蜡样芽胞杆菌的检验

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1、蜡 样 芽 胞 杆 菌 (Bacillus cereus)的 检 验 （一）蜡样芽胞杆菌生物学性状 1、 形 态 和 染 色 特 性 该 菌 为 革 兰 氏 阳 性 的 大 杆 菌 ， 菌 体 两 端 较 平 整 ， 芽胞 呈 椭 圆 形 ， 位 于 菌 体 中 央 稍 偏 一 端 ,多 呈 链 状 排 列 ,无 荚 膜 ， 有 周 鞭 毛 2、 培 养 特 性 （ 1） 需 氧 菌 ， 生 长 温 度 范 围 在 10-45 之 间 。 最 适 生 长 温 度 为 28-35 。 （ 2） 在 普 通 培 养 基 上 生 长 良 好 。本 菌 在 普 通 琼 脂 平 板 上 ， 生 长的 菌

2、 落 呈 乳 白 色 ， 不 透 明 ， 直径 4-6mm,边 缘 不 整 齐 ， 表 面 粗糙 ， 呈 毛 玻 璃 状 或 白 蜡 状 。 （ 3） 在 血 液 琼 脂 平 板 上 形 成浅 灰 色 、 不 透 明 、 似 毛 玻 璃状 的 菌 落 。 菌 落 周 围 初 呈 草绿 色 溶 血 ,时 间 稍 长 即 完 全 透明 。（ 4） 蜡 状 芽 胞 杆 菌 在 甘 露 醇卵 黄 多 粘 菌 素 琼 脂 (MYP) 上 的 菌 落 为 粉 红 色 (表 示 不 发酵 甘 露 醇 )， 周 围 有 粉 红 色 的晕 （ 表 示 产 生 卵 磷 脂 酶 ） 。 （ 5） 在 普 通 肉 汤

3、 内 生 长 迅 速 ， 肉 汤 混 浊 ， 常 常 有 菌 膜 或 壁环 ， 振 摇 易 乳 化 。 3、 生 化 性 状 ：（ 1） 葡 萄 糖 发 酵 试 验 ： 接 种 于 酚 红 葡 萄 糖 肉 汤 中 ， 厌 氧 条 件 下 35 培 养 24h。 培 养 基 应 由 红 色 变 为 黄 色 。（ 2） 硝 酸 盐 还 原 试 验 ： 阳 性 （ 红 色 ） 。 （ 表 明 本 菌 在 厌 氧 条 件 下 分 解 葡 萄 糖 产 酸 ）（ 3） V-P试 验 ： 接 种 于 改 良 V-P培 养 基 中 ， 35 培 养 48 h。 加 V-P试 剂 及 肌 酸 数 粒 ， 静 止

4、 1h， 应 为 阳 性 反 应 （ 伊 红 色 ） 。 （ 4） L-酪 氨 酸 分 解 试 验 ： 接 种 于 L-酪 氨 酸 琼 脂 培 养 基 上 ， 35 培 养 48 h,阳 性 反 应 菌 落 周 围 培 养 基 应 出 现 澄 清 透 明 区 （ 表 示 产 生 酪 蛋 白 酶 ） 。 阴 性 时 应 继 续 培 养 72 h再 观 察 。（ 5） 溶 菌 酶 试 验 ： 用 直 径 2mm接 种 环 取 纯 菌 悬 液 一 环 ,接 种 于 溶 菌 酶 肉 汤 中 ， 35 培 养 24h。 该 菌 在 本 培 养 基 （ 含 0.001 的 溶 菌 酶 ） 中 能 生 长

5、。 如 出 现 阴 性 反 应 ,应 继 续 培 养 24 h。 4、 致 病 性 蜡 样 芽 胞 杆 菌 引 起 食 物 中 毒 ， 除 必 须 具 有 大 量 的 细 菌外 ， 肠 毒 素 也 是 重 要 的 致 病 因 素 。 耐 热 性 肠 毒 素 ： 100 30分 钟 不 能 被 破 坏 ， 为 引 起 呕 吐 型 中 毒 的 致 病 因 素 ,常 在 米 饭 中 形 成 。 不 耐 热 肠 毒 素 ： 是 引 起 腹 泻 型 胃 肠 炎 的 病 因 ， 能 在 各 种 食 物 中 形 成 。 5、 抵 抗 力 蜡 样 芽 胞 杆 菌 100 20分 钟 即 可 被 杀 死 ； 对

6、 酸碱 不 敏 感 ， pH6-11对 本 菌 基 本 上 不 受 影 响 ， pH5以下 ， 生 长 可 受 到 抑 制 。 （二）流行病学特点 1、 季 节 性 特 点 ： 以 夏 、 秋 季 ， 尤 其 是 6 10月 为 多 见 。2、 食 品 种 类 剩 饭 ， 特 别 是 大 米 饭 。 乳 及 乳 制 品 、 畜 禽 肉 类 制 品 、 蔬 菜 、 莱 汤 、 马 铃 薯 、豆 芽 、 甜 点 心 、 调 味 汁 、 色 拉 。 国 内 ： 与 淀 粉 质 食 品 相 关 多 。 3、 临 床 症 状 呕 吐 型 中 毒 ： 多 见 于 过 剩 米 饭 和 油 炒 饭 ， 由 耐

