发酵工程课件

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1、,单击此处编辑母版文本样式,,第二级,,第三级,,第四级,,第五级,,*,单击此处编辑母版标题样式,,微生物发酵类型及培养基,,,,,,,,,,,,,,,,,,单击此处编辑母版文本样式,,第二级,,第三级,,第四级,,第五级,,单击此处编辑母版标题样式,,,单击此处编辑母版标题样式,,单击此处编辑母版文本样式,,第二级,,第三级,,第四级,,第五级,,*,,*,单击此处编辑母版标题样式,,单击此处编辑母版文本样式,,第二级,,第三级,,第四级,,第五级,,*,,*,发酵工程课件,,发酵工程课件发酵工程课件5微生物发酵类型及培养基,微生物发酵的类型和方式,,,,,,,培养基选择和配制的原则,,,

2、,,,,培养基的设计,,,,,,,淀粉水解糖的制备,,,,,,,基因工程菌的不稳定性及对策,,,,,,,5微生物发酵类型及培养基,,一． 发酵类型：,,发酵类型是为了描述菌体生长，碳源利用及代谢产物形成速率变化，以及它们相互间动力学关系而确定的。,5.1微生物发酵的类型和方式,1．动力学描述参数,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,菌体生长速率,比生,,长速率,菌体得,,率系数,产物得率系数,（）：单位体积，单位时间里生长的菌体量 (L h),（µ）： 菌体浓度除菌体生长速率或繁殖速率 1,（）: 消耗1g或1营养物质生成的菌体的g数或数,（）：消耗1g或1营养物质生成的产物的g数或数,,

3、,,,,,,,,,2,3,,,,,1,产物形成直接与碳源利用有关,,产物形成间接与碳源利用有关,产物形成表面上与 碳源利用有关,2．发酵类型,根据产物的形成及,基质消耗的关系分,2．发酵类型,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,I,II,III,特点,菌体生长，碳,,源利用和产物,,形成几乎都在,,相同的时间出,,现高峰。,微生物生长和,,产物合成是分,,开的。 糖既满,,足细胞生长所,,需能量又充作,,产物合成的碳,,源。,产物形成一般,,在菌体生长接,,近或达到最高,,生长时期。产,,物形成及碳源,,利用无准量关,,系。,,1． 分批发酵： 是一种准封闭式系统。

4、 一次投料，一次接种，一次收获的间歇式培养方式。培养过程中，接种物要经过5个时期。即延迟期、 对数生长期、减速期、稳定期和衰亡期。,二． 发酵方式：,分批培养的特点：操作简单、周期短、染菌机会少和生产过程、产品质量易掌握。但是生产率相对较低。,,,细胞浓度随,,培养时间呈,,指数增长。,,细胞浓度的,,变化率与细,,胞浓度成正,,比,。,,,,,,,,2,,,对数生长期,,细胞的比生,,长速率开始,,下降,,,,,,,,3,,,,,细胞浓度达,,到最大值，,,细胞的比生,,长速率为,0,,,,,,,,4,,,,,活细胞浓,,度不断下降,,,,,,,,5,,,,,细胞浓度的,,增加不明显。,,受

5、菌龄和接,,种量的影响。,,,,,,,,1,,,延迟期,,,,减速期,静止期,衰亡期,特点,,对数生长期：,,=µX,,其中： 细胞干重,,时间,,µ 比生长速率,,微生物的比生长速率µ及微生物的种类、培养温度、 、培养基成分及限制性基质浓度等因素有关。,分批培养过程的生产率 P:,,生产率=产物浓度/发酵时间,,,生产率是评价发酵过程的成本和效率的综合指标。在分批培养时，计算时间还应包括放罐、清洗、装料和消毒的时间等非发酵过程所占用的时间。,,,2. 连续发酵：连续发酵是指在培养过程中，连续地向发酵罐中加入培养基，同时以相同的流速从发酵罐中排出含有产品的培养基的

6、发酵方式。一般连续培养方式很多：搅拌发酵罐和管式反应器；恒化和恒浊；循环式和非循环式；单级和多级。,,,,,依据培养物的,,生长率是受到,,化学环境控制,,的。即培养,,基中某一限,,制性组分的,,作用。,,,,恒化,,,,,,1,,,,,,,,,,,2,,控制补充的培养基的流速，使培养液的细胞浓度保持恒定。,,,,,恒浊,连续发酵,先作分批培养，让 微生物生长繁殖达到一定程度，并进 入产物合成期，然后开始以恒定的流 量向发酵罐流加培养基，同时以相同

