电化学酶生物传感器

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1、电 化 学 酶 生 物 传 感 器2014年 5月 于 青 岛 电 化 学 酶 传 感 器 的 原 理 电 化 学 酶 传 感 器 是 由 生 物 酶 膜 与 各 种 电 极 如 离 子 选 择 电 极 、 气 敏 电 极 、氧 化 还 原 电 极 等 电 化 学 电 极 组 合 而 成 或 将 酶 膜 直 接 固 定 在 基 体 电 极 上 制成 的 生 物 传 感 器 。 根 据 输 出 信 号 的 不 同 酶 电 极 可 分 为 电 流 型 和 电 位 型 两种 类 型 。 5.2.1 电 流 型 酶 传 感 器 电 流 型 酶 电 极 传 感 器 将 酶 催 化 反 应 产 生 的 物

2、 质 发 生 电 极 反 应所 产 生 的 电 流 响 应 作 为 测 量 信 号 ， 在 一 定 条 件 下 ， 利 用 测 得 的电 流 信 号 与 被 测 物 活 度 或 浓 度 的 函 数 关 系 ， 来 测 定 样 品 中 某 一生 物 组 分 的 活 度 或 浓 度 。 酶 的 分 子 识 别 功 能 及 其 反 应 过 程 的 示 意 图 酶 电 极 制 备 过 程 中 的 关 键 在 于 酶 的 固 定 化 ， 固 定 化 的 目 的 在 于 保 持 酶 稳定 性 的 同 时 ， 尽 可 能 使 酶 膜 与 敏 感 元 件 紧 密 接 触 ， 这 样 酶 催 化 反 应 的 产

3、 物 可以 很 快 地 被 酶 敏 感 元 件 所 感 知 并 产 生 相 应 的 信 号 。 酶 的 固 定 化 酶 活 性 中 心 黄 素 腺 嘌 呤 二 核 苷 酸 （ FAD) Horseradish Peroxidase 亚 铁 血 红 素 （ Hemin) 模 拟 辣 根 过 氧 化 物 酶 （ G-四 链 体 -hemin 复 合 物 ） 5.2.2 酶 电 极 传 感 器 的 发展 三 代 电 流 型 酶 传 感 器 基 本 原 理 示 意 图(A)第 一 代 ， (B)第 二 代 ， (C)第 三 代 葡 萄 糖 传 感 器 葡 萄 糖 氧 化 酶 （ GOx） 血 液 中

4、的 糖 称 为 血 糖 ， 绝 大 多 数 都 是 葡萄 糖 。 体 内 各 组 织 细 胞 活 动 所 需 的 能 量 大 部分 来 自 葡 萄 糖 ， 所 以 血 糖 必 须 保 持 一 定 的 水平 才 能 维 持 体 内 各 器 官 和 组 织 的 需 要 。空 腹 血 糖 测 定 值 7.0 mM 高 血 糖 9.0 mM 糖 尿 由 一 种 称 为 Clark型 氧 电 极 来 制 备 的 ， 用 透 气 膜 将 酶 包 裹 固定 在 氧 电 极 表 面 。 葡 萄 糖 传 感 器 通 常 使 用 葡 萄 糖 氧 化 酶（ glucose oxidase， GOD） ， 该 传 感

5、 器 对 葡 萄 糖 具 有 选 择性 响 应 ， 其 检 测 原 理 为 ：第 一 代 葡 萄 糖 传 感 器检 测 氧 的 消 耗 或 过 氧 化 氢 的 生 成GOD6 12 6 2 2 6 12 7 2 2C H O +O +H O C H O +H O响 应机 理 第 二 代 葡 萄 糖 传 感 器 -电 子 媒 介 体 型电 子 媒 介 体 是 一 种 具 有 良 好 电 化 学 活性 的 相 对 分 子 质 量 小 的 化 合 物 ， 它 担负 从 酶 的 氧 化 还 原 中 心 到 电 极 表 面 传递 电 子 的 作 用 。 在 催 化 还 原 过 程 中 ，介 体 首 先

