR V进行肆切 反应民再在两侧的3,靖激加“0而成.因大韶分咐热性DNAJR合8|进行PCR反应时都有在PCR严物 的3,末靖満加一个“A”的特性，所以使用本制品可以大大提高PCR严物的连接、克隆效率・ 由于本娥体以pUC19載体为基础构建而成，所以它具有同PUC19載体相同的功能.此外，本制品中的高 效连接液Solution I可以在短时闻内(约30分钟)完成连接反应，其连接液可以直接用于细茵转化，大 大方便了实验操作.本制品中的Control Insert (500 bp)还可以用于Control反应. 本載体与pMDF8・T Vector相

3、比，本创葩的P ■半乳糖昔II的衰达活性更高，苗落昱示蓝色的时间缩短, 茵落显示的蓝色更裸。因比，克隆后更容易进行克騒体的蓝白筛逸。 •制品内^ pMD®19-T Vector (50 ng/^il) 20 plXl 支 Control Insert (50 ng/2) 10 glxl 支 Solution I* 75 P1X2 支 *便用时谓于冰中融解。 •保存：・20乜 •纯度 ■ Control Insert经克隆后的白包菌落中，有90%以上含有Insert DNA R段・ •用途 ■进行TA克隆，克H&PCR严物。 ■对克Ifc后的PCR严物使用

4、BcaBEST™ Sequencing Primers^ M13 Primers进行DNA测序. • pMD®19-T Vector的结构 pMDs19-TVertor (2,692 bp) EcoR l Sue I Kpn\ Xma I T-Ctoning Site I BamH I Xbal Econv Sall Acc I H/ncll Pstl Sso8387 I Sphl Hind 111 8c«fiESTT- Sequencing Prtrror RV-M GAGCGGATAACAATTTCACACAGG —► Hine 11 S■朗 87 I ACC I H

5、ind ni PlL, FWI」W fopR 匕心1 Xmal 5・…GAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCTTGCATGOC-GCAGGTCGACGATATCTCTAGAGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTC l^cZ ・1・ ・#・ Digested by EcoA V ACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTQGGAAAACCCTGGCO …J CAGCACTGACCCmTGGGACCGC aGaBEST,M Sequencing Primer M13

6、-47 ・・・gtcgacgatT atetetaga... _ _,, 小丄、 …cagctgc ta Ttagagatc t...(T-Cloning Site) ・#・ [pMD®19-T Vector相关位点说明】 Cloning 8辻 e 431 BcaBEST Sequencing Primer M13-47 binding site 352-375 BcaBEST Sequencing Primer RV-M binding s辻e 484-507 LacZ operator 146-475 ColEl ori 873-1461 Ampr 16

7、32-2492 •实验操作 ■ Control DNA片段的克隆实验 A）操作方法 1） 在微丘离心管中配制下列DNA濬戒，全■为5皿。 pMDr19-T Vector*l 1 pl Control Insert*2 1 pl dH20 3 2） 加入 5 pl （等童）的 Solution I. 3） 16P反应30分钟. 注）①室温（259〉也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降低。 ②5分钟也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降低。 4） 全H （10 pl）加入至100MJM109燼受态细胞中，冰中SJt 30分伊・ 5） 42P加热45秒钟后，再在冰中放

8、・1分伊・ 6） 加入890plSOC培养基，379掘荡培养60分钟. 7） 在含有X・Gal、IPTG、Amp的L■琼脂平板墳养基上培养，形成单苗落.计数白色、蓝色茵蒂。 8） 挑选白色苗落，使用PCR法确认栽体中插入斤段的长度大小。 B）结果 使用Control Insert时的连接/转化结果如下，使用的感受态细胞的转化效率为：1.5X108 cfu/Mg pUC19 DNAo Control Insert 连接/转化效本 (cfu/ pg Vector) 白色U落比卓（％） 效車(%) * + 2.8 X106 96.3 90以上 — 2.2 X105 4

