石蜡制片技术

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1、单击此处编辑母版标题样式,,单击此处编辑母版文本样式,,第二级,,第三级,,第四级,,第五级,,,,*,石蜡制片技术,,1,,三、实验原理,,,石蜡切片的原理是利用石蜡的熔点是58C左右和对不同化学物质溶解性不同，通过透明剂，在石蜡熔点以上，将石蜡渗透进入植物组织和细胞之间，当温度降低到石蜡熔点以下时，凝结成固态固定组织和细胞以利于切片。,2,,一、石蜡制片技术的优点,,石蜡切片法是一种最常用的显微制片方法，它的优点是可切出大量极薄的连续切片，且成本教低。,,石蜡切片技术适应细胞水平的研究。,3,,二、实验目的,,,了解石蜡切片的基本原理，掌握石蜡切片的基本过程和制作方法，学会制作石蜡切片中一

2、些常用试剂的配制方法，认识石蜡切片的实用范围。,4,,四、实验器材、试剂,,,手摇切片机、展片台、温箱、镊子、解剖刀、酒精灯、盖玻片、指形管等。番红染色液、固绿染色液、FAA固定液、二甲苯、各级酒精、石蜡、加拿大树胶、蛋白胶等,5,,五、石蜡制片的操作流程,,,（一） 取材,,（二）固定和抽气,,（三）脱水、透明及渗蜡,,（四）,包埋,,（五）修块,、切片和烫片,,（六）烘干,,（七）脱蜡、染色、脱水、透明,,,（八）封片,,,,,,6,（一）取材,,,选取经过自己设计实验的对照和处理的材料，根据不同的要求，从植物体上选取有代表性的器官或组织，取材力求新鲜，以避免组织发生死后变化。取材时要用

3、快刀切割材料，不能挤压，所取的材料不宜过大，在不影响观察的情况下应尽可能小些，这样有利于药剂透入组织和细胞中。,,7,,（二）固定和抽气,（一）将切取的植物材料放入固定液中，使其细胞原生质在极短的时间内停止生命活动，尽量保持细胞原有的细微结构，也可使某些柔软的材料适当硬化，便于切片。材料的长和宽最大不超过1cm。固定液为材料的20倍左右。固定时间24小时，其间要放入抽真空机中抽气15-30分钟至材料完全沉浸在固定液下面。并用铅笔写好标签。,8,,固定剂的种类,,1.福尔马林—醋酸—酒精固定剂（FAA）,,70%或50%酒精 90CC,,冰醋酸 5CC,,

4、福尔马林 5CC,,2.醋酸—酒精固定剂（卡诺固定剂）,,此固定剂的主要成分是冰醋酸和纯酒精，也可加入氯仿。,,纯酒精（95%酒精） 3份,,冰醋酸 1份,9,,（三）脱水、透明及渗蜡,将材料从固定液中取出后，其具体流程如下：,,A：酒精 X：二甲苯,,70%A（2h）→85%A（2h）→95%A（2h）→100%A（2h）→100%A（2h）→3/4A+1/4X（2h）→1/2A+1/2X（2-3h、过夜）→1/4A+3/4X（2h）→X（2h）→1/2X+1/2蜡（过夜）→渗蜡1（2h）→渗蜡2（2h）→渗蜡3（2h）,10,,

5、（四）,包埋,将渗蜡后的材料和石蜡一起倒入小纸盒，用加热的镊子迅速把材料按需要的切面和一定的间隔排列整齐并使其竖直，倒入纯蜡进行包埋。稍微凝固后倒置于清水盆中彻底冷却凝固。,11,,（五）修块,、切片和烫片,1、,修块,将包埋好的材料切割成小块，每个小块包含一个材料，并修成梯形，切面在梯形的上部。注意上部矩形对边平行，梯形底部用烧热的蜡将其固定在木块上。,,2、,切片,将粘有蜡块的小木块至于切片机上，调整切距到适当大小，转动调节器条切片厚度12µm左右进行切片。注意切片时要一手转动切片机，另一手执毛笔将切下来的片子摊开以形成一长条蜡带。,,3、,烫片,滴一滴蛋白胶于干净载玻片中央，用干净的手指

