实验室日常小技巧集锦heSDS PAGE 电泳 常见问题分析

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1、实验室日常小技巧集锦 平时在实验室最常听到的一句话就是“今天某某试验没做好是为什么？今天某某 试验没出结果是什么原因？今天某某试验为什么会是这样的呢？ ”等等。然后 仔细一查找原因，往往是由于操作上面的不认真，或是一些小小的细节没有注 意到。以下是集各路朋友的一些经验，与大家分享： 1跑page胶的时候，小电压跑会避免高电压产生的热量尔导致的胶层变形。低 电压泳道会比大电压泳道跑的直一些，且分离效果更高，有利于分子量相差不 大的蛋白分离。 2. 提取质粒的时候，最后一步的酒精挥发很关键，基本上是其后续的酶切反应 的决定性因素。所以这一步尽量挥发长一点时间，最好是空调吹热风，或是37 度温箱

2、放长一点的时间，我试过室温过夜，酶切很好。 3. 做WESTERN BLOT的时候，大家往往会摸索一抗、二抗的浓度，封闭时 间，曝光时间等等，而每次变换其中的一个条件就需要从新跑胶、转膜，甚至 重新提蛋白，这样会浪费大量的时间。其实完全没有必要这样。一次转膜后， 将PVDF膜晾干，裁减成小块，保存起来，用的时候取出一块，没有任何影 响。这对于摸索条件的战友来说，节约了大量的时间。 4. 有关缓冲液和培养基配置 1） 将缓冲液配方中的成分分别以10—100倍配成母液储存，需要的时候只需将 相应的母液混合，补加水稀释即可 2） 配培养基时通常会忘记各成分的量，如配LB时的三个成分不记得到底

3、哪个 是5g，哪个要10个，因此可以在常用的试剂瓶的标签上注明所需的量，如配 LB时，在NaCl瓶外注明10g/L, yeast 5 g/L, tryton 10 g/L等，很方便，不需要 每次配之前临时翻书 5. 有关PCR主反应液配置： 在做克隆鉴定的时候经常需要在酶切鉴定前进行PCR鉴定，每次配置PCR反 应液很繁琐，可以将其配置类似kit的形式，按你需要的反应体系列表，然后放 大100倍配置100x主反应液（100次反应），其中含buffer，Mg2+，dNTPs， 但不含引物和Taq酶，然后可以10x分装或一管储存在一20度，在需要的时候 拿出融开，然后按所需的PCR反应个数吸

4、取相应的倍数，再补加相应反应倍数 的Taq和引物，混匀后分装，这样做的好处如下： 1） 可极大的节省宝贵的时间，可早点收工，看球 2） 避免每次反应加样不均的可能 3） 大大减少PCR假阳性的产生 6. 有关酶切反应液的配置： 在做酶切时，也可以象PCR 一样配置主反应液，每次反应前先列好反应的体 系，算好需要的反应数，然后按所需反应的体系按所需反应数放大，加入 buffer、酶、水，质粒栏空缺，然后混合后按除质粒DNA的体积分装，然后再 在每管中加入相应体积的质粒DNA酶切，这样做的好处如下，特别是当同时 有10几个阳性克隆需要鉴定时尤为明显： 1）各反应成分均一 2） 可大大

5、减少限制型内切酶的使用 3） 节省时间 7. 有关 SDS —PAGE： 1） 可将SDS—PAGE的积层胶，分离胶预先配好大体积如100ml储存在4度冰 箱（注：10%AP, TEMED不加，切记！！ ！），每次配置时只需吸取相应体 积的预制胶加入AP, TEMED即可，没必要每次制胶时候翻分子克隆，特别方 便，而且，这样的预制胶可储存半年以上，不失为偷懒的绝佳方法；更关键的 是可大大减少与丙稀酰胺的接触，因此大大减少中毒的机会。 2） 电泳时虽然小电泳分离效果要好一些，但2小时以上的等待的时间实在是痛 苦，因此可以提高电泳至150 V,但需要将整个电泳槽放在放满冰水的脸盆里散 热，

6、这样跑出来的胶分离效果丝毫不比低电压来的差，关键是时间大大节省， 不需1h即可看结果了 8. 实验中小窍门我想能够分成两类：一类是“非常规”操作；一类是常规操作过 程中一些省时省事手段。 前一类，我举个例子：有时候第一天涂的转化平板、次日早晨转化子可能长成 的菌落比较大（1〜2毫米以上，BL21就长得快），下一步转化子做质粒鉴定。 这个情况下可以直接挑取一块菌苔（勿带出培养基），50微升酚/氯仿悬浮菌 体，放置两分钟，加40微升TE抽提，上层TE吸出后再氯仿抽提一次，吸取 上层TE即是质粒提取液。提取的质粒可以直接用于电泳和酶切。这样操作， 可以省去转接液体试管的培养步骤，至少节省6〜8小

