生物样品前处理方法

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1、生 物 样 品 前 处 理 方 法 生物样品处理目的前处理过程及方法分析方法的限度要求生物样品的种类 血样根据药物具体性质选择血清（serum) 全血（whole blood）血浆（plasma)置含有抗凝剂的试管中，25003000rpm离心510min，淡黄色上清液，约为全血的50-60% 药物动力学，生物利用度，临床治疗药物浓度监测 置试管中，于37或室温放置30min1h，血液 凝固后，剥去试管壁上的血饼，25003000rpm离心510min，淡黄色液体，约为全血20-40% 血清的获取量小，但血清成分更接近于组织液的化学成分，测定血清中有关物质的含量，比全血更能反映机体的具体情况

2、加入抗凝剂混合，防止凝血后影响测定 对于与红细胞结合的药物，以及血浆浓度低或药物在血浆与红细胞分配比不恒定的情况下应用一 . 生 物 样 品 的 种 类 唾液（saliva）尿液(urine)一般采集时间尿（规定时间内采集尿液体积和排入尿中的药物总量）药物浓度高，但变化 体内药物清除 以原形、I相及II相代谢物等多种形式通过尿液排出排出 预测药物代谢过程、类型,计算药物尿清除率、生物利用度的研究。 在漱口后15min，安静状态下采集口腔内自然流出的唾液；也可在刺激下快速采样，石蜡片，聚四氟乙烯块，纱布球，柠檬酸，维生素C等置于舌尖，弃取初始部分后采集 血浆游离药物浓度（P）密切相关，可使用唾液

3、样品CS/CP比值较恒定时，可代替血样进行TDM及药代动力学研究 头发组织：脑、心、肝、脾、肺、肾、胃等 去 除 生 物 样 品 中 的 大 分 子 杂 质 ，满 足 测 定 方 法 对 分 析 样 品 的 要 求保 护 仪 器 性 能 ， 改 善 分 析 条 件分 离 并 富 集 所 要 测 定 的 成 分 药 物 从 缀 合 物 及 结 合 物 中 释 放 测 定 药 物 的 总 浓 度 二 .生 物 样 品 处 理 的 目 的 蛋白质 蛋 白 质 蛋 白 质蛋 白 质 内源性酸内 源性 酸 内 源性 酸 药 药药药 药2.缀合物水解3.提取、富集1.去除蛋白质3.衍生化4.衍生化 加入强

4、酸 超滤法加入中性盐 加热法酶水解法 溶剂解法加入重金属盐 三.前处理过程及方法 1.1-溶 剂 解 法原 理 ： 使 蛋 白 质 的 分 子 内 及 分 子 间 的 氢 键 发 生 变 化 而 使 蛋 白 质 凝 聚 。 常 用 有 机 溶 剂 ： 乙 腈 、 甲 醇 、 丙 酮 、 四 氢 呋 喃 试 剂 用 量 ： 溶 剂 体 积 与 血 样 比 为 1 3 1操 作 ： 有 机 溶 剂 与 血 浆 或 血 清 按 一 定 比 例 混 合 后 离 心 分 离 ， 取 上 清 液 作 为 样 品 。 注 意 采 用 超 速 离 心 （ 12000rpm） 分 离 1 2min 1.2 加

5、入 中 性 盐原 理 ： 中 性 盐 使 蛋 白 质 脱 水 而 沉 淀 常 用 中 性 盐 ： 饱 和 硫 酸 铵 、 硫 酸 钠 、 镁 盐 、 磷 酸盐 及 枸 橼 酸 盐 等 试 剂 用 量 ： 饱 和 硫 酸 铵 与 血 清 比 例 为 2 1 操 作 ： 血 清 与 中 性 盐 按 一 定 比 例 混 合 后 超 速 离 心 （ 10000rpm） 分 离 1 2min， 取 上 清 液 作 为 样 品。 上 清 液 pH 7.0 7.7。 1.3 加 入 强 酸原 理 ： 强 酸 与 蛋 白 质 形 成 不 溶 性 盐 而 沉 淀 。 常 用 ： 10 三 氯 醋 酸 、 6 高

6、 氯 酸 、 5 偏 磷 酸 等 。 操 作 ： 血 清 与 强 酸 的 比 例 为 1： 0.6混 合 ， 离 心 （ 10000rpm） 1 2min， 即 可 。 上 清 液 pH 0 4， 不 适 于 酸 性 下 分解 的 药 物 。过 量 酸 的 排 除 ： 过 量 三 氯 醋 酸 可 通 过 煮 沸 或 乙 醚 提 取 除去 ； 高 氯 酸 、 偏 磷 酸 等 可 用 碳 酸 钾 、 醋 酸 钾 或 氢 氧 化钠 等 中 和 后 加 乙 醇 使 产 生 高 氯 酸 钾 （ 钠 ） 沉 淀 被 除 去。 1.4 酶 水 解 法测 定 一 些 酸 不 稳 定 及 蛋 白 结 合 牢 的

7、 药 物枯 草 菌 溶 素 ： 使 组 织 溶 解 ， 使 药 物 析 出 。 一 种 细 菌 性 碱 性 蛋 白 分 解 酶 ， 可 在 较 宽 的 pH活 圈（ PH7.0 11.0） 内 使 蛋 白 质 的 肽 键 降 解 ， 在 50 60具 有 最 大 活 力 。 优 点 ： 可 避 兔 某 些 药 物 在 酸 及 高 温 下 降 解 ， 对 与 蛋 白 质结 合 牢 的 药 物 （ 如 保 泰 松 、 苯 妥 英 纳 ） ， 可 显 著 改 善回 收 率 ； 可 用 有 机 溶 剂 直 接 提 取 酶 解 液 而 无 乳 化 现 象。不 适 用 于 在 碱 性 下 易 水 解 的

