第二章 dna重组

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1、单击此处编辑母版标题样式,,单击此处编辑母版文本样式,,第二级,,第三级,,第四级,,第五级,,,*,基因工程,郑州大学生物工程系,,主讲教师：刘红涛,,第二章,DNA,重组,,,DNA,重组的概念及意义,,在自然界，生物体内时刻发生,DNA,的重组，呈现出对生物有利或有害的变异。这种重组不受人们意志控制，重组结果难以预测。,,,基因工程涉及的,DNA,重组是根据人们的愿望，进行严密的设计，在生物体外通过人为的,DNA,片段化的重新连接，产生新的重组,DNA,分子，使其遗传信息发生变化，达到人们希望的目的。,,2.1 DNA,的组成和结构（略）,,2.2,天然,DNA,的制备,,2.2.1,

2、天然,DNA,的来源和用途,,,,2.2.2,天然,DNA,的提取,,准备生物材料,裂解细胞,分离和抽提,DNA,,1,、准备生物材料,,选择生物种类；选择,DNA,易提取和含量高的组织；选择,DNA,得率最高的生长期。,如,:,,大肠杆菌质粒,DNA,：,应在对数生长期后期。,,植物,DNA,：,选幼嫩植株或黄化幼苗，减小淀粉对提取,DNA,的干扰。,,肝脏,DNA,：,要清除胆囊，主要是去除多种高活性的酶。,,2,、裂解细胞,,这步是关系到能否提取到,DNA,以及,DNA,得率高低和质量的,关键步骤,。,,原核细胞,：用溶菌酶，,NaOH,和,SDS,，煮沸，冰冻，超声波等方法；,,结构复

3、杂的动、植物材料,：先必须粉碎（液氮冻结后研磨，或捣碎机、研钵直接粉碎），再参照裂解原核的方法。,,3,、分离和抽提,DNA,,提取总,DNA,：,在裂解液中加适量,酚／氯仿／异戊醇,或,氯仿／异戊醇,等有机溶液，使,DNA,与蛋白质分开，用,乙醇,或,异丙醇,沉淀,DNA,，再离心。,,,提取叶绿体或线粒体等细胞器,DNA,以及病毒和噬菌体的,DNA,：,须先从裂解液中,分离,完整细胞器、病毒和噬菌体，抽提前必须经,DNase,处理，水解附着于其表面的其它,DNA,。,,提取质粒,DNA,：,调节裂解液,pH12.6,，所有,DNA,都,变性,沉淀，再调节,PH,至中性，质粒,DNA,复性,

4、后从沉淀物中释出。,,,,除,RNA,：,用,RNase,水解除,RNA,，,,分离抽提,DNA,最有效的方法：,氯化铯梯度离心,（氯化铯溶液中加适量溴化乙锭，紫外灯下,DNA,带和,RNA,带都发荧光，但沉降系数明显不同而聚集于不同的氯化铯密度区）,,2.2.2.1,大肠杆菌源质粒,DNA,的提取,,碱裂解法*：,,原理：,细菌悬浮液暴露在高,pH,值的强阴离子洗涤剂中，会使细胞壁破裂，染色体,DNA,和蛋白质变性，相互缠绕成大型复合物，被,SDS,包盖，当用钾离子取代钠离子时，复合物会从溶液中有效地沉淀下来，离心去除后，就可从上清中回收质粒,DNA,。,,实验步骤,,挑取一些独立的转化菌落