7、 热 性肠 毒 素 为 致 病 因 素 ； 潜 伏 期 短 ， 一 般 为 2 3小 时 ， 最 短为 30分 钟 ， 最 长 5 6小 时 ； 症 状 以 呕 吐 ， 腹 痉 挛 为 主 ，腹 泻 则 少 见 ， 一 般 经 过 8 10小 时 而 治 愈 。 腹 泻 型 中 毒 ： 由 各 种 食 品 中 不 耐 热 肠 毒 素 引 起 ， 潜伏 期 在 6小 时 以 上 ， 一 般 为 6 14小 时 ； 症 状 以 腹 泻 ， 腹痉 挛 ， 而 呕 吐 却 不 常 见 ； 病 程 24 36小 时 。 1.蜡 样 芽 孢 杆 菌 检 验 程 序 ：检样25g(ml)+225ml生理盐水

8、中 华 人 民 共 和 国 国 家标 准 食 品 卫 生 微 生 物学 检 验 蜡 样 芽 孢 杆 菌检 验 GB/T 4789.28-2003做成10-1-10-5的稀释液选择性培养基（菌数测定）MYP选择性培养基（分离培养）MYP37，18h-24h菌数计算营养琼脂培养基36 1 12h20h 36 1 12h20h生长及菌落观察染色镜检生化试验菌株保存 报 告 （三）检测方法 10-110-5的稀释液的制备 每个稀释度0.1mL接种于2个MYP培养基361 1220h 菌落计数361 1220h 挑取菌落接种肉汤和营养琼脂培养基（分离培养）证实试验 报 告 形态观察染色镜检培养特性 生化

9、特性 生化分型 2 菌 数 测 定 以 无 菌 操 作 将 检 样 25g或 25 ml按 菌 落 总 数 测 定 方 式 ， 用灭 菌 生 理 盐 水 或 磷 酸 盐 缓 冲 液 做 成 10-1 10-5的 稀 释 液 。取 各 稀 释 液 0.1ml， 接 种 在 选 择 培 养 基 （ 甘 露 醇 卵 黄 多黏 菌 素 琼 脂 ） 平 板 上 ， 用 L形 棒 涂 布 于 整 个 表 面 ， 置37 培 养 12 20h后 ， 选 取 菌 落 数 在 30个 左 右 者 进 行 计数 。 蜡 样 芽 孢 杆 菌 在 此 培 养 基 上 生 成 的 菌 落 为 红 色 （ 表示 不 发

10、酵 甘 露 醇 ） ,环 绕 有 白 色 至 淡 粉 红 色 的 晕 （ 表 示产 生 卵 磷 脂 酶 ） 。 计 数 后 ， 从 中 挑 取 5个 这 样 的 菌 落 作 证 实 试 验 。 根据 试 验 证 实 为 蜡 样 芽 孢 杆 菌 的 菌 落 数 ， 计 算 出 该培 养 皿 内 的 蜡 样 芽 孢 杆 菌 数 ， 然 后 乘 其 稀 释 倍 数即 得 每 克 或 每 毫 升 样 品 所 含 的 蜡 样 芽 孢 杆 菌 数 。 计 数 后 ， 从 中 挑 取 5个 此 种 菌 落 做 证 实 试 验 ， 根 据 证 实的 蜡 样 芽 孢 杆 菌 的 菌 落 数 ， 计 算 出 该

11、平 板 上 的 菌 落 数 ， 然后 乘 其 稀 释 倍 数 ， 即 得 每 克 （ 毫 升 ） 样 品 中 所 含 蜡 样 芽 胞杆 菌 数 。 例 如 将 0.1mL 10-4样 品 稀 释 液 涂 布 于 MYP平 板 上 ， 其 可 疑菌 落 为 25个 ， 取 5个 鉴 定 ， 证 实 四 个 菌 落 为 蜡 样 芽 孢 杆 菌 ，则 1g（ mL） 检 样 中 所 含 蜡 样 芽 孢 杆 菌 数 为 ： 选 取 具 有 15-150个 典 型 或 可 疑 蜡 样 芽 孢 杆 菌 菌 落 的 平 板 ,进 行 计 数 。 计 算 同 一 稀 释 度 两 个 平 板 的 平 均 菌 落