8、药 物 。 1.5 超 滤 法性 质 ： 以 多 孔 性 半 透 膜 （ 超 滤 膜 ） 作 为 分离 介 质 的 一 种 膜 分 离 技 术 。 特 点 ： 无 需 加 热 ； 无 需 添 加 化 学 试 剂 ； 无相 变 化 ； 无 破 坏 性 ； 样 品 量 少 ； 简 便 快 捷， 结 果 稳 定 可 靠 应 用 ： 游 离 药 物 首 选 方 法 ， 尤 其 适 合 TDM 操 作 ： 分 子 量 截 留 值 在 5万 左 右 的 超 滤 膜过 滤 可 将 分 子 量 大 的 血 浆 蛋 白 以 及 结 合 了药 物 的 血 浆 蛋 白 分 离 。 尿中和有些血中的药物葡 萄糖 醛酸

9、 硫酸2、 缀 合 物 的 水 解由 于 缀 合 物 较 原 型 药 物 具 有 较 大 的 极 性 ， 不 易 被 有 机 溶 剂提 取 ， 所 以 ： 酸 水 解 可 加 入 适 量 的 盐 酸 液 。 酶 水 解 对 于 遇 酸 及 受 热 不 稳 定 的 药 物 ， 常 用 葡 萄 糖 醛 酸 苷 酶 、 硫 酸 酯 酶 或 两 者 的 混 合 酶 3.分 离 、 纯 化 和 浓 集3-1. 液 -液 萃 取 法 LLE 乳 化 现 象 ： 加 固 体 NaCl； 离 心 ； 低 温 冰 箱 中 快 速 冻 凝 对 于 极 性 大 的 药 物 ： 离 子 对 提 取 法 ； 提 取 烷

10、 基 化 法有机溶剂 (1、2)生物样品（水溶）(1)药物 内源性杂质溶解度、沸点低、无毒、与水不溶：乙酸乙酯、乙醚（1.2%水）碱性药物于碱性；酸性药物于酸性。 酸性；水溶性碱性；亲脂性的 3-2. 固 相 萃 取 法 SPE原 理 ： 不 同 填 料 作 固 定 相 的 微 型 小 柱 ， 当 含 有 药 物 的 生 物 样品 溶 液 通 过 时 ， 由 于 受 到 吸 附 、 分 配 、 离 子 交 换 或 其 它 亲 和力 作 用 ， 药 物 或 杂 质 被 保 留 在 固 定 相 上 ， 用 适 当 溶 剂 清 洗 杂质 后 ， 再 用 适 当 溶 剂 洗 脱 药 物 。 亲 脂 型

11、 大 孔 吸 附 树 脂 ， 亲 脂 型 键 和 硅 胶规 格 亲 水 型 硅 胶 ， 硅 藻 土 ， 棉 纤 维 离 子 交 换 型 3-2. 固 相 萃 取 法 SPE 泵甲醇 柱 预 处 理 进 样 净 化 洗 脱水 样品 弱 溶剂 强 溶剂固 相 提 取 步 骤 示 意 图 ： 被 测 组 分 的 浓 集 真 空 蒸 发 或 抽 真 空 挥 发 直 接 通 入 气 流 使 溶 剂 挥 发抽真 空 氮 气 或 空 气 分子中含有活泼氢者极性大检测器不够灵敏挥发性低对热不稳定 增加药物稳定性改变药物的极性和挥发性，改善被测组分的色谱行为提高对光学异构体分离的能力 化 学 衍 生 化4.化

12、学 衍 生 化G C 衍 生 化 反 应 类 型 ： 烷 基 化 ； 酰 化 ； 硅 烷 化 活 泼 氢 被 烷 基 、 酰 基 、 硅 烷 基 取 代 光 谱GC、 HPLC色谱 分 析 HPLC-化 学 衍 生 化 方 法 柱前衍生法柱后衍生法荧光衍生化反应电化学衍生化反应 非手性衍生化反应HPLC-化学衍生化 发生衍生化反应前后反应特征 点击添加标题紫外衍生化反应 先 进 的 处 理 技 术 1. 固 相 微 萃 取 SPME基 于 待 测 物 质 在 样品 和 萃 取 涂 层 中 的平 衡 分 配 的 过 程 。相 似 相 溶 原 理材 料 ：聚 二 甲 基 硅 氧 烷聚 丙 烯 酸

13、酯 SPME 与 GC 及 HPLC联 用 2. 柱 切 换 技 术 是 一 种 在 线 的 固 相 分 离 技 术切 换 阀 3. 微 透 析 技 术MD是 一 种 膜 分 离 技 术 ， 利 用 膜 透 析 原理 ， 对 细 胞 液 进 行 流 动 性 连 续 采 样 ，在 不 破 坏 生 物 体 内 环 境 的 情 况 下 ， 直接 插 到 生 物 活 体 内 采 样 进 行 原 位 测 定 将 微 透 析 探 针 植 于 需 要 取 样 的 部 位， 用 与 细 胞 间 液 非 常 接 近 的 生 理 溶 液以 慢 速 度 灌 注 ， 由 于 膜 内 外 欲 测 组 分的 浓 度 差 而 使 得 膜 外 的 体 内 欲 测 组 分进 入 膜 内 ， 并 被 灌 注 液 带 到 体 外 ， 进入 仪 器 进 行 分 析 。 生 物 样 品 定 量 分 析 方 法 限 度 要 求 生 物 样 品 定 量 分 析 方 法 限 度 要 求 感谢大家捧场