6、与 还 原 性 的 酶 反 应 ， 然 后 扩散 到 电 极 表 面 并 进 行 快 速 的 电 子 交 换 (1 )能 够 快 速 地 与 还 原 性 的 酶 反 应 ； (2 )具 有 可 逆 的 异 相 反 应 动 力 学 行 为 ； (3 )生 成 氧 化 型 介 体 的 过 电 位 低 而 且 与 pH无 关 ； (4 )它 的 氧 化 或 还 原 形 态 都 是 稳 定 的 ； (5 )还 原 型 介 体 不 与 氧 发 生 反 应 ； (6 )在 应 用 中 无 毒 化 作 用 。 图 511 一 些 常 见 的 媒 介 体 的 化 学 结 构(a)四 硫 富 瓦 烯 (TTF)

7、， (b) 四 氰 苯 醌 二 甲 烷 (TCNQ)，(c) 二 茂 铁 ， (d) N-甲 基 苯 基 吡 唑 酮 鎓 (NMP+)， (e) 麦 多 那 蓝常见的媒介体的化学结构 2+ +2+D-glucose + GOX (FAD) gluconolactone + GOD(FADH )GOD(FADH )+2Fc GOX (FAD)+2Fc+2H2Fc 2Fc +2e测 试 片 第 三 代 葡 萄 糖 传 感 器 -直 接 电 子 传 递 型 22 2 2 2 + 2glucose + GOx(FAD) gluconic acid + GOr(FADH ) GOr(FADH ) + O

8、 GOx(FAD) + H O GOx(FAD) + 2e + 2H GOr(FADH ) 三 代 电 化 学 酶 传 感 器 总 结 -以 葡 萄 糖 检 测 为 例 检 测 对 象 敏 感 物 质 （ 酶 ） 换 能 器 （ 电 极 ）葡 萄 糖麦 芽 糖蔗 糖半 乳 糖乳 酸尿 酸尿 素 氮胆 固 醇磷 脂 质氨 基 酸丙 酮 酸 乙 醇 葡 萄 糖 氧 化 酶淀 粉 酶转 化 酶 +变 旋 光 酶 +葡 萄 糖 酶半 乳 糖 酶乳 酸 氧 化 酶尿 酸 酶尿 酶胆 固 醇 氧 化 酶磷 脂 酶氨 基 酸 酶丙 酮 酸 脱 氢 酶乙 醇 氧 化 酶 O2, H2O2, PtPtO2PtO

9、2O2H2O2, O2O2, H2O2PtO2, H2O2O2O2 常 见 的 电 流 型 酶 电 极 传 感 器 2 肌 酸 和 肌 酸 酐 电 化 学 传 感 器22 2 2 2 2H OH OH O O HCHO H O 肌 酸 酐 水 解 酶脒 基 肌 酸 水 解 酶肌 氨 酸 氧 化 酶肌 酸 酐 肌 酸肌 酸 肌 氨 酸 脲肌 氨 酸 甘 氨 酸 图 517 肌 酸 微 传 感 器 对 肌 酸 的 响 应 图 516 肌 酸 和 肌 酸 酐 电 化 学 微 传 感 器 3 . 电 流 型 胆 固 醇 传 感 器 （ 胆 固 醇 测 试 仪 ） 血 清 中 总 胆 固 醇 (tota

10、l cholesterol ， TC) 包 括 游 离 胆 固醇 (free cholesterol ， FC) 和 胆 固 醇 酯 (cholesterol ester ， CE) 两 部 分 。 在 血 清 中 以 游 离 态 存 在 的 胆 固 醇 约 占 总 胆 固醇 的 2 7 % 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 中 国 正 常 人 血 清 的 总 胆 固 醇 量 约 为 :3 .0 5 .2 0 mmol/L。 血液 中 胆 固 醇 含 量 过 高 ， 表 示 胆 固 醇 代 谢 可 能 发 生 障 碍 。 冠状 动 脉 粥 样 硬 化 患 者 的

11、血 清 胆 固 醇 含 量 往 往 偏 高 。 因 此 临床 化 验 上 测 定 血 清 胆 固 醇 含 量 将 有 助 于 诊 断 某 些 疾 病 。 测 定 胆 固 醇 的 原 理 4 -胆 甾 烯 酮 基 于 蛋 白 质 直 接 电 子 转 移 的 全 胆 固 醇 传 感 器以 壳 聚 糖 为 载 体 将 血 红 蛋 白 、 胆 固 醇氧 化 酶 、 胆 固 醇 酯 酶 固 定 在 玻 碳 电 极表 面 ， 在 不 使 用 任 何 电 子 媒 介 体 的 条件 下 ， 利 用 血 红 蛋 白 和 电 极 之 间 的 直接 电 子 转 移 ， 制 备 成 高 选 择 性 的 全 胆 固 醇