7、时的时间。但是，要在各 步骤都控制得很好的情况下才能保证提取和酶切的效果，不同的实验室或者操 作者未必能够很方便地重复----其实，其它的一些“小窍门”也是如此。 后一类的小窍门则在实验室中无处不在。如：平行作不同样本的PCR,模板 DNA加量一样，配置PCR体系可以一起配制后分装----这点做过试验的都知 道，但是配制的时候配制量可以比预期分装量稍多一点（如用100微升则配 110微升），这样可以避免有时候分装不够的尴尬，因为不同特别是大小不同 的枪，会有误差。再比如：楼上有站友说的sds-page胶预配（APS和 TEMED、或者后者先不加）的问题，实际上时间放置过长肯定影响效果，如果

8、要在一天内连续地跑两次板，何尝不可？又比如，配sds-page胶的时候，上层 胶和下层胶可以只用一个大枪头：先取胶，次取水，取6.8的tris后再取8.8的 tris，省时省料。 20021108站友开的这个帖子很好，在上上层楼的帖子说得也有道理。但我想， “窍门”和“偷懒”不应该是因果关系。其实，不管是那一类的小窍门，都是在充 分地理解实验各步骤的原理、经过多次试验积累、再加上一点点思索然后尝试 的结果。知其然知其所以然和勤于思考敢于探索，是根本。否贝I」，别人的小窍 门对你也未必能够有用。才进实验室的新手，务必要先练好规范扎实的操作， 然后才能弄“窍门”。本末倒置，贻害无穷。 9. 我

9、一直是把SDS—PAGE的积层胶，分离胶预先配成mixture，APS制胶时加 入，半年内使用，绝对没有问题，我保证。 10. 做SDS-PAGE的时候，除了蛋白量上样一致，最好体积也一致，这样跑出 来的胶各个泳道之间的band能做到一样宽，方便后面的比较，特别是WB。做 法就是拿1X的上样缓冲补全要加的样做到体积一致，否则跑出来会有的宽有 的窄，特别是上样体积相差较大的。 11. 在把蛋白胶做成干胶时，很多时候会因为有气泡使胶裂掉，我的经验是在做 胶时加上层膜前在胶上多加些水就不容易进气泡了，还有就是高温烘胶，我喜 欢放到60度烘箱里烘，这样水分蒸发速度快，即使有一些小的气泡也不会有影

10、响，呵呵，这是经验之谈，我从来都没失手过，大家可以试试 12. 做大肠表达时确定蛋白是否表达一般要煮样做诱前诱后检测,但很多时候煮 出来的很黏影响跑胶效果•我发现如果现用8M Urea重悬细菌再煮效果会有极大 改善. 注:不能用Gu-HC 1代替 13. 我也推荐几个偷懒的方法 1做SDS-PAGE跑胶通常都是现配现用，但配胶要＞1h，所以如果想第二天睡个懒 觉而又不耽误跑胶可以于前一天晚上做好浓缩胶和分离胶,待凝聚后不要拔下梳 子,把含胶玻璃板从制胶槽取下，用保鲜膜包上,注意玻璃板上下两边缘会有气体， 所以需要加一点电泳缓冲液以避免胶内水分蒸发•然后放4度过夜.第二天直接 拔下梳子行

11、后续•国外好多公司出售脚既是如此，可以保存上星期. 2配置分离胶或者非变性胶时因胶凝时收缩可导致加样孔变浅•可以将加剩的胶 放入4度以降低凝聚速度,而将凝胶放入37度促聚，并随时用4度加剩的胶补充 下降的胶面.另外将胶横放与水平面成〜10度角也可以减少收缩的影响. 3推荐一个节约抗体/时间的做法： 同时跑2块胶，同时转膜，然后两块膜背靠背放入同一封口膜同时封闭,同时一抗 二抗（最好是用转轮，这样效果好•如果是摇床，隔一段时间帮它们翻个身以保证两 张膜的正面都有机会与液体充分接触.一起洗膜（可以稍微加强洗膜也可以不做. 我最多一张盘子里放4张膜而没有影响洗膜）•可分别或同时压片•这样就可以