12、 数 。25 4/5 104 10 2 106 3 分 离 培 养 将 检 样 或 其 稀 释 液 划 线 于 上 述 选 择 性 培 养 基 平 板 上 ，置 37 培 养 12 20h， 挑 取 可 疑 蜡 样 芽 孢 杆 菌 的 菌落 接 种 于 肉 汤 和 营 养 琼 脂 培 养 基 上 做 纯 培 养 ， 然 后做 证 实 试 验 。 4 证 实 试 验（ 1） 形 态 观 察 本 菌 应 为 G 杆 菌 ， 宽 度 在 1 m或 1 m以 上 ， 芽 孢 呈 卵圆 形 ， 不 突 出 菌 体 ， 多 位 于 菌 体 中 央 或 稍 偏 于 一 端 。（ 2） 培 养 特 性 本 菌

13、 在 肉 汤 中 生 长 混 浊 ， 常 有 菌 膜 或 壁 环 ， 振 摇 易 乳 化 。琼 脂 平 板 上 形 成 的 菌 落 不 透 明 ， 表 面 粗 糙 ， 似 毛 玻 璃 状或 融 蜡 状 且 边 缘 不 齐 。 （ 3） 生 化 特 性 本 菌 有 动 力 ； 产 生 卵 磷 脂 酶 和 酪 蛋 白 酶 ； 过 氧 化氢 酶 试 验 阳 性 ； 溶 血 ； 不 发 酵 甘 露 醇 和 木 糖 ； 能液 化 明 胶 和 还 原 硝 酸 盐 ； 在 厌 氧 条 件 下 能 发 酵 葡萄 糖 。 (4)生 化 分 型 根 据 蜡 样 芽 孢 杆 菌 对 柠 檬 酸 盐 利 用 、 硝

14、酸 盐还 原 、 淀 粉 水 解 、 V-P反 应 、 明 胶 液 化 的 试验 ， 分 成 不 同 型 别 ， 见 表 1。 表 1 蜡 样 芽 孢 杆 菌 生 化 分 型型别 生 化 试 验柠 檬 酸 盐 利 用 硝 酸 盐 还 原 淀 粉 水 解 V-P反 应 明 胶 液 化1234567891011 12131415 （ 4） 与 类 似 菌 鉴 别 本 菌 与 其 他 类 似 菌 的 鉴 别 见 表 2。 5.结 果 报 告 报 告 1g（ mL） 检 样 中 所 含 蜡 样 芽 孢 杆 菌 数 量 个/g(mL)。 实验三、食品中蜡样芽孢杆菌的检验一、实验目的1学习蜡样芽孢杆菌检验

15、的原理和方法。2了解蜡样芽孢杆菌形态特征、培养特性和生化特性。 v蜡样芽孢杆菌为需氧、能产生芽孢的革兰氏阳性杆菌，在自然界分布较广，食品在正常情况下就可能有此菌存在，因而易从各种食品中检出。蜡样芽孢杆菌能发酵麦芽糖、蔗糖和水杨苷，不发酵乳糖、甘露醇、木糖、阿拉伯糖、山梨醇和侧金盏花醇,卵磷脂酶和酪蛋白酶，过氧化氢酶试验阳性，溶血，能在24h 内液化明胶和还原硝酸盐，在厌氧条件下能发酵葡萄糖。二、实验原理 三、实验方法与步骤1蜡样芽孢杆菌检验程序 2菌数测定以无菌操作将检样25g或25 ml按菌落总数测定方式，用灭菌生理盐水或磷酸盐缓冲液做成10-110-5的稀释液。取各稀释液0.1ml，接种在

16、选择培养基（甘露醇卵黄多黏菌素琼脂）平板上，用L形棒涂布于整个表面，置37培养1220h后，选取菌落数在30个左右者进行计数。蜡样芽孢杆菌在此培养基上生成的菌落为红色（表示不发酵甘露醇）,环绕有白色至淡粉红色的晕（表示产生卵磷脂酶）。计数后，从中挑取5个这样的菌落作证实试验。根据试验证实为蜡样芽孢杆菌的菌落数，计算出该培养皿内的蜡样芽孢杆菌数，然后乘其稀释倍数即得每克或每毫升样品所含的蜡样芽孢杆菌数。 将检样或其稀释液划线于上述选择性培养基平板上，置37培养1220h，挑取可疑蜡样芽孢杆菌的菌落接种于肉汤和营养琼脂培养基上做纯培养，然后做证实试验。3分离培养 （1）形态观察本菌应为G杆菌，宽度在1m或1m以上，芽孢呈卵圆形，不突出菌体，多位于菌体中央或稍偏于一端。（2）培养特性本菌在肉汤中生长混浊，常有菌膜或壁环，振摇易乳化。琼脂平板上形成的菌落不透明，表面粗糙，似毛玻璃状或融蜡状且边缘不齐。4证实试验 （3）生化特性本菌有动力；产生卵磷脂酶和酪蛋白酶；过氧化氢酶试验阳性；溶血；不发酵甘露醇和木糖；能液化明胶和还原硝酸盐；在厌氧条件下能发酵葡萄糖。 四、实验结果 根据以上实验作出检验报告。 五、思考题1如何区分蜡样芽孢杆菌和苏云金芽孢 杆菌？2设计蜡样芽孢杆菌计数程序？