5、进行小规模培养，用无菌牙签或挑种环挑取单菌落于,20ml,含有相应抗生素的,LB,液体培养基中，于,37℃,剧烈振摇下培养过夜。,,将,1.2ml,培养物倒入微量离心管中，于,4℃,以,5000g,离心,5min,（两次）。,,吸取并弃去培养液，使细菌沉淀尽可能干燥。,,将细菌沉淀重悬于,100μl,溶液,Ⅰ,中，剧烈振荡。,,加,200μl,溶液,Ⅱ,，盖紧管口，快速颠倒离心管,5,次，以混合内容物。确保离心管的整个表面均与溶液,Ⅱ,接触。不要振荡！将离心管放置与冰上,5min,。,,加,150μl,溶液,Ⅲ,，盖紧管口，将管倒置，温和振荡,20s,，使溶液,Ⅲ,在黏稠的细菌裂解液中分散均匀

6、，之后将管置于冰上,5min,。,,4℃,离心,12000g,，,5min,，,上清,转移至另一离心管中。,,加等体积酚,-,氯仿,-,异戊醇（,25:24:1,），振荡混匀。,,4℃,离心,12000g,，,5min,，上清转移至另一离心管中。,,用,2,倍体积无水乙醇于室温沉淀质粒,DNA,，振荡混匀，于室温放置,2min,。,,4℃,离心,12000g,，,5min,。小心吸去上清夜，将离心管倒置于一张纸巾上，以使所有液体流出。再将附于管壁的液滴除尽。,,用,1ml70,％乙醇溶液洗涤沉淀，,4℃,离心,12000,，,5min,，弃去上清，在空气中使核酸沉淀干燥。,,用,50μl,含无

7、,DNA,酶的胰,RNA,酶（,20μlg/ml,）的,TE,重新溶解核酸，振荡，贮存于,-20℃,。,,,,试剂： （,1,）,溶液,Ⅰ,：,50mmol/l,葡萄糖,,,25mmol/l,Tris-HCl,（,pH8.0,）,,,10mmol/l,EDTA-Na,2,,（,pH8.0,）,,,5mg/ml,溶菌酶,（,临用时加,）,,,（,2,）,溶液,Ⅱ,（,新鲜配制,）：,,,200mmol/l,NaOH,,1%,（,W/V,）,SDS,,,,（,3,）,溶液,Ⅲ,（,100ml,）：,,,5mol/l,KAc,60ml,,,冰乙酸,,11.5ml,（,pH4.8,）,,,ddH,2,

8、O,28.5ml,,2.2.2.2,λ,噬菌体,DNA,的提取,,溶源周期,,,溶菌周期,,,提取,λ,DNA,的原理：,,先将溶源菌培养至一定密度，通过热诱导，使,λ,DNA,从宿主染色体,DNA,上释放出来，再经过溶菌周期培养，获得大量,λ,噬菌体，从中提取线形的,λ,DNA,。,,,提取过程：,,溶源菌诱导培养,,分离,λ,噬菌体,,λ,DNA,的提取,,,,2.2.2.3,氯化铯法制备植物基因组,DNA,,材料准备,,细胞裂解,,DNA,分离抽取,,,2.2.3 DNA,的纯化,,2.2.3.1,氯化铯－溴化乙锭连续梯度离心法,,2.2.3.2,离子交换层析法,,用三烃甲基氯化铵层析

9、树脂纯化,DNA,,用羟基磷灰石纯化,DNA,,2.2.3.3,琼脂糖凝胶电泳洗脱法,,2.2.3.4 “,基因纯”试剂纯化,,2.2.3.5,从,DNA,样品中去掉,EB,,正丁醇（或异戊醇）抽提法,,Dowex,树脂层析法,,2.2.4 DNA,的浓缩,,乙醇沉淀法,,含一价阳离子的,DNA,溶液＋,2,体积无水乙醇→,沉淀,DNA,→,离心,→,溶于适量,TE,缓冲液或无菌水。,,条件：,-20℃,，,30 min,以上；小于,1kb,或量较少时，于,- 70℃,沉淀，或延长时间。,,正丁醇抽提法,,DNA,溶液＋,1,体积正丁醇→,混匀,→,离心（,1600 r/min 1min

