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1、紫外诱变方法 宋炜等：高产脂肪酶酵母菌株的分离筛选及紫外诱变 中南林业科技大学学报，2009，29(3)： 55-64
1．2．4 紫外诱变
1．2．4．1 紫外诱变处理
取2 mL处于对数生长期的菌液于直径75 mm的无菌培养皿中，置于30 w紫外灯下30 cm处， 分别照射处理：30 S、45 S、90 S、120 S、180 S、240 S、300 S,每个处理重复3次，用 罗丹明B平板计算存活率，得出诱变致死曲线。每次紫外照射后在黑暗培养箱中静覺0min, 然后在黑暗中稀释至10-4、10-5倍，分别取0.1 mL涂于罗丹明B平板上，每级稀释液涂抹3个平 板，以不进行照射作对照，
2、紫外线照射以后的操作都在黑暗中进行，防止光修复。将涂匀的 平板，用黑布裹好，置于28°C恒温培养箱中避光培养4 d。
1．2．4．2 突变菌株的初筛
将培养好的平板取出进行菌落计数，计算致死率。致死率%)=100 — (处理后每0.2mL菌落数 /对照每0.2 mL菌落数)X100。同时测量透明圈直径(D)和菌落直径(d),用接种针挑取经不 同剂量诱变的直径较大菌落，将相同处理剂量D / d比值大于对照D / d的菌落穿刺于同一个罗 丹明B培养皿上，每皿点6个，黑暗条件下培养4 do
1．2．4．3 突变菌株的摇瓶复筛
从相同处理时间的初筛平皿中选取D/d最大突变菌株，28 C摇瓶培养
3、72 h，离心取上清液 测酶活力．
孙同毅等：高产碱性蛋白酶菌株HAP26选育 氨基酸和生物资源2007，29(2)： 20〜22 1．2．1诱变
(1) NTG诱变处理
将在10 g・L〜N—甲基一硝基一N—亚硝基呱(NTG)溶液中浸泡过的滤纸片('p1. 5 cm)放在 涂满嗜碱芽抱杆菌HAP26的培养皿中央。
(2) N+离子注入条件
本试验采用由郑州大学提供的离子注入机。注入离子能量为30 Kev，单次脉冲时间为6 s, 间隔时间为60s,单次注入离子能量为X1014 N+个数/cm2，真空度为5〜6X10-3Kpa。每个 无菌平板加入0.1 mL抱子悬液，涂布均匀，无菌风吹
4、干(每一注入剂量做一个真空对照)，注 入剂量分别为3、8、l0、30、50、80、100、200(离子束单位为X1014N+个数/ cm2)。将诱变 抱子适当稀释涂布于高氏培养基平板上，计数。
李祖明等 高产碱性蛋白酶菌株的选育及其固态发酵条件的优化 食品科技 2008,(4):5-8
1. 3 诱变育种
将活化后的出发菌株接人固体斜面培养基中，30C,培养一段时间后，用生理盐水将菌苔洗 下，制备菌悬液，菌数约为lO8 cfu/mL。取菌悬液4 mL加入到直径6 cm培养皿内，以紫外 灯(20 W,距离30cm)照射不同时间。菌液稀释后涂布于平板分离培养基上，30 C避光培养 一段时间后
5、，分别倒人适量10%三氯乙酸，静置l0 min，测定菌落周围出现的透明圈直径 (d / cm)和菌落直径fd/ cm)并计算比值(HC值)，与未处理的进行对照，选取HC值较大的单菌 落编号并移接到斜面保藏培养基上，保存于4C冰箱，待固态发酵复筛。
刘鑫等：高产酸性蛋白酶黑曲霉菌种选育四川大学学报(自然科学版)，2005, Vo1.42 NO.1
158-161
紫外线诱变处理：用接种环取新鲜PDA斜面上的黑曲霉Asp 5609抱子少许，加入无菌水中进 行稀释，用血球计数板进行计数，使每毫升溶液中抱子量约为5000个，取0.1mL涂布初筛平 板.30°C恒温培养4h，让抱子萌发，然后用15
6、W紫外灯照射8min后(紫外灯与平板垂直距离 30cm)，在黑暗的培养箱中继续培养3d,挑取透明圈大的菌落用作亚硝基胍诱变处理菌株［3］； 亚硝基胍诱变处理：用接种环取新鲜PDA斜面上经紫外线诱变处理的黑曲霉抱子少许，加入 无菌水中进行稀释，用血球计数板计数，使每毫升溶液中抱子量约为5000个，取3mL抱子悬 液，加入等体积的亚硝基胍溶液(3X10-3g/mL)，充分混合，于30C振荡处理lh,取出稀释 涂平板，30C培养3d，挑取透明圈大的菌落分别进行发酵试验⑶。
李宏等，高温碱性蛋白酶菌株的选育及酶性质研究 食品与发酵工业， 2005， 3l(4)： 29-32
1.2.3 NTG与紫
7、外线复合处理
将50C培养12 h的菌液，离心去上清液，用0.05 mol / L，pH7.4的磷酸缓冲液洗涤菌体2 次，再用此缓冲液配成1 x 1011 cfu / mL的菌悬液，加入NTG使其终浓度分别为40、100、200、 400m g/mL，37C水浴处理30 min，间歇摇动，离心后去掉含亚硝基胍的上清液，再用磷 酸缓冲液洗1次，重悬在同样体积的缓冲液中，倒入直径为5 cm的培养皿中，在黑暗中用紫 外灯(15 w,距离30 cm)分别照射20 s、30s、1 min，经适当稀释后涂布平板，50C培养24 h,待长出单菌落时挑出接到斜面上。
碱性蛋白酶生产菌的育种及其液态发酵条件的研究 食品研究与开发 2008,29(5):19-23 诱变育种
将活化后的出发菌株接人固体斜面培养基中，30C培养一段时间后，用生理盐水将菌苔洗下，制备菌 悬液，菌数约为108个/mL。取菌悬液4 mL加到直径6 cm培养皿内，以紫外灯(20 w,距离30 cm)照射 不同时间。菌液稀释后涂布于平板分离培养基上，30C避光培养一段时间后，分别倒人适量10%三氯 乙酸，静置10 min,测定菌落周围出现的透明圈直径(d/cm)和菌落直径(d / cm)并计算比值(HC值)， 与未处理的作对照，选取HC值较大的单菌落编号并移接到斜面保藏培养基上，保存于4C冰箱，待固 态发酵复筛。
紫外诱变方法
