镍柱纯化原理及方法

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1、 6 镍柱亲和层析 亲和层析的原理：利用分子间存在特异性的相互作用，它们之间都能够进行专一而 又可逆的结合，这种结合力就称为亲和力。 常见具有专一性亲和力的生物分子对： 酶： 基质类似物，抑制剂，辅酶 抗体： 抗原，病毒，细胞 细胞： 细胞表面特异蛋白，外源凝集素 核酸： 互补碱基序列，组蛋白，核酸聚合酶 激素或药物： 受体，载体蛋白 外源凝集素： 多糖，糖蛋白，细胞表面受体，细胞 文献将被固定在色谱基质上的分子称为配体，配体和基质是共价结合的，构成亲 和层析的固定相，称为亲和吸附剂。 配体以共价键结合到活化的基质上，构成固相载体 。 一般载体采用琼脂糖凝胶、葡聚

2、糖凝照、聚丙烯酰胺凝胶和纤维素等。 sss ■ AB ■1 -1 I山H— c 丘 c 吃 c N o c NH R Figure 1, Interaction between neighboring residues in the 6xHi$ 炀 anc/ Ni-NTA m口仿x. 咪唑环：是1, 3二氮杂戊环，英文名是Imidazole,如果在第一位或第三位上的 氮原子上去掉那个氢原子所剩余的部份，就叫咪唑基。就是咪唑上去掉一个和氮 原子直接相连的氢原子后剩下的部分 H C-N // HC* ^CH N H 组氨酸的性质：具有弱疏水性、咪唑环为弱电性。

3、 金属离子：Cu2+ Ni2+、Zn2+、Co2+等过渡金属离子可与 N、S和0等供电原子 产生配位键，因此可与蛋白质表面的组氨酸（His ）的咪唑基、半胱氨酸（Cys） 的巯基和色氨酸（Trp）的吲哚基发生亲和结合作用，其中以 His的咪唑基的结 合作用最强。过渡金属离子与咪唑基的结合强弱顺序是 Cu2+> Ni2+ > Zn2+》 Co2+ o 镍离子：有六个螯合价位，通常将镍柱分为了 Ni-NTA和Ni-IDA。Ni-NTA螯合了 四价，剩余两价；而Ni-IDA螯合三价，剩余三价。因此 Ni-IDA Agarose结合作 用力要比Ni-NTA Agarose强，在同样条件下Ni-I

4、DA Agarose的载量要比Ni-NTA 高，而且洗脱杂质和目标蛋白所用的缓冲液中咪唑浓度更高； 但Ni-NTA更稳定， ① 不溶性的多孔网状结构，渗透性好； ② 物理和化学稳定性高，有较高的机械强度，使用寿命长; ③ 抗微生物和酶的侵蚀； ④ 最好为粒径均一的球形粒子； ⑤ 具有亲水性，无非特异性吸附； ⑥ 含有可活化的反应基团，利于亲和配体的固定化。 例：琼脂糖凝胶微球的商品名为 Sepharose，含糖浓度为2% 4% 6%寸分别称为 2B、4B 6B。Sepharose 4B的结构比6B疏松，而吸附容量比2B大，所以4B应 用最广。 配基：是可以可逆结合特定

5、分子或特定基团的分子， 能够通过亲和色谱的方式进 行纯化。 配基的选择受到两种因素的影响：(1)：配基与目标物的结合必须具有特异性 和可逆。 (2)：必须具有化学修饰基团，使它吸附在基质上，并且不损害它的活性。 间隔臂：目标蛋白质的结合位点位于分子中较深的部位， 如果将配基直接偶联到 基质上，受到空间位阻的影响，配基不能到达目标蛋白的结合位点， 因此与目标 蛋白的结合能力低。于是在配基与基质之间插入一个间隔臂可以使结合更加容 易。间隔臂使结合最大化的同时要避免非特异性结合。 间隔臂的长度是关键，太短，无效；太长，发生非特异性结合。一般规则：偶联 的分子量小于1000时使用间隔臂；当大

6、分子量，则不一定要。 二硫键：蛋白质的的二硫键在半胱氨酸残基的硫醇之间形成， 包内蛋白离开细胞后， 二硫键 常以氧化状态存在。 此键在蛋白质分子的立体结构形成上起着一定的重要作用。 为了确定蛋白质的一级结构， 首 先必须将二硫键打开，使成为线状多肽链。 上样方式：(1)直接上样 (2)间接上样 洗脱方式：(1)pH值洗脱：pH的改变可以改变带电荷的配基基团和结合蛋白的离子化程 度，使它们结合位点的亲和性降低。(降低 pH的方法) (2) 离子强度洗脱： (3) 竞争性洗脱：(咪唑) 再生：(1)先用强变性剂6M盐酸胍冲洗柱子 (2) 用水冲洗干净 (3) 0.2%SDS

