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1、DEAE 纤维素梯度层析实验 一 实验原理 DEAE-纤维素是以纤维素为母体接有二乙基氨基乙基（ DEAE）活性基团的 弱碱性阴离子交换剂 ,它在离子交换层析中可用于蛋白质、核酸、激素、酶等 大分子的分离与纯化。对于某些组分比较复杂或性质比较相近的蛋白质样 品。在采用一般的恒溶剂系统进行离子交换柱层析时，往往不容易分离，这 时可采用梯度洗提（装置见图 1-2）。即用一定的样品离子在不同的离子强度 （或 pH）溶液中对一定的离子交换剂的平衡常数不同，在洗提过程中，通过 不断改变洗提的离子强度 pH不变） 根据实验的具体情况，也可同时改变离子 强度和 pH，以逐步改变样
2、品中各组分与离子交换剂的交换能力，最后得到分 离，这种层析方式即称为梯度洗提层析。洗提剂的梯度产生如图所示，当 A1=A2时，产生线形梯度；当 A1A2时，产生凹型梯度；当 A1
3、、笔记本电脑 （ 3）、紫外检测仪 （ 4）、梯度混合仪 （ 5）、恒流泵 3-2、实验器材 （ 1）、 层析柱 （ 2）、 烧 杯 （ 3）、 可调取液器 （ 4）、 量 筒 （ 5）、 玻 棒 （ 6）、 标签纸 （ 7）、 记号笔 （ 8）、 洗耳球 3-3、实验装置图 四 试剂与配制 4- 1 实验试剂 （ 1）、三羧甲基氨基甲烷（ Tris） （ 2）、鸡蛋白蛋白（ CEA） （ 3）、 DEAE-52 （ 4）、盐 酸 （ 5）、氯化钠 4-2试剂配制 （ 1）、 Buffer A（ 2
4、0mM pH8.0 Tris-HCl ）的配制： 称取 Tris 60.7mg ，于一烧杯中，先加少量蒸馏水溶解，然后用稀 HCl调至 pH8.0，最后加蒸馏水稀释至 100毫升，混匀即可。 （ 2）、 Buffer B的配制： 取 Buffer A 50毫升，加氯化钠（ 1.0M） 2.9克，溶解混匀即可。 （ 3）、 CEA样液的配制： 20.0mg CEA+1ml Buffer A 五 方法与步骤 1 树脂的处理 2 装 柱 柱 高 10.0cm 3 平 衡 流 速 0.8 ml / mi n; 30.0 min 4 上 样 上样体积 1.0ml 5 洗 涤 1.0ml 2次 ; 再自动洗涤 15 min 6 洗 脱 梯度混合仪 A B杯 ,各倒入 A - B溶液 60ml 最后一个峰已回到基线时，继续洗脱 10分钟 7 收 集 8 测 定 思考题 1、 DEAE-纤维素最佳吸附 PH范围是多少？ 2、 DEAE-纤维素再生最适酸、碱浓度是多少？
DEAE纤维素梯度层析.ppt