12、节 约一半抗体和接近一半时间而不会影响结果. 或者另外一个就是孵育后的抗体不要扔，好的抗体可以反复做好几张膜呢•但每次 都会减弱，效果不如上面一种方法. 14. 做western blotting转膜时，胶放在转膜缓冲液中一段时间，待胶在含有甲醇 的缓冲夜中缩小的差不多后装好转膜装置，我的经验是把膜印在胶上直接在膜 上画出预染maker条带，方便的很。因为很多时候跑电泳时胶上的预染maker 很清楚，等转膜后就不是分辨的很清楚了。不过要注意画好预染maker后就不 要使胶和膜发生对位移动了，以防maker失去参照价值。 15. 超滤最合适用于蛋白的浓缩，更换缓冲液和除盐，对于按照分子量进

13、行初分 离的效果不是很好，理论和现实是有很大差别的人—人 16. 关于 Western Blot 1） 器具的清洁非常重要，开始做前，为了安全，尤其是装胶的厚薄玻璃板，可 以先用中性洗涤剂和自来水反复冲洗，确保无洗涤残液后用蒸馏水冲洗2 — 3 遍，然后用去离子水冲洗一遍。最后用95%酒精再擦一遍后晾干备用。 2） 配胶最好现用现配，先配下层胶（分离胶），后配上层胶（浓缩胶或积层 胶），而且在临灌胶前加APS并迅速混匀，即用移液枪抽吸与注入1—2次即 可。 17跑蛋白page的时候，一开始用加样针，太麻烦，发现用20u1枪+普通小白枪 头点，非常省事。另外，点样时有可能看不清孔在哪，看

14、远离你的那面胶，孑L 有反光的。点样也点你对面的那块胶，省的总低头，干咱这行的容易得颈椎 呀，爱惜自己。 18. 垂直电泳时，可在电泳糟中放入青霉素小瓶等，可自然使液面提高而不影响 电泳，又很节约电泳缓冲液。 19. 我们有时要沉淀东西时，由于沉淀量很少，离心完之后不知道到底有没沉淀 下来东西，由于量很少，不好观察，所以离心时建议按特定的方向放置离心 管，这样你就可以在离心之前确定沉淀该沉淀到管子的大致部位，这样离心后 就可直接观察那有没有沉淀，避免满管子找，另外看沉淀时可以对光看，这样 就是颗粒状的细小沉淀也能看见的。 20. 大家都知道PMSF有剧毒，以前都是知道浓度和要配的体积的

15、基础上，算出 要称多少毫克的PMSF,其实也可以先称PMSF,称多少算多少，再调整异丙醇的体 积，到达你所要的浓度。这样就避免了你长时间和它接触。 21. 跑好SDS-PAGE胶的一些体会。 1. 清洗好玻璃板，不要偷懒，很多时候跑完电泳撬胶时会因为玻璃板不干净胶 粘在板上把胶撬破。 2. 配胶时不要反复用枪混，稍微摇混就可以了，用枪混多次会导致胶凝不好影 响电泳图的分辨率。 3. AP分装成500微升一管保存放-20度，避免AP用太久失效。 4•倒胶时把玻璃板中的水用滤纸尽量吸干，因为微量的水存在会影响配的胶浓 度。 5. 尽量不用过夜放室温或者四度的胶，也回影响胶的分离效果。

16、 6. 电泳完撬胶时根本不需要用撬胶板，在一平皿里装好水，把有胶一面的放在 水中晃动几次胶很容易就脱落下来，一点没有问题，方便的很。 7. 点样时样品别忘了离心这步，因为上样含有固体沉淀会影响电泳图分辨效 果。 8. 尽量在冰浴状态下跑。 22. 做 2-DE 做的比较多，总结了几个小窍门： 1 .一向电泳时，盐离子容易聚在胶槽的两侧.剪一小段IPG胶条放在 两侧，构成盐桥，电压就容易上去了.避免一向电泳不好影响最后实验 结 果. 2. SDS-PAGE时，在灌胶之前，一般大家都会用凡士林封底，在SDS-PAGE 电泳之前又必须把凡士林搽干净，很是麻烦，我的经验是:不用凡士林，取少

17、量未加 Ap的分离胶，按比例加2倍量的Ap，然后灌入板间，等上几分钟，待胶凝固后就可 以接着灌分离胶了 •方面，效果好！ 23. 蛋白质纯化时，蛋白质降解可能与超声破菌保持冰浴有关，之前建议加 pmsf,建议在上柱子洗脱的时候也加pmsf （蛋白降解抑制剂），一定要用之前 再加。 24•做透析的时候，拿一个5ml的枪头或者是其他类似的东西，剪短，穿过个塑 料泡沫之类的面积比烧杯大东西，然后把透析带一端扎紧，另一端开口绑紧在 5ml枪头下端，扎紧得那端也可以弯过来绑成u字型。这样就可以用1ml的枪 穿过5ml的枪头的孔，另一只手调整透析带，来加样取样，省去了总绑透析带 的麻烦，对同一个蛋白大