7、冲洗柱子 (4) 用水冲洗干净 (5) 50%乙醇冲洗柱子 (6) 用水冲洗干净 (7) 用 100mM EDTA(50mM Tris 100mM EDTA PH 8.0)冲洗柱子 (8) 用水冲洗干净 (9) 用100mM硫酸镍孵育柱子 (10) 20%乙醇中4 C保存 上清缓冲液及配方 上清纯化缓冲液 配方 Lysis Buffer 50mM Tris-HCl; 150mM NaCl; 20mM Imidazole; pH8.0; Elution Buffer 1 50mM Tris-HCl; 150mM NaCl; 50mM Imidazole; pH8.0;

8、 Elution Buffer 2 50mM Tris-HCl ; 150mM NaCl; 100mM Imidazole ; pH8.0; Elution Buffer 3 50mM Tris-HCl ; 150mM NaCl; 300mM Imidazole ; pH8.0; 包涵体缓冲液及配方 包涵体纯化缓冲液 配方 IB Lysis Buffer 1 IB Lysis Buffer 2 20mM Tris; 150mM NaCI; 2mM EDTA ; 2mMDTT ; 1% Triton X-100; PH8.0; 50mM Tris-HCl ; 150m

9、M NaCl ; 8Murea； pH8.0; IB Elution Buffer1 50mM Tris-HCl; IB Elution Buffer2 50mM Tris-HCl; IB Elution Buffer3 50mM Tris-HCl; IB Elution Buffer4 50mM Tris-HCl; IB Elution Buffer5 50mM Tris-HCl;  150mMNaCl ； 20mMlmida

10、zola ； 8Murea； pH8.0; 150mMNaCl ； 50mMImidazola ； 8Murea； pH8.0; 150mMNaCl ； 100mMImidazola ； 8Murea； pH8.0; 150mMNaCl ； 300mMImidazola； 8Murea； pH8.0; 150mMNaCl ； 500mMImidazola； 8Murea； pH8.0; 试剂及作用 I.TritonX -100（曲拉通）：具亲水端和疏水端，可将膜蛋白从细胞膜上解离下来， 达到提取膜蛋白的作用。常用的非离子性去垢剂。用量： 1%-3%TritonX -100 2.

11、TCEP （三（2-羧乙基）膦）：是一种非常有效的硫醇类还原剂，广泛用作蛋白质 化学及蛋白质组学研究中二硫键的定量还原剂。 该试剂在水溶液中的稳定性和溶 解性都很好。在酸性、碱性溶液中的稳定性也不错。与其他类别的硫醇类还原剂 如DTT相比，TCEP不仅是一种高效的二硫键还原剂，而且在某些巯基的交联 反应中不需要除掉。用量：1mM/ml. 3. Pepstatin（胃蛋白酶抑制剂）：抑制酸性蛋白酶，配置时溶于甲醇中，在水中不 溶解。用量：1ug/ml。 Store at:-4°C（ A week） /-20°C（ Half a year）。 4. Leupeptin（亮抑蛋白酶肽）：抑制丝氨

12、酸和巯基蛋白酶，配置时溶于水，用量: 1ug/ml。Store at:-4C（ A week） /-20 C（ Half a year）。 5. EDTA （乙二胺四乙酸）：螯合剂，消除微量重金属导致的酶催化反应中的抑 制作用。不影响蛋白质功能的情况下去除干扰金属离子， 但是同时能使金属蛋白 酶丧失活性。用量：0.1—5mmol/L。 6.Glycerol（甘油）：增加黏度，减少分子间的碰撞，用量：5%-30%。 7.SDS（十二烷基硫酸钠）：能够使蛋白质变性的阴离子型去污剂，用量：0.1%-1%。 8.TritonX -114（曲拉通）：温度在22C以上时，在蛋白质溶液中加入 2%

13、的TritonX -114可使蛋白质从去垢剂相和液相中分离， 可溶性蛋白在液相中，而膜蛋白则进 入了去垢相中。（内毒素存在于细胞壁组分，菌裂解后释出物中。） 9.DTT （二硫苏糖醇）：常常被用于蛋白质中二硫键的还原，可用于阻止蛋白质 中的半胱氨酸之间所形成的蛋白质分子内或分子间二硫键。但 DTT往往无法还 原包埋于蛋白质结构内部（溶剂不可及）的二硫键，这类二硫键的还原常常需要 先将蛋白质变性（高温加热或加入变性剂，如6M盐酸胍、8M尿素或1%SDS） < 用量：1-2mM. 10. L-Arginine（L-精氨酸）：增加蛋白质的溶解性，阻止蛋白质分子间通过疏水作 用发生凝聚而产生沉淀。用量：0.4-0.6mol/L. 11.