9、0.2 0 ♦效率是指白色菌落中的目的DNA Insert片段的连入效率. ■一般DNA片段的克隆实验 1)在微畳离心管中配制下列DNA濬液，全■为5 4 pMD®19-T Vector*l 1 屮 Insert DNA*3 0>1 pmol〜0.3 pmol dH2O up to 5 pl 2) 加入 5 pl (

10、长至数小时。 4) 釦t (10 pl)加入至100MJM109感受态细胞中，冰中放・30分锹 5) 42P加热45秒钟民 再在冰中放分钟. 6) 加入890 pl SOC培养基，379振荡培养60分钟・ 7) 在含有X・Gal、IPTG、Amp的L■琼脂平板培养墓上培养，形成单菌落.计数白色、蓝色WS・ 8) 挑选白色苗落，使用PCR法确认載体中插入片段的长度大小. ♦1 pMD®19-T Vector的使用■ 取0.5 pl实验也可得到满意的结果。实际操作时，可按实验需要确定T载体的使用量。pMD®19-T Vector 1 |il (50 ng)的■尔数约为 0.03 pm

11、ol« ♦2 Control Insert Control Insert 为 500 bp 的 3,末端带有 A 被基的 PCR 产物，Control Insert 1 pl (50 ng)的豪 尔数约为0.15pmoL ♦3 Insert DNA 的使用■ 在进行克隆时，Vector DNA和Insert DNA的摩尔比一般为4 : 2〜40・ •相关说明 1. 感受态细胞的选择. 转化时请使用高效的热转化赫受态细胞(转化效車A1X 108 cfu/pg PUC19),这样才可能得到比较理想 的阳性克隆。如果潘要进行蓝白筛选时，宿主细18必須具有正确的羞因型(F'编码的 严生

12、3 Fragment,才可能和假体DNA严生的a多狀相结合，表现出B ■半乳糖昔酵活性(a・ 互补性)。 2. Insert DNA 的要求• Insert DNA应该进行切胶回收的纯化处理后才进行栽体连接，尽■進免引物停其它奈质的存在。切胶回 收时可使用TaKaRa凝胶回收试剂盒(TaKaRa Code: D301威DV805A)。 3. Insert DNA使用■的计算方法・ 进行克隆时，Vector DNA和Insert DNA的康尔数比一般为1: 2〜10,我们可以根据自己的实验情况 选择合适的Vector DNA和Insert DNA的摩尔数比。Insert DNA使用■的计

13、算方法如下： Insert DNA 的使用it (ng) =nmol 数 X 660 X Insert DNA 的 bp 数 本第体1 pl (50 ng)的廉尔数约为0.03 pmol. 4. 阳性克隆的检測. DNA片段成功插入SpMD*19-T Vector*®, 一般情况下p ■半乳昔障的衰达将受到破坏，重组克隆 体在禽有X・Gal、IPTG、Amp的L■琼脂平板培养基上培养时将星尿白包苜落・但有时比校短的DNAR段 插入載体时，塞因的读码桩有可能正好与"潮读码框相物合，克隆体也会显示蓝色茵落.有报道称，2 kbp的DNA片段插入到載体中后，重组克軽体仍显示了蓝色.所以，当我们

14、没有得到白包菌落时，可以试 着检测蓝色WT落.进行阳性克隆检测时，我们建议使用PCR的方法，扩増用引物可以使用BCaBEST^ Sequencing Primers,可以对菌体直接进行PCR扩増。 5. 阳性对照卖验。 为了确认实验it作的正确性以及实验试剂的有效性，我们建议进行阳性对照实验.按照实验操作方法，使 用试剂盒中提供的Control Insert,可以进行10次阳性对照实验. 6. 转化效車的计算。 取0・1 ng的pUC19 Plasmid DNA加入至100 pl的热转化感受态細胞中后，再加入900 pl的SOC培养基 （0.1 ng DNA/ml）,将上述培养液稀释1