10、,）,→,弃上清,→,重复至所需体积,→,用水饱和乙醚抽提,DNA,溶液两次（除正丁醇）,→,空气中蒸发乙醚。,,聚乙二醇浓缩法,,DNA,溶液,→,透析袋,→,置高浓聚乙二醇溶液,→,,4℃,浓缩至所需体积。,,2.3,限制性核酸内切酶和,DNA,片段化,2.3.1,限制性核酸内切酶,（,restriction,endonuclease,）,,定义,,是一类能识别双链,DNA,中特殊的核苷酸序列，并使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶。,,类型,,Ⅰ,型限制酶,,Ⅱ,型限制酶,,Ⅲ,型限制酶,Eco,RI,：,GAATTC,,CTTAAG,,（,1,）,Ⅰ,型限制酶（无用）,,分子

11、量：,30,万,dal,左右,,组成：,3,种亚基,,特异性亚基：具特异性识别,DNA,序列的特性。,,修饰亚基：具甲基化酶活性。,,限制亚基：具核酸内切酶活性。,,辅助因子：,需,Mg,2+,、,ATP,和,SAM(,即,S-,腺苷甲硫氨酸,),。,,识别和切割位点：,不一致（距识别位点,5’,一侧数千碱基处随机切割,DNA,分子）。,,（,2,）,Ⅱ,型限制酶（十分有用）,,分子量：,2,万～,10,万,dal,（较小）,,组成：,一种多肽，常以同源二聚体形式存在。,,辅助因子：,无需辅助因子，或只需,Mg,2+,。,,识别和切割位点：,有较为专一的识别位点。,,,（,3,）,Ⅲ,型限制酶

12、（无用）,,组成：,两个亚基,,M,亚基：负责位点的识别与修饰。,,R,亚基：具核酸酶的活性。,,辅助因子：,需,Mg,2+,、,ATP,和,SAM,,识别和切割位点：,不一致（距识别位点,3’,端约,25bp,处切割,DNA,分子）。,,限制酶的命名,,,Ⅱ,型限制酶的特性,,1,、不同限制酶能专一地识别不同的特异核苷酸序列；,,,,,,＝,6,个（大多数）：,如,Eco,R,Ⅰ 5’-GAATTC-3’,识别序列,<6,个：,如,Asu,Ⅰ 5’-GGNCC-3’,（,5,个）,,,Mbo,Ⅰ 5’-GATC-3’,（,4,个）,>6,个：,如,Not,Ⅰ 5’-GCGGCCGC-3

13、’,（,8,个）,有的限制酶识别序列包含在另一种限制酶内。,,,如：,Sau,3A,识别 ：,GATC,,,Bam,H,Ⅰ,识别 ：,G,GATC,C,有的限制酶识别多种核苷酸序列。,,,如：,Hin,dⅡ,识别,4,种核苷酸序列：,5’-CTPyPuAC-3’,,,（,Py,→,嘧啶碱基,C,或,T,；,Pu,→,嘌呤碱基,A,或,G,）,,2,、各种限制酶的识别序列一般都具有回文结构；,,,Ⅱ,类限制酶识别序列特点,——,,回文结构,(palindrome),,GG,A,T,CC,,CC,T,A,GG,5’,3’,5’,3’,限制酶：,Bam,H,Ⅰ,正读与反读都相同。,,以识别序列的中线

14、为对称轴，左右两侧的碱基互补。,,为便于书写，识别序列可以以,5’,→,3’,走向的单链,DNA,表示。,,3,、各种限制酶的切割类型是各式各样的，切割后形成各种粘性末端或平整末端；,,（,1,）,粘性末端和平整末端,,,(a)5’,－,P,单链延伸的粘性末端,(b)3’,－,OH,单链延伸的粘性末端,①,粘性末端（粘端）,－,G AATTC,－,,－,CTTAA G,－,GAATTC,CTTAAG,如：,Eco RⅠ,5’,3’,5’,3’,5’,3’,5’,3’,－,CTGCA G,－,,－,G ACGTC,－,CTGCAG,GACG