12、 生 物 传 感 器 ， 用 于 测 定 血 清 中 的总 胆 固 醇 含 量 。 对 胆 固 醇 响 应 的 线性 范 围 为 1 0 1 1 0 mg /dL ， 检 测 限 为5 m g / d L ， 响 应 时 间 为 6 0 s 。电 流 响 应响 应 机 理 4 . 乳 酸 电 化 学 传 感 器 乳 酸 传 感 器 的 制 备 具 体 方 法 如 下 ， 先 在 玻 碳 电 极 上 滴 加 一 滴 用 氟 聚 酯(Nafion)调 制 的 介 体 四 硫 富 瓦 烯 (TTF)浆 液 ， 晾 干 后 再 用 牛 血 清 白 蛋 白和 戊 二 醛 将 乳 酸 氧 化 酶 固 定

13、在 该 电 极 表 面 修 饰 层 上 面 ， 即 构 成 乳 酸 传感 器 。 其 反 应 如 下 ： 2+ +2 + L- + LOD FAD +LOD FADH LOD FADH + 2TTF LOD FAD + 2TTF + 2H2TTF 2e 2TTF 乳 酸 乳 酸 氧 化 酶 丙 酮 酸 5. 尿 酸 电 化 学 传 感 器 尿 酸 是 核 酸 中 嘌 呤 分 解 代 谢 的 产 物 ， 正 常 值 为 2 7 mg/dL， 尿 酸 测定 对 于 诊 断 痛 风 十 分 有 帮 助 。 通 过 检 测 尿 酸 酶 催 化 反 应 的 反 应 物 和生 成 物 ， 进 而 可 以

14、用 来 测 定 尿 酸 的 含 量 。 在 分 子 氧 的 存 在 下 ， 尿 酸经 尿 酸 氧 化 酶 氧 化 成 尿 囊 素 、 过 氧 化 氢 和 二 氧 化 碳 ， 反 应 式 如 下 所示 ： 6 . 嘌 呤 电 化 学 传 感 器各 种 生 物 嘌 呤 如 黄 嘌 呤 、 次 黄 嘌 呤 、 肌 苷 都 可 以 利 用 电 流 型 酶 电极 进 行 检 测 。 例 如 当 鱼 死 后 其 组 织 中 的 腺 嘌 呤 核 苷 三 磷 酸 (ATP)迅速 降 解 为 肌 苷 单 磷 酸 (IMP)， IMP进 一 步 经 酶 分 解 导 致 了 次 黄 嘌 呤(Hx)积 累 ， 因 此

15、 次 黄 嘌 呤 浓 度 大 小 可 以 作 为 鱼 类 新 鲜 程 度 的 指 示剂 。 采 用 电 流 型 传 感 器 检 测 各 种 生 物 嘌 呤 的 酶 反 应 中 消 耗 氧 或 产生 过 氧 化 氢 ， 其 酶 催 化 反 应 式 如 下 所 示 。 7 . 电 流 型 有 机 磷 农 药 残 留 传 感 器 Choline Acetate H2O ineAcetylchol AChE2ChO2 2 22 2 2Acetylcholine H O Acetate CholineCholine O Betaine aldehyde H OH O O 2e 2H 1） 抑 制 型 12） 抑 制 型 2 有 机 磷 农 药i ii有 机 磷 农 药 3） 直 接 型 OHOPH 8 . HIV1 型 蛋 白 酶 电 化 学 传 感 器 A. 传 感 器 在 (a)40 nM, (b)60 nM， 100 nM HIV 1型 蛋 白 酶 及 (d)未 修 饰 金 电 极 在100 nM蛋 白 酶 溶 液 中的 循 环 伏 安 图 ; B. 电 位 与 蛋 白 酶 浓 度的 关 系 ；C. 峰 电 流 密 度 与 蛋 白酶 浓 度 的 关 系