18、量多次透析非常方便 25. 第一次发贴说一下自己的小经验，希望版主能给我一分，每次看到好东西因 为没分都没法下，好羡慕有分的人啊。当然也不能不劳而获，说一下自己的实 验技巧给大家分享。 1. 配SDS-PAGE胶时，用枪头混匀比较麻烦，而且费时费力，效果也不好。可 以剪一小段夹文件的那种曲针做转子放到配胶的小烧杯里，在磁力搅拌器上边 搅边加入各溶液，这样加完也就混匀了，直接灌胶即可。 2. 上面的站友也说过，上样用黄枪头就行，我也一直在用，根本不用注射器， 方便的很，建议大家也试试。 3. 电泳后考马斯亮蓝染色一般要1h到2h，脱色也要2h左右，麻烦的很。现在 给大家说一个简单的方法，

19、是我从一个师姐那里学到的。 加入染色液后，先放入微波炉里加热5-10秒，使染色液微热即可（千万不要加 热太久，否则冰醋酸就挥发了）。然后放水平摇床上摇20分钟，最多半小时就 染好了。 脱色也很简单，不用脱色液，直接用去离子水，放微波炉里煮沸5分钟左右， 然后将水倒掉，再换上新的去离子水煮，这样反复几次，就可以了。效果可能 比正常的脱色稍差一点点，不如那样清楚，只要电泳时比平时多上1/5的样品 就可以了，关键是这样省时省材料（用不着含甲醇和冰醋酸的脱色液）。方便 快捷！ 放心，反复煮胶不会把胶煮坏的。 26. 我也说说我的小经验。可能大家都知道，请别笑话我。 1、 配胶时一定要掌握好时

20、间，不要因为过度赶时间，而造成以后的条带粗大， 压不成条带，且消耗很多试剂和时间。 2、 加样时，冲洗加样器可用双蒸水，用电泳液会使加样器中有很多的泡沫。或 许是因为SDS的原因吧？ 3、 对于大分子蛋白质，转膜过夜更好。滤纸的张数可以适当减少。 4、 在跑样时同时加入MARKER有助于正确识别所需的蛋白位置，减少NC膜 的消耗。 5、 一抗、二抗的浓度不要太高。 6、 做ECL显影时，根据荧光的亮度调整时间。泡完显影液，胶片应用水洗一 下，以减少定影液变黄。 7、 和有经验的同学交流，也是非常重要的。知识的交流绝对有助于试验的成 功。 这是我目前的一点拙见。 27. 推荐一个

21、省质粒试剂盒硅胶柱与溶液的方法： 所有试剂使用手提质粒自己配置的溶液一、溶液二、溶液三（代替试剂盒的 solutionl、2、3），然后一比一的与饱和碘化钾或碘化钠（代替结合缓冲液） 混合，就可以让质粒在硅胶上结合，而试剂盒的硅胶柱可以重复使用，没有试 剂盒溶液量的限制，只要是一样的质粒我想提几管就提多少。 顺便说一句硅胶柱也可以用自己买的硅胶粉末代替，离心后倒掉硅胶柱上面的 上清就可以，用起来不象柱子方便。效果比手提的要好要快。 28•做WB时，样品比较多，又怕放时间长了对蛋白样品不好，而且确定以后肯定要 做某个抗体，只是一时没有决定.那么你可以选择先做SDS-PAGE,并转膜.然后把

22、 PVDF膜凉干，放四度保存.以后拿出来封闭后,加抗体就行了.蛋白在膜上，且已 经分离，比保存在BUFFER里面的蛋白肯定更可靠。呵呵 29. 今天作his纯化的时候，又琢磨了一个窍门，与大家分享。我得样品比较 多，几百ml,而柱子不够大，只有10几ml,跑来跑去的上样，还总得记着， 太麻烦了。于是，我就刷干净了一个烧杯，装了我的样品，找了一个细胶皮 管，当连通器，就像鱼缸换水一样，用5ml枪在一头一吸，液体流出来，放到 纯化柱里，调好烧杯的位置，两个液面一样平了，呵呵，上了好几个小时了， 没有问题，现在调低速度，过夜上样：） 30. 能导致PAGE胶不凝的原因主要有三个： 1、 配胶中

