重亚硫酸盐测序操作方案

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1、重亚硫酸盐测序操作方案 一、样品收集 1、配制2%低熔点琼脂糖 称取0・02 g低熔点琼脂糖，倒入1.5 mL离心管中，随后加入1 mL mPBS溶液，置于100°C 金属浴中反复加热并颠倒混匀至完全溶解，取出4弋保存待用。 2、收集细胞样品 80C以上热水浴使低熔点琼脂糖溶化。向1.5 mL离心管底部加入8 U低熔点琼脂糖，避免产 生气泡。迅速吸取细胞样品吹入琼脂糖中，冷却后加入500 pL矿物质油覆盖。最后将离心管在 热水浴中短暂浸泡使琼脂糖小球成型，取出-20弋保存待用。 二、亚硫酸氢盐修饰 3配制DNA细胞裂解液：向20 mL TE缓冲液中加入100 pL的20 mg/m

2、l蛋白酶K 4向含样品的离心管内加入500 pL DNA细胞裂解液,50弋金属浴8 h以上，以消化样品。 5、在上一步消化进行的同时配制转化液，注意避光 亚硫酸氢钠 4.75 g 双蒸水 4.5 mL 2M NaOH 3.5 mL 对苯二酚 0.138 g 共计 10 mL 6、消化完成后，将离心管取出，换液清洗使小球变性： 0・3M NaOH , 500 pL , 15 min ,2 次；0・1M NaOH , 1 mL , 5 min , 1 次。 7、换液加入500 pL转化液,50弋金属浴8 h以上，以转化样品，注意避光。 &用TE缓冲液中止转化，1

3、mL , 15 min, 6次。 9、用 0・2M NaOH 脱磺化，500 pL , 15 min , 2 次。 10、 用TE缓冲液中止脱磺化，1 mL, 15 min , 3次。 11、 用双蒸水清洗，1 mL , 10 min , 2次。 12、 清洗完成，用枪头吸取琼脂糖小球转移至200 pL离心管中，-20C保存待用。 甲基化基因的PCR 步骤 预变性 变性 退火 延伸 终延伸 降温 温度 94C 94C 55~65C 72C 72C 4C 时间 2 min 30 s 30 s 30 s 2 min 8 第一轮反应体系25

4、U，转化后琼脂糖小球计为2 M DNA。第二轮反应体系扩大为50山。 试剂 25 pL反应体系 50 pL反应体系 2xTaq MasterMix 12.5 25 RNase-Free Water 8.5 19 Forward Primer , 10pM 1 2 Reverse Primer, 10pM 1 2 Template DNA 2 2 14、将第二轮反应产物全量加入胶孔中，跑胶时尽量跑完全程以分离杂带。在紫外灯下找到目的条带， 快速精确切取，将胶块放入1.5 mL离心管内。 、胶回收 15、对胶块称重，向离心管内加入3倍胶体积（0.1 g

5、 = 100 pL ）QG Buffer, 50C金属浴至胶融化， 同批样品可统一为450 U，以便于离心。 加入1倍胶体积（150 U）异丙醇，颠倒混匀后将液体移入离心柱离心，13000 g , 1 min。 16、 17、 倒掉收集管内液体，向离心柱内加入500 pL QG Buffer，再次离心，13000 g , 1 min。 18、 倒掉收集管内液体，加入750 pL PE Buffer，静置2 min，再次离心，13000 g , 1 min。 19、 更换收集管再次离心，13000 g,1 min,倒置离心柱在滤纸上晾干2 min，再插入新收集管。 20、 将

6、25 pL EB Buffer精确加至离心柱中心内膜，静置3 min后离心，18000 g , 10 min。 21、 取少量收集管内DNA溶液检测样品浓度（分光光度计或跑胶检测），余下-20°C保存待用。 量分光光度计：测定DNA浓度并记录，连接T载体时稀释各组至合适的统• 浓度。 胶：取5 pL DNA样品与1 pL 6x loading buffer混合，点样跑胶检测目的条带，依据目的 条带亮度决定连接T载体时的DNA上样量。（亮1 pL;中等2 pL ;弱3 pL） 五、克隆测序 22、预先制冰，将pMD 18-T Vector Cloning Kit冰上解冻，依次向2

7、00 pL离心管内添加: 高DNA浓度 中DNA浓度 低DNA浓度 T载体 1 pL 1 pL 1 pL DNA样品 1 M 2 pL 3 pL 双蒸水 3 pL 2 pL 1 pL 共计 5 pL 混匀后，加入5 pL Solution I ;再次混匀，放入PCR仪中16°C连接8h。 23、在上一

8、步连接进行的同时，配制LB/AMP培养基 (2 )配制LB (1)配制LB液体培养基(200 mL ) 1% (w/v) Tryptone 2 g 0.5% (w/v) Yeast Extract 1 g 1% (w/v) NaCl 2 g 定容后，加入200 pL 2M NaOH将pH值调至7.0 ,混匀后移入玻璃瓶内。 固 体培养基(200 mL) 再配制200 mL LB液体培养基，随后倒入含3 g琼脂粉的烧杯中， 3)将两种培养基与玻璃棒、涂板小杆等一同高压灭菌。 (5)摇匀LB (4 )高压后冷却至40~50C时，向200 mL LB固体培养基内加入

9、200 pL 100 mg/mLAmpicillin, 向 150 mL LB液体培养基内加入 150 pL 100 mg/mLAmpicillin 剩余 50 mL不加 Ampicillin。 体培养基，取90 mm培养皿分装，每盘内倒入约20 mL。 (6 )待培养基凝固后，进行涂板。每板加入50 pL 20 mg/mL X-Gal与20 pL 50 mg/mL IPTG , 混合后涂抹均匀，避光晾干备用。 24、转化感受肽 受态细胞的1.5 mL离心管内。 (1)连接完成后，将10 pL样品全量加入含100 pL DH5a (2 )轻轻混匀后冰上放置30 min, 42弋金属

10、浴激发90 s ,冰上冷却2 min ,操作时避免剧烈晃动。 (3)加入900 pL 不含 Ampicillin的LB液体培养基，放入摇床，37C,150 g,培养1 h以上。 25、养菌 待摇床上离心管内菌液长好(充满液体),取 100 pL 菌液滴入凝固的培养基并涂抹均匀。将涂 板倒■在摇床内，37弋，避光，保湿，避风，培养12 h以上，待菌斑长至直径1 mm左右。此 时培养基上白斑可用,蓝斑淘汰。可将培养基直接封口,送样测序,也可进一步挑菌培养。 用枪头挑取单个阳性克隆菌落混入加有1 mL含Ampicillin的LB液体培养基的1.5 mL离心管 中（如果不好直接挑起，可用枪头沾取菌落后混入离心管，注意不要沾上杂质）。将离心管放入摇 床，37弋，150 g，避光培养3 h以上,待菌液长好后可取出，送样测序。 药品 公司 1=1 货号 规格 低熔点琼脂糖 矿物质油 TE缓冲液 蛋白酶K 亚硫酸氢钠 NaOH 对苯二酚