crispr原理解析

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1、CRISPR CRISPR：是细菌和古细菌在长期演化过程中 形成的一种适应性免疫防御，可用来对抗 入侵的病毒及外源 DNA，实际上就是一种基 因编辑器，可以用来删除、添加、激活或 抑制其他生物体的目标基因。 系统分类： 类需要多种 CRISPR相关蛋 白（ Cas蛋白）共同发挥作用， 类只需要 一种 Cas蛋白，（ CRISPR/Cas9系统最为广泛） CRISPR簇是一个广泛存在于细菌和古生菌基因 组中的特殊 DNA重复序列家族，其序列由一个 前导区 (Leader)、多个短而高度保守的重复序 列区 (Repeat)和多个间隔区 (Spacer)组成。 Leader一般位于 CRISPR簇上

2、游，是富含 AT长度 为 300 500bp的区域，被认为可能是 CRISPR簇 的启动子序列。 Repeat长度为 21 48bp，含有回文序列，可形 成发卡结构。重复序列之间被长度为 26 72bp 的间隔区隔开。 Spacer区域由俘获的外源 DNA组成，类似免疫 记忆，当含有同样序列的外源 DNA入侵时，可 被细菌机体识别，并进行剪切使之表达沉默，达到保护自身安全的目的。 crRNA：当细菌抵御噬菌体等外源 DNA （ protospacers ）入侵时，在前导区的调控下， CRISPR被转录为长的 RNA前体 (pre-crRNA)，然后加 工成一系列短的含有保守重复序列和间隔区的成

3、 熟 crRNA， pre-crRNA转录的同时，与其重复序列 互补的反式激活 crRNA (Trans-activating crRNA， tracrRNA)也转录出来。 sgRNA： CRISPR基因敲除敲入系统中重要的组成部 分，早先发现的 guide RNA，由 tracrRNA和 crRNA两 部分组成 , 两部分融合表达后，即 sgRNA也能很好 的行使 guide的功能，与 cas9蛋白结合，引导 cas9 酶靶向基因组 DNA进行剪切。 Cas： CRISPR簇的侧翼序列分析发现，在其附近存 在一个多态性家族基因。该家族编码的蛋白质均 含有可与核酸发生作用的功能域 (具有核酸酶

4、、解 旋酶、整合酶和聚合酶等活性 )，并且与 CRISPR区 域共同发挥作用，因此被命名为 CRISPR关联基因 (CRISPR associated)，缩写为 Cas。 PAM： （ protospacer adjacent motif ） protospacers 选择自入侵 DNA旁出现 PAM的区域， 剪切位点位于 crRNA互补序列下游邻近的 PAM区。 工作原理： crRNA( CRISPR-derived RNA )通 过碱基配对与 tracrRNA (trans-activating RNA )结合形成 tracrRNA/crRNA 复合物，此 复合物引导核酸酶 Cas9 蛋白

5、在与 crRNA 配 对的序列靶位点剪切双链 DNA。而通过人 工设计这两种 RNA，可以改造形成具有引 导作用的 sgRNA (short guide RNA )，引导 Cas9 对 DNA 的定点切割。 第一阶段：外来 DNA采集 宿主通过 Cas蛋白来识别外源核苷酸， 使入侵细菌的短片段 DNA作为间隔区序列插 入到宿主的 CRISPR位点。 第二阶段： CRISPR RNA的生物合成 CRISPR RNA的生物合成从转录开始，接 下来是初级转录产物 pre-crRNA加工生成一 类短的 CRISPR衍生 RNAs（ crRNAs），每一个 都包含与之前遇到的外源 DNA（ Spacer

6、序列） 对应的互补序列。 pre-crRNA转录的同时， 与其重复序列互补的反式激活 crRNA (Trans- activating crRNA， tracrRNA)也转录出来，这 两个 RNAs可以融合成一个 sgRNA。 第三阶段：靶向干扰 crRNA、 tracrRNA和 Cas9组成复合体， 识别并结合于 crRNA互补的序列，然后解开 DNA双链，形成 R-loop，使 crRNA与互补链 杂交，另一条链保持游离的单链状态，然 后由 Cas9中的 HNH活性位点剪切 crRNA的互 补 DNA链， RuvC活性位点剪切非互补链，最 终引入 DNA双链断裂 (DSB)。 数据： ge

7、nome-scale CRISPR-Cas9 knockout (GeCKO) library targeting 18,080 genes with 64,751 unique guide sequences. The GeCKO v2 libraries consist of over 100,000 unique gRNAs for gene knock-out in either the human or mouse genome. http:/genome-engineering.org/gecko/?page_id=114 敲除 AIP1基因的 CRISPR/Cas9慢病毒系统 ,

8、成 功获得 AIP1敲除的人 (胚肾细胞株 )293T稳定 细胞株（广州医科大学） 在一个黑素瘤模型中，筛选出了涉及药物 维罗非尼（ Vemurafenib）耐药性的基因 （麻省理工学院 张峰） CRISPR/Cas9的靶向特异性是由两部分决定的， 一部分是 RNA嵌合体和靶 DNA之间的碱基配对，另一 部分是 Cas9蛋白和一个短 DNA基序（ DNA motif）的结 合，这个短 DNA基序通常在靶 DNA的 3末端发现，被 称为前间区序列邻近基序（ protospacer adjacent motif， PAM） Natronobacterium gregoryi Argonaute （

9、 NgAgo）是一种 DNA导向的可用于人类细胞基因编辑 的核酸内切酶，与 Cas9不同， NgAgo gDNA系统不需 要 PAM，初步鉴定表明，该系统对导向 -靶向 （ guide target）错配耐受低，且对编辑富含 G+C的 基因组更加有效。据介绍， Cas9只存在于原核生物中， 而 Argonautes几乎存在于所有的有机体中。要想与 Cas9正确绑定，导向 RNA必须有 3RNA -RNA杂化结构， 而与 Argonaute绑定不需要导向分子有任何特定的二 级结构。另一方面， Cas9只能切割 PAM上游的序列， 而 Argonaute不需要靶标有特定的序列。 NgAgo有望 成为编辑哺乳动物基因组的精准有效的工具。