23、用到的主要试剂的配置。 主要就是30%的丙稀酰胺的配置。粉末状的丙稀酰胺和甲叉丙稀酰胺使用不应 该超过一年，因为丙稀酰胺会吸潮水解，这样以来丙烯酸的含量就会加大，从 而导致page胶不凝。 2、 温度。 温度高时凝固快，但是亦不宜过高，因为温度变化会影响交连物的孔径大小。 所以温度在25度最为合适。 3、 氧气。 氧气是凝固的终止剂，所以不能让胶中出现气泡。 虽然都是些看起来听低级的错误，但是不注意还是会犯。 31. 我做2维蛋白电泳，也有些心得： 1、 向电泳玻璃板内加入胶条时，先在缝隙中加入配好的溴芬兰缓冲液，要加 满，再将胶条贴后面玻璃板壁用薄塑料片将胶条缓缓推下至凝胶上

24、缘，这样可 以很好的避免胶条下形成空气泡。 2、 能做出好的图谱已经很不容易了，如果在扫图时撕破实在可惜，所以扫图 要小心，将凝胶转移到扫描仪时可以用塑料隔片在下面托着，同时保持有些 水，这样就安全多了。 32. 凑个热闹说两句吧 1、 sds-page胶如果配好装好倒入内槽液以后，发现内槽液稍有渗漏，可以把外 槽液多加一些，加满，加到与内槽液相齐，这样就可以继续正常跑胶，不用浪 费已经加进去的内槽液 2、 至于染色脱色的问题，我们这里一直是染色：加热半分钟，摇20分钟；如 果染液不是新配的，就加热半分钟摇十分钟，凉透了再重复一次即可 脱色也一直是用去离子水煮两三次即可 3、 不知

25、道大家都是怎么做酶切的，我的体会是，酶切质粒时，两个酶分别单酶 切比直接双酶切效果要好很多。我有一次双酶切两次都没连出来，后来分步单 酶切，连接效率几乎100%。 可以第一个酶切完后直接把体系热失活，（根据酶说明书上一般是65度 20min）然后直接向里面补第二个酶 或者第一个切完后用氯仿抽提，把蛋白提出 或者中间做一次回收，这个就要考虑回收效率和损失的问题了，但是这样除蛋 白最彻底 前两个方法我们这都是有人做过的，已经都很好用了 33. 俺也来说说关于Bradford法蛋白浓度定量和DTNB法巯基浓度定量的一点 体会： 我是做蛋白修饰巯基后，通过这两种方法的定量来间接反应修饰的程

26、度。一路 摸索过来，也有半年有余；最大的体会就是不要急于求成，直接实验，首先检 测修饰体系是否对方法有影响，修饰基团是否会在595nm和412nm下有特定 的吸收，修饰后修饰试剂本身是否会有变化，对蛋白整体结构造成影响，其次 再谈具体修饰比例和程度。对于巯基浓度测定方法，有四种（Anal Biochem. 1998 Dec 1;265（1）:8-14）,而DTNB本身虽然灵敏度不高，但是重复性和抗干 扰是最佳的了。 34. 考马斯亮蓝染色后的脱色，如在脱色液中加数张捏成条状的Kimwipes纸 （国外实验室常用，相当我们的擦镜纸，全棉纤维制造），由于染料吸附到纸 纤维上，脱色加速。待纸着色

27、较深时，更换新纸条，不用换液。我想脱脂棉或 纱布也是一样的。但滤纸等可能不行，会溶掉。 半贴壁细胞如SP/0或杂交瘤细胞传代时，不用吹打或刮落。先将上清吸出，适 当拍打培养瓶（当然是塑料瓶，玻璃瓶拍碎了别找我），即可见贴壁细胞脱 落，加培养基混悬即可。注意，过力拍打培养瓶会裂，特别是瓶颈。 35. 一向电泳时，盐离子容易聚在 胶槽的两侧.剪一小段IPG胶条放在 两侧，构成盐桥，电压就容易上去了.避免一向电泳不好影响最后实验 结 果. 36. 我也推荐几条： 1、 关于20021108战友的说法，我觉得我们制备好了一批感受态，最好马上转 化一种已知质粒，与此同时，取一点感受态接种到含