7、 的流量排放培养液，使发酵罐内培养液的体积保持恒 定，微生物能持续生长并合成产物。,进行单级连续培养时，流出的培养液进行固液分离 后，经浓缩的细胞悬液再被送回发酵罐中的方法。,,把多个发酵罐串连起来，第一个罐的情况 与单罐培养相同，以后下一 罐的进料便是前一发酵罐的出料，这样就 组成

8、了多级串联连续培养。,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,循环式,单级连,,续培养,多级串联,,连续培养,非循环式：,单级连续培养进入稳定状态后，细胞的比生长速率及稀释率相等。,,,连续培养的最大特点：微生物细胞的生长速率、产物,,的代谢均处于恒定状态，可达,,到稳定、高速培养微生物细胞,,或生产大量的代谢产物的目,,的。生产率得以提高。,3．补料分批发酵,,在分批培养过程中，间歇或连续地补加新鲜培养基，而不从发酵罐中间断地放出培养液的培养方法。,,工业上利用分批补料培养以消除阻遏并保持通气条件。分批补料培养还可以防止培养基中某一组分的毒性。,,培养基：提供微生物生长繁

9、殖和生物合成各种代谢产物所需要的，按一定比例配制的多种营养物质的混合物。,5.2 培养基选择和配制的原则,一、培养基的类型和用途,基础,,，繁殖,,和鉴,,别培,,养基,天然,,合成,,和半,,合成,,孢子，,种子,和,发酵,培养基,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,根据来源,根据目的,根据生,,产工艺,二.培养基的选择,,,,,,,,,2,3,,,,,1,从微生物的特点来选择,从生产和科研的要求选择,从经济效益方面考虑,,,,对培养基的要求,,提供合成,,细胞和发酵产,,物的基本成分,利于减少培,,养基原料的单耗,利于提高培养,,及产物的浓度,,,利于减少能耗,减少

10、副产物，,,利于产品的,,分离纯化,利于提高产,,物的合成速率,三．培养基的配制原则,,,适当,,配比,,渗透压,pH,,氧化还,,原电位,,营养,,需要,原则,典型培养基,,,,完善的培养基设计是实验室的实验，实验工厂的放大和生产规模中的一个重要步骤。,,,,培养基的组成必须满足细胞的生长和代谢所需的元素，并能提供生物合成和细胞维持活力所需要的能量。,5.3 培养基的设计,一.培养基的成分,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,1,2,3,4,能源,,物质,,碳源,,物质,氮源,,物质,无机盐和微量,,元素,,一.培养基的成分,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,5,6,7,8,生长,

11、,因子,,前体,促进 剂和,,抑制,,剂,,水分,,,光能：光能自养微生物的能源。极端嗜盐菌进行海水淡化，藻类发酵等,,,氢、硫、氨、亚硝酸盐、亚铁盐等是 化能自养微生物的能源。,,,碳水化合物等有机物、石油、天然气及石油化工产品是异养微生物的能源。,1 能源物质,,。,碳源,细胞碳骨架,产物,能源,2.碳源物质,主要包括：糖类，脂类，有机酸，低碳糖等,,蔗糖,麦芽糖,乳糖,糊精,淀粉,葡萄糖,糖类,,碳源,脂类,有机,,酸类,,有机氮和无机氮,作用,菌体细,,胞结构,含氮代,,谢产物,细胞提,,供能源,3 氮源物质,花生饼粉，黄豆饼粉，,,棉籽饼粉，酵母粉，,,麦麸，鱼粉，蚕蛹粉，,,

12、玉米浆，蛋白胨，尿素，,,废菌体和酒糟,氨水，,,铵盐和,,硝酸盐,有机氮,无机氮,4．无机盐和微量元素,磷，镁，硫，铁，钾，钠，铅，氯，锌，钴，锰等。较低浓度对细胞的生长和产物合成有促进作用， 而在高浓度时常表现出显著的抑制作用,,作用,酶的激活剂,生理活性,,物质的调节剂,生理活性,,物质的组成,,辅酶的组,,成成分,高能,,化合物,缓冲剂,细胞结构,磷酸盐,,的作用,硫,含硫氨基酸,许多酶的辅酶的活性基,产物,硫酸钠,硫代,,硫酸钠,,,己糖磷酸化,,酶， 柠檬酸,,脱氢酶， 羧,,化酶等的激,,活剂。,,,,,,,,,2,,,,,是链霉素,,发酵的必,,需元素,,,,,,,,3,,,锌