15、TC,如：,Pst,Ⅰ,5’,3’,5’,3’,5’,3’,5’,3’,,②,平头末端（平端）,－,CCC GGG,－,,－,GGG CCC,－,CCCGGG,GGGCCC,如：,Smal,Ⅰ,5’,3’,5’,3’,5’,3’,5’,3’,,（,2,）两种特殊的限制酶：,同尾酶,和,同裂酶,,同尾酶（,isocaudamer,）,,,有些限制性内切酶虽然来源各异，识别的靶序列也各不相同，但切割,DNA,后，产生相同的粘性末端，这一类限制酶特称为,同尾酶,。这两个相同的粘性末端称为,配伍未端,。,Bam,HⅠ,Bgl,Ⅱ,GGATCC,,CCTAGG,AGATCT,

16、,TCTAGA,G,,CCTAG,GATCC,,G,+,+,A,,TCTAG,,GATCT,,A,,同裂酶（,isoschizomer,）,,,有一些来源不同的限制酶识别的是同样的核苷酸靶序列，这类酶特称为,同裂酶,。同裂酶的切点位置可相同或不同。,GGATCC,,CCTAGG,G,,CCTAG,GATCC,,G,+,Bam,HⅠ,GGATCC,,CCTAGG,G,,CCTAG,GATCC,,G,+,Bst,Ⅰ,（,a,）切点位置相同,,CCCGGG,,GGGCCC,C,,GGGCC,CCGGG,,C,+,Xma,Ⅰ,CCCGGG,,GGGCCC,CCC,,GGG,GGG,,CCC,+,Sma

17、,Ⅰ,（,b,）切点位置不相同,,4,、某些限制酶在非标准反应条件下，可能导致酶的识别序列特异性发生改变。,,限制酶的第二活性：,在,甘油浓度,、,离子强度,、,pH,值,、,有机溶剂,、,二价阳离子,、,酶与,DNA,的比例,等参数单独或同时发生改变时，会导致限制酶的识别序列特异性发生改变，在,DNA,内产生附加切割，称为限制酶的第二活性，又称,Star,活性,。能产生第二活性的酶常在酶名称的右上角加一星号“☆”，如,EcoR,Ⅰ,★,。,,,,2.3.5,限制性核酸内切酶反应系统,,反应系统包括：,酶,、,底物,、,反应缓冲液,、,合适的反应,温度,等。,,2.3.5.1,底物,DNA,,

18、,限制酶的催化效率与,DNA,样品纯度、,DNA,分子构型、识别序列两侧序列长短以及序列碱基甲基化等密切相关。,,DNA,纯度；,,DNA,分子构型；,,识别序列侧面的序列,(,保护碱基，如,Eco,RI,GAATTC,),；,,位点偏爱；,,DNA,甲基化。,,,2.3.5.2,限制性核酸内切酶用量,,主要取决于酶本身的催化活性和底物,DNA,样品,,1,酶活性单位,（,U,）：某种限制性核酸内切酶在最适反应条件下，,60 min,内完全切割,1μg,λDNA,所需的酶活性。,,,酶活性高的用量少，反之则多。,,能被高效切割的,DNA,样品用酶量少，反之则多。,,等量的两种,DNA,样品，限

19、制酶识别序列密度大的用酶量多，反之则少。,,,2.3.5.3,限制性核酸内切酶反应缓冲液,,包含：氯化镁或醋酸镁、氯化钠或醋酸钾、二硫苏糖醇,(DTT),或,β-,巯基乙醇,(2-Me),、,Tris,-HCI,或,Tris,-Ac,。,,,2.3.5.4,限制性核酸内切酶反应温度,,大多数的最适反应温度是,37℃,，而少数酶的最适反应温度高于或低于,37℃,。,,2.3.6,限制性核酸内切酶的,Star,活性,（见前）,,几乎所有的限制酶都具有,Star,活性。,,Star,活性的影响：,导致切割中出现非特异性,DNA,片段，甚至不能获得预计的,DNA,片段，影响进一步的,DNA,连接重组。

