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1、病毒TCID50测定（组织半数感染量）
操作步骤
(1) 准备细胞
取出一块细胞培养板，每个孔大约传8000～10000个细胞（一个T25瓶的细
胞消化后加10ml培养液正好传一块96孔板，要传匀）。每个孔的细胞铺成单层大约60％丰度即可接种病毒（下午传好板第二天早上就能用）。
细胞对照选取16个孔即可。滴定与对照可以在一块培养板上进行，操作中注意不要窜孔。也可以分别在不同的细胞培养板上进行，但要保证实验条件一致。
(2) 稀释待测病毒液。
A法为参考书上标准的操作方法
B法参照书将液体量减少后的结果
病毒稀释液根据是否需要胰酶来选择适合的液体，无论哪种都无血清。
A向每
2、支试管中加入1.8ml病毒稀释液。向1号试管中加入0.2ml病毒，依次10倍系列稀释至适宜浓度，最后一支试管。
B在EP管中用无血清的孵育液10倍倍比稀释病毒原液(10-1，10-2…10-10等)，根据病毒大致的滴度确定稀释的倍数。首次滴定可以多稀释几个滴度。
根据接种的孔数稀释病毒，常规每个稀释度接种4孔，则每个稀释度配500µl，即10-1为50µl加入450µl的孵育液中；如每个稀释度接种8个孔，则各配制1ml，即10-1为100µl加入900µl孵育液中。若接种8个孔，则相应增加液体量。上述的配液并不是固定不变的，可以根据接种的量自行调整。
【！此步操作注意事项：
1）建议每
3、个稀释度接种8个孔，若要统计分析则还要增加至16个孔。
2）病毒稀释过程中一定将病毒液与孵育液充分混匀。
2）此过程中需要使用加样器和tip头。使用前用75%乙醇擦拭加样器，并用紫外线照射20min，确保无菌。使用新高压的tip头，外包装一定在超净台（或安全柜中打开）。】
(3) 接种
取细胞培养板，用多道加样器（又称排枪）吸去96孔板中的培养液，吸取孵育液加在每孔中再轻轻吹打一次，然后吸出孵育液（此步目的是去除血清，因为血清能干扰病毒的吸附）。将稀释好的病毒液加到96孔板上，每孔100µl，根据观察的习惯，一般从右到左，从上到下，从高稀释度到低稀释度（10-1，10-2 ）到原液加样
4、。【切记：设置正常的细胞对照。每次实验要重复4次，计算标准差。】
37℃CO2培养箱中孵育1h，取出培养板吸去病毒液（从低浓度向高浓度吸取可避免窜孔），加入维持液200µl继续在37℃ CO2培养箱中培养。
(4) 培养
将培养板放置于CO2培养箱。培养温度 ，培养 天。
(5) 测定结果
取出培养板，显微镜下观察细胞病变。
计算方法
1) Spearman-Karber 法
LgCCID50 /0.2ml= - （X0 - d/2 + d×∑R1/N1）
X0 = 全部病变最低稀释度对数
d = 稀释因数对数
5、 N1 = 每个稀释度所种的孔数
R1 = 病变孔数
∑ = 积和
LgCCID50 /ml = LgCCID50 /0.2ml +0.7
2) Reed-Muench法
观察CPE, 找出能引起半数细胞瓶或管感染的病毒稀释倍数，按计算出该病毒液的TCID50
由表看出，能使50%细胞管出现病变的病毒稀释度在10-4~10-5之间，其中间距离比例按Reed和Muench公式计算：
TCID50＝高于50%病变的病毒最高稀释度的对数＋距离比例
故能使50%细胞管发生病变的病毒稀释度为10-4.5，即TCID50为104.5倍，当病毒悬液做104.5倍稀释时，0.1ml中含1个TCID50，作其他一些实验时（如中和试验），一般常用100 TCID50/0.1ml。
3) 判定标准
细胞对照无病变，在无标准品时，应增加实验次数以减少误差。
病毒TCID50测定