28、抗性的固/液体培养基培养 来做对照。这样第二天即可以知道这批感受态是否还有外源质粒，又可以知道 这批感受态转化效率的高低。如果合格，那以后就可以放心使用！因为我也曾 经遇到其实是因为感受态不好而导致试验不成功，但是当时不知道，结果费时 费力。 2、 做克隆挑斑时，我们可以在将沾有菌体的牙签丢到试管前，在一块相应抗性 的平板上点一下，标注清楚，培养时间稍长一点，待长成较大菌落后收取。以 后需要哪一个菌，就在平板上挑取。这样既方便快捷，又可以保证菌的一致。 3、 抽提质粒时，加入Sloution II和III后要求轻柔混匀。我个人觉得不用这 样，只要不是非常剧烈，可以快速混匀。尤其可以运用在一

29、次抽提多管质粒的 时候，这样可以快速，而且效果一点也不差。 4、 抽提质粒时，用无水乙醇沉淀的时间可以由实验操作者来决定，如果时间充 裕可以30min，否则8-10min也可以。至于温度，个人觉得-20度好于常温。如 果加入可醋酸钠，会较容易形成盐类杂质，所以时间短一些更好！ 今天想到这些，先写到这里，以后想到了在上来与大家分享。希望我的小经验 对大家有所帮助！ 37. 首先声明：实验中的一些技巧要用在首先对基本的操作有深刻了解的基础 上，在力求省时、省力、节约成本等的同时，实验的准确性是最重要的。 对大多数做蛋白的战友们来说，培养细胞应该是不陌生的，我这里谈一个培养 细胞的小技巧，大

30、家知道，对于一定的空间（如某种尺寸的细胞培养瓶）来 说，细胞数目太多或者太少都不利于其生长，太多了就要消化，太少了要换一 个小点儿的培养瓶，我的做法是：如果细胞数目太少，可以不必去找小一点儿 的培养瓶，可把原来的培养瓶由原来的平放改为竖着放，这样底部的空间就小 了，有利于细胞的生长，当细胞数目增加到一定程度的时候还可以在平过来， 避免了来回换培养瓶而增加污染的机会（对没有小培养瓶的更实用）。 个人体会，仅供参考。 38. 说说关于SDS-PAGE的几个小经验 1、 做好胶后，把所有的加样孔都加上样，这样可以防止边缘的样品脱尾。 2、 高电压/高电流电泳时，可以把电泳槽放到4度冰箱中进行

31、电泳，省时省 力，1hr搞定。 3、 胶考染时间40min,放在凝胶摇床上（没有胶床可以放到28度普通摇床 上，但要控制好摇床速度）缓缓摇动，使染色均匀，同时可提高检测的灵敏 度，根据我的经验可以达到银染的级别，就是脱色时间比较长，一般需要脱色 2 —3d，夏天的时候要勤换脱色液，防止变臭哦 39. 质粒小提如果是用作鉴定或酶切，不必进行酚仿抽提，将溶液1.2.3离心后 的清液移入一个新的1.5ml离心管中，再次离心3-5分钟，小心取出上清液后， 直接沉淀，不必担心DNA切不开，我已经这样使用一年多，没出过什么问 题。当然这样的质粒不很干净，但是做鉴定足够了。尤其是实验室女同胞们， 可以减

32、少酚仿的侵害，而且节省时间。 资源来源于网上 本文弓 I用地址： SDS PAGE电泳常见问题分析 1. 配胶缓冲液系统对电泳的影响？ 在SDS—PAGE不连续电泳中，制胶缓冲液使用的是Tris—HCL缓冲系统，浓 缩胶是pH6.7，分离胶pH8.9；而电泳缓冲液使用的Tris —甘氨酸缓冲系统。在 浓缩胶中，其pH环境呈弱酸性，因此甘氨酸解离很少，其在电场的作用下， 泳动效率低；而CL离子却很高，两者之间形成导电性较低的区带，蛋白分子 就介于二者之间泳动。由于导电性与电场强度成反比，这一区带便形成了较高 的电压剃度，压着蛋白质分子聚集到一起，浓缩为一狭窄的区 带。当样品进入 分离胶

33、后，由于胶中pH的增加，呈碱性，甘氨酸大量解离，泳动速率增加， 直接紧随氯离子之后，同时由于分离胶孔径的缩小，在电场的作用下， 蛋白分 子根据其固有的带电性和分子大小进行分离。 所以，pH对整个反应体系的影响是至关重要的，实验中在排除其他因素之后仍 不能很好解决问题的情况，应首要考虑该因素。 2. 样品如何处理？ 根据样品分离目的不同，主要有三种处理方法：还原SDS处理、非还原SDS处 理、带有烷基化作用的还原SDS处理。 1） 还原SDS处理：在上样buffer中加入SDS和DTT （或Beta巯基乙醇）后， 蛋白质构象被解离，电荷被中和，形成 SDS 与蛋白相结合的 分子，在电泳中