13、,,是维生素,,B,12,的激活,,剂，可以,,促进产物,,合成,,,,,,,,4,,,钴,,维持细,,胞渗透,,压,,,,,,,,5,,,钾和钠,,影响细,,胞膜的,,透性；,,钙还影,,响磷酸,,盐的浓,,度,,,,,,,,6,,,,,细胞色素，,,细胞色素氧,,化酶，过氧,,化物酶等的,,组成成分，,,是微生物有,,氧氧化的必,,不可少的元,,素,,,,,,,,1,,,,,,,铁,镁,钾和钙,,,微生物生长不可缺少的微量有机物，称为生长因子。如氨基酸，嘌呤，嘧啶，维生素等。,,,作用：构成细胞的组成成分，促进生命活动的进行。,5．生长因子,1）生物素,,作用：影响产生菌细胞膜的通透性，同

14、时影响菌体的代谢途径。一般5μ。,生,,物,,素,过量,不足,不产或少产谷氨酸,,产乳酸或琥珀酸,,长菌快， 低，尿素消耗多,菌体生长不好,,谷氨酸产量低弱,,发酵向乳酸发酵转换,,2）维生素B1：对某些菌种发酵有促进作,,用。,,3）天然原料：玉米浆， 0.4-0.8%,,麸皮水解液， 1%,,糖蜜， 0.1-0.4%,,酵母,,某些化合物被加到培养基后，能够直接在生物合成过程中结合到产物分子中去，而自身的结构并未发生太大的变化，却能提高产品的产量。这类小分子物质称为前体。,6．前体,,7．促进剂和抑制剂,促进剂,是一类刺激因子，他们并,,不是前体或营养，其加入,,可以影响微生物的正常代,,

15、谢，或促进中间代谢产物,,的积累，或提高次级代谢,,产物的产量。,常用的促进剂,诱导物，表面,,活性剂，乙二,,胺四乙酸， 大,,豆油抽提物等。,,在发酵过程中，加入抑制剂会抑制某些代谢途径的进行，同时刺激另一代谢途径，以至于可以改变微生物的代谢途径。,,,8．水分,,参与细,,胞内一,,系列化,,学反应,,,,,,,,2,,,,,有效控,,制细胞,,内的温,,度变化,,,,,,,,3,,,,,维持大,,分子的,,天然构,,象,,,,,,,,4,,,,,脱水作用,,和水合作,,用控制有,,多亚基组,,成的结构,,,,,,,,5,,,,,溶剂和,,运输介,,质的作,,用,,,,,,,,1,,,,

16、,,,微生物发酵工程,5微生物发酵类型及培养基,微生物发酵的类型和方式,,,,,,,培养基选择和配制的原则,,,,,,,培养基的设计,,,,,,,淀粉水解糖的制备,,,,,,,基因工程菌的不稳定性及对策,,,,,,,5微生物发酵类型及培养基,一.培养基的成分,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,1,2,3,4,能源,,物质,,碳源,,物质,氮源,,物质,无机盐和微量,,元素,,一.培养基的成分,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,5,6,7,8,生长,,因子,,前体,促进 剂和,,抑制,,剂,,水分,,严格控制营养物质的浓度和比例，不仅仅是为了维持正常的渗透压，节约原料，而且直接影

17、响到菌体的繁殖和产物积累。,二．营养物质的调节,,,1,,不同碳源的利用速度,,,2,,氮源利用和碳源利用的关系,,3,,碳氮比例的调节,,4,,前体的控制,,5,,补料,1).不同碳源的利用速度,,能够被微生物快速利用的碳源称为速效碳源， 反之为迟效碳源。 利用速度依次为：葡萄糖乳酸乳糖,,,微生物对氮源的利用速度为：氨态氮硝态氮有机氮。,,氨的过高过低都会对产物形成造成不良的影响。,,氮源的利用速度及碳源的利用速度是很有关系的。,,糖代谢的许多中间产物是氨基酸合成的前体。,2).氮源利用和碳源利用的关系,,生产上多采用控制碳氮比例以满足菌体,,的大量繁殖，又能大量形成产物。,,,,酵母细胞