20、,,排除方法：,如降低反应系统中甘油含量，控制,pH,中性和高盐浓度下进行反应。,,2.3.7 DNA,分子片段化,,天然,DNA,或化学合成的,DNA,常需酶切成可连接重组的,DNA,片段，即,DNA,分子的片段化,。常用的切割方法有,单酶切,、,双酶切,和,部分酶切,等方法。,,,单酶切法：,用一种限制性内切酶切割,DNA,样品。最常用。,,双酶切法：,用两种不同的限制酶切割同一种,DNA,分子。,,部分酶切：,指选用的限制性核酸内切酶对其在,DNA,分子上的全部识别序列进行不完全的切割。,EcoRI,EcoRI,EcoRI,EcoRI,1,2,3,4,,2.3.8 DNA,分子的限制

21、性图谱,,,2.4,特异性,DNA,片段的,PCR,扩增,,聚合酶链式反应（,polymerase chain reaction,）,,即,PCR,技术,，由美国科学家,Mullis,于,1983,年发明，又称,基因的体外扩增法,。也有人称,无细胞分子克隆法,。,,PCR,技术的用途,,目的基因的扩增与分离；,,医疗诊断；,,基因突变与检测；,,分子进化研究；,,环境检测；,,法医鉴定。,,§1 PCR,的基本原理,一、基本原理,,,变性,,95,˚,C,延伸,,72,˚,C,退火,,Tm-5,˚,C,,Tm=4(G+C)+2(A+T),90,～,95℃,,30’’,～,1’,37,～,60

22、℃,,30’’,～,1’,70,～,75℃,,30’’,～,2’,预变性,5min,目的,（,1,）,破坏,DNA,中可能存在的较难破坏的二级结构。 使,DNA,充分变性，减少,DNA,复杂结构对扩增的影响，以利于引物更好的和模板结合，特别是对于基因组来源的,DNA,模板，最好不要吝啬这个步骤。 （,2,）此外，在一些使用热启动,Taq,酶的反应中，还可激活,Taq,酶，从而使,PCR,反应得以顺利进行。,,,,,二、“长产物片段”和“短产物片段”,,“短产物片段”是严格地限定在两个引物链,5’,端之间的，正是需要扩增的特定片段；“长产物片段”则带有不需要的“尾巴”。,,“短产物片段”是按指数

23、倍数增加的；而“长产物片段”则以算术倍数增加，几乎可以忽略不计。,,,三、平台效应,,在,PCR,反应中，当引物－模板与,DNA,聚合酶达到一定比值时，,DNA,聚合酶催化的反应趋于饱和，会出现“平台效应”，即,PCR,反应产物不再增加。,,平台效应出现的迟早主要取决于起始模板的拷贝数、所用的,DNA,聚合酶的性能及底物,dNTP,的浓度等多种因素。,,§2 PCR,反应条件的优化,一、标准,PCR,反应流程,,（一）反应体系,,标准,PCR,反应体系为,50,～,100μl,，其中包含：,,1×PCR,反应缓冲液,,4,种,dNTP,：,各,200μM,,两种引物：,各,0.25μM,,D

24、NA,模板：,0.1μg,,Taq,DNA,聚合酶：,2U,,（二）反应步骤,,,二、,PCR,反应条件的优化,,特异性、有效性和忠实性是检验,PCR,扩增效率的三个指标。,,PCR,反应的主要影响因素有：,,（一）循环参数（反应温度与时间）,,变性,,退火,,延伸,,循环次数,,（二）,PCR,反应成份,,Taq,DNA,聚合酶,,引物,,dNTP,,缓冲液,,模板,,其它因素,,高温启动,,添加剂,,§3,引物的设计,一、设计原则,,PCR,扩增引物：,是指与待扩增,DNA,区域两端序列互补的人工合成的寡核苷酸短片段，其长度通常在,15,～,30,个核苷酸之间。它包括引物,1,和引物,2,