34、， 只根据分子量来分离。一般电泳均按这种方式处理，样品稀释适当浓度，加入 上样Buffer，离心，沸水煮5min,再离心加样。 2） 带有烷基化作用的还原 SDS 处理：碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并经 久牢固的保护SH基团，得到较窄的谱带；另碘乙酸胺可捕集过量的DTT，而 防止银染时的纹理现象。100卩1样品缓冲液中10M 20%的碘乙酸胺，并在室温 保温 30min。 3） 非还原 SDS 处理：生理体液、血清、尿素等样品，一般只用 1%SDS 沸水中 煮3min,未加还原剂，因而蛋白折叠未被破坏，不可作为测定分子量来使用。 3. SDS-PAGE电泳凝胶中各主要成分的作用？ 聚

35、丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺与为蛋白质电泳提供载体，其凝固的好坏直接关 系到电泳成功与否，与促凝剂及环境密切相关； 制胶缓冲液：浓缩胶选择pH6.7，分离胶选择pH8.9，选择tris—HCL系统， TEMED与AP： AP提供自由基，TEMED是催化剂，催化自由基引起的聚合反 应进行； 十二烷基硫酸钠（SDS）:阳离子去污剂，作用有四：去蛋白质电荷、解离蛋 白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。 4. 提高SDS-PAGE电泳分辨率的途径？ 聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝胶的分辨率。建议做法：待凝胶在室温凝固 后，可在室温下放置一段时间使用。忌即配即用或 4度冰箱放置，

36、前者易导致 凝固不充分，后者可导致 SDS 结晶。一般凝胶可在室温下保存 4天， SDS 可水 解聚丙烯酰胺。 一般常用的有氨基黑、考马斯亮蓝、银染色三种染料，不同染料又各自不同的 染色方法，具体可参照郭尧君编著的《蛋白质电泳技术手册》P82-103。 5. “微笑”（两边翘起中间凹下）形带原因？ 主要是由于凝胶的中间部分凝固不均匀所致，多出现于较厚的凝胶中。 处理办法：待其充分凝固再作后续实验。 6. “皱眉”（两边向下中间鼓起）形带原因？ 主要出现在蛋白质垂直电泳槽中，一般是两板之间的底部间隙气泡未排除干 净。 处理办法：可在两板间加入适量缓冲液，以排除气泡。 7. 为什

37、么带出现拖尾现象？ 主要是样品融解效果不佳或分离胶浓度过大引起的。 处理办法：加样前离心；选择适当的样品缓冲液，加适量样品促溶剂；电泳缓 冲液时间过长，重新配制；降低凝胶浓度。 8. 为什么带出现纹理现象？ 主要是样品不溶性颗粒引起的。 处理办法：加样前离心；加适量样品促溶剂。 9. 什么是“鬼带”，如何处理？ “鬼带”就是在跑大分子构象复杂的蛋白质分子时，常会出现在泳道顶端（有时 在浓缩胶中）的一些大分子未知条带或加样孔底部有沉淀，主要由于还原剂在 加热的过程中被氧化而失去活性，致使原来被解离的蛋白质分子重新折叠结合 和亚基重新缔合，聚合成大分子，其分子量要比目标条带大，有时不

38、能进入分 离胶。但它却于目标条带有相同的免疫学活性，在WB反应中可见其能与目标 条带对应的抗体作用。 处理办法：在加热煮沸后，再添加适量的DTT或Beta巯基乙醇，以补充不足 的还原剂；或可加适量EDTA来阻止还原剂的氧化。 10. 为什么溴酚蓝不能起到指示作用？ 我们在实验中常会遇到溴酚蓝已跑出板底，但蛋白质却还未跑下来的现象。主 要与缓冲液和分离胶的浓度有关。 处理办法：更换正确pH值的Buffer；降低分离胶的浓度。 11. 为什么电泳的条带很粗？ 电泳中条带很粗是常见的事，主要是未浓缩好的原因。 处理办法：适当增加浓缩胶的长度；保证浓缩胶贮液的pH正确（6.7）；适当 降