18、的碳氮比为：100：20；霉菌,,细胞的碳氮比为：100：10。,,,,发酵培养基的碳氮比约为：100：0.2-2.0。,,谷氨酸生产中的碳氮比约为：100：15-21。,3).碳氮比例的调节,4).前体的控制,,,,加入量,加入方式,菌种,前体,,,补料,丰富培养基,,产物合成的旺盛期延长,控制和代谢方向,改善了通气效果,解除终产物反馈,5)补料,补料的物质,碳，氮和水及其他物质。碳源,,有葡萄糖，饴糖，蔗糖，糊精,,，淀粉，油脂等。补料氮源有氨,,水，硫酸铵，硝酸钠，蛋白胨，,,花生饼粉，黄豆饼粉， 玉米浆,,和尿素等。,补料的方法,关键是控制补料时间，,,速率和配比。其目的是不,,使菌体

19、生长过快，仅仅,,维持呼吸，但是仍能合,,成产物。,碳源和能源+氮源+其他需要,,细胞+产物2 + H2O＋热量,,,组成微生物的元素包括Ｃ、Ｈ、Ｏ、Ｎ、Ｓ、Ｐ、Ｍｇ和Ｋ，　这些元素都要在方程中予以平衡。培养基中还需要微量元素(Ｆｅ、Ｚｎ、Ｃｕ、Ｍｎ、Ｃｏ、Ｂ等)。,三．培养基的设计,,,,对于无力合成的生长因子，要通过在培养基中加入适量的纯净物或含有该物质的混合物。,,碳源具有生物合成的底物和能源的双重作用。在需氧的条件下对碳源的需要量可以通过菌体得率系数推算而得,,,二糖,低聚糖,葡萄糖,淀粉,,水解糖,工业上，将淀粉水解成葡萄糖的过程称为淀粉的糖化。,5.4淀粉水解糖的制备,,发酵用淀粉

20、水解糖的要求：还原糖含量要高，不含糊精；外观要洁净，透明，呈淡黄色；不可变质。,,制备淀粉水解糖的原料主要有玉米，小麦，大米和薯类等。,,,水解,,适度,控制,,蛋白量,新鲜,,洁净,质量,方法,酸解法,酶解法,酸酶,,结合法,,1.淀粉水解糖对发酵的影响,,水解不完全：浪费，逃液，染菌。,,水解过度：产生羟甲基糠醛，进而形成类黑素，不仅浪费，而且抑制菌体生长。,,淀粉原料中蛋白含量过多，当糖液中和，过滤时除去不彻底，会引起发酵逃液和染菌。,葡萄糖的理论收率：111%,指,,标,实际,,收率,葡萄糖值,淀粉,,转化率,2.淀粉制糖过程中考察的指标,,,,实际收率=[糖液体积（L）X葡萄糖含量（

21、%）/淀粉量（）X原料中纯淀粉的含量（%）]X100%,,,,转化率=[糖液体积（L）X葡萄糖含量（%）/淀粉量（）X原料中纯淀粉的含量（%）X1.11]X100%,,,,值=还原糖（%）/干物质含量（%）,以酸为催化剂，在高温高压下，将淀粉转化为葡萄糖的方法。,,优点：生产简单，方便，水解时间短，设备生产能力大。,,缺点：要求特殊设备；易产生副反应；对原料要求高,,原理：,,淀粉 各种糊精 麦芽糖 葡萄糖,,,二淀粉酸水解法,影响水解反应速率的关键因素：,,,,,,,温度,,,,酸的浓,,度,,多糖的,,水解常数,酸的种类,因素,,淀粉 ５

22、’－羟甲基糠醛 乙酰丙酸+蚁酸+有色物质等。,其它副反应,缩短反应时间，,,控制反应ｐＨ，,,降低葡萄糖的浓度,减少,,,葡萄糖,二糖，,,三糖和,,其他低,,聚糖,酸和热,复合反应,异麦芽糖和龙胆二糖,降低葡萄糖的收率，,,发酵的残糖增加，,,抑制菌体生长和产物形成，,,增加提取和精制的难度,２．工艺,原料,中和,,脱色,过滤,,除杂,糖液,调浆,糖化,冷却,10.5-12Bé,,,0.6-0.7%， 1.5 左右,糖化时间=达到最大葡萄糖值时的时间-放料时间。,烧碱或纯碱中和温度为60-70℃， 中和4.6-5.0.,活性炭 ，淀粉量的0.6-0.8%。 65C。，