15、0倍后（0.01 ng DNA/ml）取100皿涂布平板（0.001 ng DNA/100 pl）,记录Wf落数.以得到200个克It体为例计算转化效率，此时的转化效車=200 cfu/0.001 ng=2 X105 cfu/ng=2 X 108 cfu/gg pUC19 DNA・ •使用注意 1. Solution I 请于冰中Mfto 2. 克It时使用的Insert DNA H段（PCR产物）建议进行切胶回收纯化，否则PCR产物中的短片段 DNA （甚至是电泳也无法确认的非待异性小片段）、残存引物芳奈质都会影响TA克騒效車・ 3. 按照*实验操作进行连接启，直接进行转化时的连接

16、液不要超过20山・当要转化的DNA量校大或 准备进行电转化时，希对连接液进行乙酵沉淀，纯化DNA唇再进行转化.进行乙諄沉淀时使用核酸 共沉剂（TaKaRaCode: D605A）可以提高DNA的回收車。 4. 连接反应请在259以下进行，温度升高（＞269）校难形成环状DNA.连接效車偏低时，可适当 延长连接反应时间至数小时。 5. 本制冊来潭于PUC19載体，因此，适合PUC19«体的燼受态细胞祁可以使用，如：JM109等. • Q&A Q-1怎样提商连接转化效車？ A-1 1. Insert DNA R段的3'末靖是否帯有“A”尾.大部分的商保真DNA豪合降（如：哒a届 Pyro

17、best. KODx田、Pfu® 扩増的PCR严物是平滑末町不能直接进行TA克隆。 2. 纯化PCR严物.最好使用切胶回收的PCR片段，以除去PCR严物中的非特异性片段和引物等 奈质。进行切胶回收时可以使用TaKaRa凝胶回收试剂盒（TaKaRa Code: D301或DV805A）。 3. 请使用转化效率大于108 cfu/^g pUC19 DNA的感受态细胞。 4. DNAR段的立体结枸、DNA片段的长短都会形响克彥效率・一般悄况下，大片段DNA的克蛊 效車（连接效車与转化效率）偏低，此时可以延长连接反应时间，威釆用电转化方法. 5. 进行切胶回收纯化DNA片段时，不要使DNA片段

18、在紫外线时间过长. 6. Solution I应尽童3!免反复冻融・ 7・建议使用新配制的平板墳养基・ Q-2转化后的菌落全为蓝色，但有目的DNAR段的插入，为什么？ A-2插入的DNAR段校短（小于500 bp）,且插入片段没有影响墓因的读根，比时平板培养墓上 出现的菌落有可能呈现蓝包（或淡蓝色）. Q-3欲对克R6DNA片段进行测序时，使用何种引物？ A-3本載体未潭于PUC19裁体・因就，用于PUC19載体測序的通用引物都可以使用. Q-4 pMD€19-T Vector•与pMD@18・T Vector^比有何不同? A-4 pMDr19-T Vector与pMDF8・

19、T Vector^比，p -半乳«f昔酵的表达活性更商，茵落显示蓝色的时 间缩短，茵落显示的蓝色更棵.pMD*18・T Vector连搂转化后，一般要经37P过夜培养，然后再将 其于冰箱内放■一段时间后，其蓝白菌落才能明显呈色.而PMD*19-T Vector涂板培养启一般只需 10 个小时（37P）便可以呈色.因比，pMD€19-T VectorttpMD*18-T VectorJEfi^JK白菌落 的筛逸・ MEMO -5- 技术咨询热线： 0411-87641685, 87641686 8008909508, 4006518769 宝生物工程(大连)有限公司 TaKaRa Biotechnology (Dalian) Co., Ltd. 辽宁省大连经济技术开发区东北二街19号(116600) No.19 Dongbei 2nd Street, Development Zone. Dalian, China 电 话：(>411-87641681 87641683 传 真：()411-87619946 87621675 E-mail： service@ V202. 04 网址: 本制品仅供研究用。请勿用于人体及动物的医疗、临床诊断或作为食品、化妆品、家庭用品的添加剂