25、。,,引物,1,：又称,Watson,引物,，是,5’,端,与正义链互补,的寡核苷酸，用于扩增编码链或,mRNA,链。,,引物,2,：又称,Crick,引物,，是,3’,端,与反义链互补,的寡核苷酸，用于扩增,DNA,模板链或反密码链。,,引物设计的基本原则,是最大限度地提高扩增效率和特异性，同时尽可能抑制非特异性扩增。,具体的设计原则见书,P57,。,,二、引物长度,,引物太短→可能同非靶序列杂交，得出非预期的扩增产物。,,引物过长→引物同模板,DNA,的杂交速率下降，结果在反应循环周期内无法完成同模板,DNA,的完全杂交，从而减低,PCR,反应的效率。,,三、引物的,5’,端修饰法,,5’

26、,端附加核酸序列（加酶切位点等）,,功能基团修饰法,,放射性核素（修饰三磷酸）,,,非放射性分子（修饰碱基，如用,Dig, Biotin,等）,,§4,耐热,DNA,聚合酶,一、,Taq,DNA,聚合酶,,热稳定性,,无,3’ →5’,外切酶活性,,反转录活性,,非模板依赖的聚合活性,,影响酶活性的因素,,,二、其它耐热,DNA,聚合酶（见书,P56,）,,Pwo,DNA,聚合酶,,Tth,DNA,聚合酶,,C.,therm,.,聚合酶,,vent DNA,聚合酶*,,Pfu,DNA,聚合酶*,,2.5 DNA,片段的化学合成,,2.5.1,寡核苷酸片段的化学合成的方法,,磷酸二脂法,,磷酸

27、三脂法,,固相亚磷酸三脂法（常用）,见,60-66,页,,2.5.2,化学方法合成的,DNA,片段,,化学方法可合成,DNA,互补链的引物、寡核苷酸连杆以及基因片段和元件等。,,合成,DNA,互补链的引物,,除,PCR,引物外，还有测序引物。见下表。,,,DNA,寡核苷酸连杆（,linker,）,,linker,：,是指用化学方法合成的一段由,10~20,个核苷酸组成，具有一个或数个限制酶识别位点的平末端的双链寡核苷酸片段。,,linker,经限制酶切割后可产生一定的粘末端，可与另一有相同粘末端的,DNA,片段连接。,（附图）,,化学合成的寡核苷酸中，有的含有一个反向重复序列而形成一个双链发夹

28、结构。在双链部分有一种限制性核酸内切酶的识别序列，切割后产生一定的粘末端或平末端。这种寡核苷酸可兼作连杆和引物，即,测序引物连杆,。,,由几十至上百个核苷酸组成，有多种限制酶的识别序列，可作为连杆且被组装在克隆载体上成为多克隆位点（,MCS,）。这种连杆即多克隆位点寡核苷酸连杆或简称,MCS,连杆,。,（附图）,,,衔接头（,adaptor,）,,adaptor,：它是一类人工合成的一头具有某种限制酶粘性末端另一头为平末端的特殊的双链寡核苷酸短片段。,（附图）,,DNA,芯片,,DNA芯片,：是,DNA,片段以预先设计的排列方式固定在载玻片或尼龙膜上组成的密集分子排列。,,,2.6 DNA,