39、低电压； 12. 为什么电泳电压很高而电流却很低呢？ 这种现象一般初学者易出现。比如电压50v以上，可电流却在5mA以下。主要 是由于电泳槽没有正确装配，电流未形成通路。包括：a.内外槽装反；b.外槽液 过少；c.电泳槽底部的绝缘体未去掉（比如倒胶用的橡胶皮）。 处理办法：电泳槽正确装配即可。 13. 浓缩胶与分离胶断裂、板间有气泡对电泳有影响吗？ 这主要出现在初学者中，一般对电泳不会有太大的影响。前者主要原因是拔梳 子用力不均匀或过猛所致；后者是由于在解除制胶的夹子后，板未压紧而致空 气进入引起的。 14. 凝胶时间不对，或慢或快，怎么回事？ 通常胶在30MIN-1H内凝。如果凝

40、的太慢，可能是TEMED, APS剂量不够或 者失效。 APS 应该现配现用， TEMED 不稳定，易被氧化成黄色。 如果凝的太 快，可能是 APS 和 TEMED 用量过多，此时胶太硬易裂，电泳时易烧胶。 15. 电泳时间比正常要长？ 可能由于凝胶缓冲系统和电级缓冲系统地 PH 选择错误，即缓冲系统地 PH 和被 分离物质的等电点差别太小，或缓冲系统的离子强度太高。 1 胶的凝结不好，例如有花纹特别是浓度高的胶在冬天温度较低的情况下，在 分离胶的下部有波浪样的花纹，凝胶不均匀。解决方法：加大 TEMED 和过硫 酸胺的量，使其凝结速度加快。同时洗干净玻璃板，防止有残留的胶干结在玻 璃板

41、上。 2 胶不凝，解决方法：温度较低时加大 TEMED 和过硫酸胺的量，过硫酸胺必 须新鲜配制。如若还是不行重新配制一下缓冲溶液。 3 胶易碎，例如浓度较高的胶在染色和脱色过程以及扫描过程中破裂。解决方 法：首先在上述过程中一定要动作轻缓，其次在室温较高的情况下可以适当减 少 TEMED 和过硫酸胺的量。 4 电泳完后胶上有很多长条纹的杂带，解决方法：建议电泳缓冲液不要回收利 用。配制胶的溶液一定要纯。 电泳中常出现的一些现象： 条带呈笑脸状，原因：凝胶不均匀冷却，中间冷却不好。 亠条带呈皱眉状，可能是由于装置不合适，特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有 气泡，或者两边聚合不完全。 拖尾

42、：样品溶解不好。 纹理（纵向条纹）：样品中含有不溶性颗粒。 条带偏斜：电极不平衡或者加样位置偏斜。 条带两边扩散：加样量过多。 聚丙烯酰胺凝胶电泳结果不正常现象和对策 1. 指示剂前沿呈现两边向上或向下的现象.向上的"微笑"现象说明凝胶的不均匀 冷却,中间部分冷却不好,所以导致凝胶中分子有不同的迁移率所致.这种情况在 用 较厚的凝胶以及垂直电泳中时常发生.向下的"皱眉"现象常常是由于垂直电泳 时电泳槽的装置不合适引起的,特别是当凝胶和玻璃板组成的"三明治"底部有气 泡 或靠近隔片的凝胶聚合不完全便会产生这种现象. 2. "拖尾"现象是电泳中最常见的现象.这常常是由于样品溶解不佳引起的,克

43、服的 办法是在加样前离心,选用合适的样品缓冲液和凝胶缓冲液,加增溶辅助试剂.另 一方法是降低凝胶浓度. 3. "纹理"现象常常是由于样品中不溶颗粒引起的,克服办法是增加溶解度和离心 除去不溶性颗粒. 4. 蛋白带偏斜常常是由于滤纸条或电极放置不平行所引起的,或由于加样位置偏 斜而引起. 5. 蛋白带过宽,与邻近蛋白泳道的蛋白带相连,这是由于加样量太多或加样孔泄漏 引起的. 6. 蛋白带模糊不清和分辨不佳是由于多种原因引起的.虽然梯度凝胶可以提高分 辨率,但与其他方法相比,常规聚丙烯酰胺凝胶电泳是分辨率较低的方法.为了提 高分 辨率,不要加过多的样品,小体积样品可给出窄带.加样后应立即电泳,以防止 扩散.选择合适的凝胶浓度,使组分得以充分的分离.通常靠近前沿的蛋白带分辨 率 不佳,所以应根据分子量与凝胶孔径的关系,灌制足够长度的凝胶,以使样品不 会走出前沿.样品的蛋白水解作用也引起扩散而使分辨率降低.水解作用通常发生 在 样品准备的时候 ,系统中的内源性蛋白酶会水解样品蛋白 ,如果在缓冲液中加 蛋白酶抑制剂可以减少这种情况的发生.