23、4.6-5.0。,d =144.3/144.3±Bé,,三．双酶水解法,,,淀,,粉,,酶,,和,,糖,,化,,酶,优点,缺点,条件温和，无需特殊设备,,无副反应，产品纯度高，淀粉转化率高。,,可在高淀粉浓度下水解,时间长，,,设备多，,,过滤难。,,淀粉,淀粉酶,葡萄糖，,,麦芽糖和,,麦芽三糖。,,,异麦芽糖,,和低聚糖。,（一）液化,,1.淀粉液化的条件及液化,,程度的控制,淀,,粉,糊化,老化,受热后，淀粉颗粒膨胀，晶体结构消失，互相接触变成糊状液体，即使停止搅拌，淀粉也不会再沉淀的现象。,,60-75℃。,分子间氢键已经断裂的糊化淀粉 又重新排列成新的氢键的过程。淀粉酶很难进入老化淀

24、粉的结晶区起作用，使淀粉很难液化,淀粉的种类，酸碱度，温度及加热方式，淀粉糊的浓度有关系。,液化的方法,,,1）、工艺流程,调浆,高温,,维持,二次,,液化,冷却,糖化,配料,一次喷,,射液化,液化,,保温,二次,,喷射,2、蒸气喷射液化工艺及条件,,2）、液化的控制,液,,化,低,高,液化液的黏度太大，难于操作；,,淀粉易老化，,,不利于糖化。,糖液的葡萄糖值低，淀粉会老化，影响糖化酶的作用效果。,葡萄糖值为10-20,,,液化结束要灭酶 。,,糖化酶的水解作用,,,糖化是利用糖化酶将淀粉液化产物糊精和低聚糖进一步水解成葡萄糖的过程。,,,,糖化过程葡萄糖含量不断增加。糖化酶对底物的作用是从

25、非还原性末端开始的。产生葡萄糖。糖化酶对1,4和1,6 糖苷键都能水解。,（二）糖化,,液化糖化灭酶过滤贮糖计量发酵,,,80-100 淀粉,,4.2-4.5, 60℃,,数小时,4.8-5.0,,90 ℃,,30,60-70 ℃,,过滤,糖化工艺条件及控制,,基因工程菌的稳定性是高水平发酵生产的基本条件。,5.5基因工程菌的不稳定性及对策,一、质粒不稳定性,分裂不稳定性,工程菌分裂时出现一定比,,例的不含质粒的子代菌的,,现象,,,结构不稳定性,由于从质粒上丢失或,,碱基重排、缺失所致工程,,菌性能的改变,,含低拷贝质,,粒者产不含,,质粒菌概率,,大；比生长,,速率关键,,,,,,,,2,

26、,,,,抗生素,,,,,,,,3,,,选择,,压力,,生长阶段,,使外源基,,因处于阻,,遏状态,,,,,,,,4,,,分阶段控,,制培养,,,温度、,,pH,、,,溶氧、,,限制,,性营,,养,,,,,,,,,5,,,控制培,,养条件,,影响细,,胞膜的,,透性；,,钙影响,,磷酸盐,,的浓度,,,,,,,,6,,,,,比生长速率；,,基因重组系,,统的特性；染,,色体上是否有,,与质粒和外,,源基因同源,,的序列,,,,,,,,1,,,,,,,合适的,,宿主,合适的,,载体,固定化,提高质粒稳定性的方法,基因工程菌的培养,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,补料分批,连续,,培养,透析

27、,,培养,固定化培养,延长对数期,,获得高密度,,菌体,难；分段，进行两阶段连续连续培养；优化诱导水平，稀释率；细胞比生长速率,利用膜的半透性使培养物和培养基分离,质粒的稳定性提高,,高密度培养,高密度培养是一个相对概念，一般是指培养液中工程菌的菌体浓度在50干重以上，理论上最高值可达200。高密度培养是大规模制备重组蛋白质过程中不可缺少的工艺过程,,,高密度培养可以提高菌体密度，提高单位体积的生产能力，降低生物量的分离费用，缩短生产周期，从而降低生产成本，提高生产效率。,影响高密度培养的因素,对氧气的需求更高,对营养源的种类和含量要求高,精确调控,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,培养基,溶氧浓度,,,影响高密度培养的因素,保持高溶氧，流加补料，适当的比生长速率,分段控制,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,温度,生长抑制,,物的生成,,如何达到高密度培养,,,,,,,,,2,3,,,,,1,培养条件的改进,构建出产乙酸能力低的工程化宿主菌,构建蛋白水解酶活力低的工程化宿主菌,谢谢大家！,