29、片段大小的凝胶电泳检测,方法：,琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、琼脂糖,-,聚丙烯酰胺凝胶电泳和脉冲场凝胶电泳等方法。,,条件：,中性或偏碱性的缓冲系统，,DNA,带负电。,,运动方向：,DNA,经过凝胶分子筛移向正极。,,迁移率影响因素：,DNA,分子的大小和构型，与,DNA,碱基组成和顺序无关。,,检测：,溴化乙锭染色，紫外光下发红色荧光。,,2.6.1,琼脂糖凝胶电泳参数,,凝胶缓冲液和电泳缓冲液,,常用：,TAE,（使用广泛，缓冲容量小）、,TBE(,缓冲能力强，长时间电泳,),、,TPE,（缓冲能力也较强，但由于磷酸盐易在乙醇沉淀过程中析出，所以也不宜在回收,DNA,片段的电泳中

30、使用 ）,,凝胶中琼脂糖含量,,检测大片段,DNA,的含量小，反之则大。,,加,DNA,样品,,一般,1,µg,以下，,多了会使大小接近的,DNA,带不易分开，少了会影响小片段,DNA,带的检测。,,电泳条件,,注意：靠加样孔一侧为负极。,,电压：,1,～,10V/cm,（依据分辨力要求、,DNA,片段大小和电泳时间决定）,,溴化乙锭（,EB,）染色和紫外观察,,注意：溴化乙锭是很强的诱变剂，操作时应带手套！溴化乙锭溶液必须经处理后才能废弃。,,2.6.2 DNA,片段（分子）大小的估算,,将待测,DNA,片段直接与,Marker,比较；,,通过,Marker,的相对迁移距离，推测出待测,D

31、NA,片段的大小。,,M CK 1 2 3 4 5 6,bp,,,2000,,1000,,750,,500,,250,,100,,2.6.3,非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳参数,,制胶的电泳缓冲液：,90nM,Tris,-,硼酸缓冲液,,凝胶丙烯酰胺含量：,按表,2-24,进行,,加,DNA,样品：,加样孔一端为上方。上下电泳槽加入电泳缓冲液，凝胶要完全接触电泳缓冲液，接触处不得有气泡。,,电泳条件：,缓冲液槽在上方为负极，下方为正极，电压,5V/cm,，室温。,,EB,染色和,DNA,片段大小估算（同琼脂糖凝胶电泳）,,2.6.4,脉冲场凝胶电泳（,CHFE,）参数,

32、,缓冲液：,TBE,或,0.5×TBE,，蠕动泵驱动循环。,,凝胶：,用,0.5%TBE,制备的琼脂糖凝胶按图,2-16,装入电泳槽，加入电极缓冲液，超过凝胶,2,～,3㎜,。,,加入,DNA,样品,,电泳条件：,交替改变的电场力，由编程转换装置控制脉冲参数,。,,DNA,的,EB,染色,,DNA,片段大小（分子）的估算：,可检测几百万,bp,的,DNA,片段。脉冲场凝胶电泳分离片段大小及迁移速度的经验公式见表,2-25,。,,2.7 DNA,片段的连接重组,,2.7.1 DNA,连接酶（,DNA,Ligase,）,,DNA,连接酶：,是在,1967,年发现的一种能够催化双链,DNA,片段

33、紧靠在一起的,3’,羟基端与,5’,磷酸基团末端之间形成磷酸二酯键，使两末端连接起来的酶。,,如果是两个或两个以上不同的双链,DNA,片段末端连接，则产生重组,DNA,分子。,,连接酶的主要类型：,,E. coli,DNA,连接酶,,T4 DNA,连接酶,,,DNA,连接酶连接作用的特点,,①,DNA,连接酶需要一条,DNA,链的,3’,－末端有一个游离的羟基（－,OH,），另一条,DNA,链的,5’,－末端有一个磷酸基（－,P,）的情况下，才能发挥连接,DNA,分子的作用。,,②只有当,3’,－,OH,和,5’,－,P,彼此相邻，并且各自位于与互补链上的互补碱基配对的两个脱氧核苷酸末端时，,