6、涂抹均匀后，滴上清水，将取下的蜡带切成小段置于载玻片上（放上两至三段），然后将载玻片放到展片台上(保持40℃)烫片。 待充分烫平后用吸水纸吸去多余的水。,12,,（六）烘干,,将烫好的片子自然烘干，或45℃烤片箱干燥1~2天，注意防尘。,,13,,（七）脱蜡、染色、脱水、透明,将玻片标本放于100%X（15-30min)→100%X(1-2min)→50%X+50%A(1-2min)→100%A(1-2min)→95%A(1-2min)→85%A(1-2min)→番红（85%A配制）(2-4h)→85%A(3-5s）→95%A(3-5s）→固绿（100%A配制）(30s)→95%A(1-

7、2min)→100%A(1-2min)→100%A(1-2min）→50%X+50%A(1-2min)→100%X(1-2min)→100%X(1-2min),,注意番红染色时间要长些（至少3h以上），随后的两次经过酒精的时间都应很短，以免洗掉染上的番红，固绿的染色时间大约在20-30s,其他各步的时间大约1至2分钟，均要视具体情况而定。,14,,番红—固绿染色法,,此法应用甚广，是研究植物一般形态结构的重要方法。番红为碱性染料，常用的是混合物（二甲基酚番红，三甲基酚番红），可将细胞核、染色体、核仁等染成红色，对木化、栓化、角化的细胞壁也有很好的染色效果。,,固绿为酸性染料，能对细胞质、纤维素

8、细胞壁染色。番红与固绿对染，效果很好。,15,,番红染液配法,,16,,,固绿染液配法,17,,铁矾—苏木精染色法,,次法在细胞学及胚胎学上广为应用，是显示细胞一般结构及细胞分裂的良好染色方法，它能将细胞核、细胞分裂时的染色体染成蓝黑色，且能长久保持颜色。,,苏木精（C16H14O6）不能直接染色，必须氧化成熟为氧化苏木精，同时还要经过媒剂的作用，才能染上颜色，所以这种染色法必须配制两种溶液。,18,,染液的配制,,甲液：4%铁矾（硫酸铁胺）水溶液，这是一种媒染剂，冲淡成2%的浓度时，又可作分色剂使用，临用时配用较好。,,乙液：苏木精10g+无水酒精100CC，这是母液，要经1—2个月才能氧化

9、成熟，染色时，将此母液5CC加入100CC蒸馏水，冲淡应用。,19,,染色过程,,玻片材料经脱蜡、各级酒精、蒸馏水，进入4%铁矾媒染05—4小时，水洗约5分钟，换蒸馏水2次，每次2—3分钟，然后05%苏木精染色1—4小时或更长，蒸馏水换洗数次，再用2%铁矾分色，一般大约半分钟至数分钟。在分色时，要随时在低倍镜下检查，直到满意为止。然后，用水冲洗30分钟，最后换蒸馏水数分钟。,20,,（八）封片、干燥、贴标签,,1、 从二甲苯中取出然好色的片子，用中性树胶进行封片。注意封片用的该玻片要清洁，封片时要注意不要产生气泡。,,2 、一般一个月以上，树胶才能干燥，如加热烤片，可缩短干片时间，在载玻片的一端贴上标签，注明材料名称、制片时间等，最后将制成后的玻片置于切片盒中保存。,21,,六、思考题,,,为什么固定材料时最好抽气，材料中有气泡对切片有何影响？,,为什么制作营养器官的石蜡切片常用番红—固绿染色，而制作生殖器官的切片则多用苏木精—固绿染色？,22,,