34、DNA,连接酶才能将它们连接成磷酸二酯键。,,③,DNA,连接酶不能连接两条单链的,DNA,分子或环化的单链,DNA,分子，被连接的,DNA,链必须是双螺旋,DNA,分子的一部分。,,,④,DNA,连接酶只能封闭双螺旋,DNA,上失去一个磷酸二酯键所出现的单链缺口（,nick,），而不能封闭双链,DNA,的某一条链上失去一个或数个核苷酸所形成的单链裂口（,gap,）。,,⑤由于在羟基和磷酸基团之间形成磷酸二酯键是一种吸能反应，因此，,DNA,连接酶在进行连接反应时，还需要提供一种能源分子（,NAD,＋,或,ATP,）。,,,2.7.1.1 E. coli DNA,连接酶,,E. coli D

35、NA,连接酶只能催化双链,DNA,片段互补黏性末端之间的连接，不能催化双链,DNA,平末端之间的连接。,,2.7.1.2 T4 DNA,连接酶,,T4 DNA,连接酶既可用于双链,DNA,片段互补黏性末端之间的连接，也能催化双链,DNA,片段平末端之间的连接，但平末端之间连接的效率比较低。,,2.7.2 DNA,片段之间的连接,,具互补黏性末端片段之间的连接,,连接时可用,E. coli DNA,连接酶或,T4 DNA,连接酶。,,具平末端,DNA,片段之间的连接,,连接时只能用,T4 DNA,连接酶，且需增加酶量。,,DNA,片段末端修饰后进行连接,,DNA,片段末端同聚物加尾后连接（,

36、末端转移酶,）（,附图,）,,黏性末端修饰成平末端后连接（,核酸外切酶,Ⅶ,）,,DNA,片段,5’,端脱磷酸化作用后连接（,碱性磷酸酶,）（,附图,）,,BAP,（细菌碱性磷酸酶）：,耐热，不易除去，需用酚氯仿抽提，故不常用。,,CIP,（小牛肠碱性磷酸酶）：,不耐热，便于终止反应，常用。,,DNA,片段加连杆后连接,,都具平末端的两种,DNA,片段加连杆后连接。,,分别具平末端和黏性末端的两种,DNA,片段加连杆后连接。,,分别具非互补黏性末端的两种,DNA,片段加连杆后连接。,,,2.7.3 DNA,重组类型,,插入重组,,,,,置换重组,Bam,HI,Bam,HI,Bam,HI,Ba

37、m,HI,Bam,HI,Bam,HI,Bam,HI,,补充内容：重组,DNA,技术基本原理,基本原理,：,目的基因的获取,DNA,导入受体菌,外源基因与载体的连接,克隆载体的选择和构建,重组体的筛选,克隆基因的表达,,,以,,质,,粒,,为,,载,,体,,的,,DNA,,,克,,隆,,过,,程,,谢谢,,,染色体,DNA,：,,10,3,~ 10,6,kb,。是生物界含量最丰富的,DNA,资源，蕴藏着地球上极大部分的遗传信息。,用途：,分离目的基因和基因表达调控因子；提供构建染色体载体和染色体基因整合平台系统。,,,病毒和噬菌体,DNA,：,,种类很多，可在原核和真核生物宿主内大量增殖。,用途：,构建基因克隆载体，承载较大片段的外源,DNA,，经体外包装，导人受体细胞；其编码的结构基因可分离出目的基因及其表达调控因子。,,,质粒,DNA,：,,存在于很多微生物细胞内，游离于胞质（即染色体外遗传物质），,1~,几百,kb,。有复制起始位点，能自我复制。,用途：,构建基因克隆载体；含结构基因的质粒可分离目的基因和表达调控因子。,,,线粒体和叶绿体,DNA,：,真核生物特有的染色体外遗传物质，含有呼吸作用和光合作用相关基因。,用途：,分离目的基因和基因表达调控因子；构建克隆载体。,,,,,MCS,连杆,,,,,,,