同工酶实验ppt课件

《同工酶实验ppt课件》由会员分享，可在线阅读，更多相关《同工酶实验ppt课件（22页珍藏版）》请在装配图网上搜索。

1、单击此处编辑母版标题样式,,单击此处编辑母版文本样式,,第二级,,第三级,,第四级,,第五级,,*,同工酶实验,*,,垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳分离乳酸脱氢酶同工酶,（活性染色鉴定法）,,1,同工酶实验,实验目的,：,理解同工酶的概念及遗传学意义,,学习聚丙烯酰胺凝胶电泳原理,,掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳操作技术,,掌握乳酸脱氢酶同工酶及酶活性染色,,,2,同工酶实验,同工酶,,,,是指能够催化相同的化学反应，但酶分子结构、理化特性乃至免疫,,学性质不同的一组酶。它们是由遗传体系决定的在不同组织中表达,,的蛋白质作用相同,但分子结构、理化特性等不同。,,,,本实验做的是乳酸脱氢酶（,LDH,）的分离

2、鉴定。,,,3,同工酶实验,聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质的原理,,天然状态生物大分子进行的电泳，利用蛋白质分子中所带,净电荷,、,分子质量,、,形状,的差异，而在电场中泳动的速度和方向不同，达到分离的目的。,,,,多数蛋白质的pH在中性偏酸性范围，通常是将样品在碱性缓冲系统中进行电泳，蛋白质分子带负电荷，以不同速度向阳极迁移，称为,阳极电泳,；,,,,对于一些碱性蛋白，使用酸性缓冲系统进行电泳，蛋白质分子带正电荷而向阴极迁移，称为,阴极电泳,。,,4,同工酶实验,夹在两块玻璃板之间的凝胶,电泳缓冲液,电泳缓冲液,加在槽中的样品,分子量小,分子量大,电源,5,同工酶实验,电泳过程中分子迁移的规律

3、，小分子走在前头，大分子滞后。电泳凝胶相当于凝胶过滤中的一个带孔胶粒,。,混合样品,带孔胶,按分子大小分离,电泳方向,电泳,小分子,大分子,6,同工酶实验,聚丙烯酰胺凝胶电泳的类型,相同孔径的凝胶、缓冲系统，是利用蛋白质分子的,主要靠电荷,和,分子筛效应,进行分离。,不同孔径的凝胶和不同缓冲体系的电泳方式，在电泳分离过程中，由于浓缩胶的堆积作用，可使样品在浓缩胶和分离胶的界面上先浓缩成一窄带，对样品进行浓缩，,浓缩效应，,然后在一定浓度或浓度梯度的凝胶上进行分离，既存在,电荷效应,，也有,分子筛效应,。,不连续系统,连续系统,7,同工酶实验,一,、动物组织的样品的获取,,,,二、试剂的配制、仪

4、器的准备,,,,三、分离胶（30分钟）,,,,四、浓缩胶（20分钟）,,,,五、电泳（2-3小时）,,,,六、染色（30分钟）,,,,七、观察结果,,实验流程,8,同工酶实验,1.凝胶储备液,：,,A,储备液,：,pH8.9 Tris~HCl,缓冲液：,1 M HCl 48ml，36.6g Tris,，加 双蒸水到,80ml,，调节,pH,到,8.9,定容到,100ml,。,,B储备液,：,pH6.7 Tris~HCl,缓冲液：,1 M HCl 48ml，5.98g Tris,，加双蒸水到,80ml,，调节,pH,到,6.7,定容到,100ml,。,,C储备液,： 分离胶储备液,（30% A

5、cr/Bis）,：,30g Acr,，,0.8g Bis,，用双蒸水定容到,100ml,，备用，,4℃,存放可以保存1个月。,,D,储备液,： 浓缩胶储备液：,16g Acr，4g Bis，,用双蒸水定容到,100ml,，备用，,4℃,可以保存,1,个月。,,E,储备液,：,10% Aps（W/V）,：,1g,定容到,10ml，-20℃,保存。,,F,储备液,：,40%,蔗糖：,40g,蔗糖溶解到,60ml,双蒸水中。,,TEMED,一、试剂：,9,同工酶实验,2.电泳缓冲液：,,Tris6.0g，28.8gGly 加双蒸水到900ml调节pH到8.3，定容到1000ml，使用 时稀释10倍。

6、,3.乳酸脱氢酶染色剂的配制,,1M,－乳酸钠,0.5ml,,NAD 25mg,,PMS 2mg,,NBT 15mg,,0. 2M Tris－Hcl,溶液,（PH8.0）2ml,,去离子水定容至,50ml,10,同工酶实验,器材,：,,,夹心式垂直板电泳槽，梳子，直流稳压电源（电压300-600V，电流50-100mA），移液枪（各种量程），烧杯（100mL），培养皿,11,同工酶实验,1.电泳槽,,,2.梳子,,,3.制胶器,,,4.夹胶框,,,封胶条,1,2,3,4,12,同工酶实验,取材：鲫鱼若干条，解剖取,眼、鳃、肺、肝、肠、肉、卵 、心脏,，放入冰箱保存。,,,

7、提取酶：取不同组织块，加入提取缓冲液,Tris-Hcl,(,pH=7.0,) 此溶液需,4℃,预冷，组织重量（,g,）与缓冲液体积（,mL,）之比为,１：5,。用研钵研磨充分。浆液,4,℃离心约,30,分钟，,15000,转／分钟。,,,取上清液至新管，吸取其中,150ul,样品，加,100ul,甘油和,10ul,溴酚蓝，混匀之后即可点样。,二、样品的制备,13,同工酶实验,三、分离胶的制备,储备液,A储备液,C储备液,双蒸水,,E储备液,TEMED,总体积,用量（ml）,2.5,5.0,12.5,100ul,,10ul,20,配方表,TEMED,最后一个加入，轻轻混匀，,操作迅速,。胶高度

8、距样品凹玻璃板下缘约,1cm,，用移液枪在凝胶表面沿短玻板边缘轻轻加一层水以隔绝空气，并使胶面平整。,,,水与凝固的胶面有折射率不同的界限，用滤纸吸去多余的水。,,,14,同工酶实验,四、浓缩胶的制备,,TEMED,最后一个加入，轻轻混匀，,操作迅速,。浓缩胶液高度到凹玻璃板下缘,0.5cm,左右，然后插入样品梳，注意不要产生气泡。约30分钟后，凝胶完全。,,,小心拔出样品梳（两端同时向外拔）。,,储备液,B储备液,D储备液,双蒸水,F储备液,E储备液,TEMED,总体积,用量（ml）,1.25,2.5,1.2,5,60ul,,16ul,10,配方表,15,同工酶实验,点样,加样,样品迁移方向

9、,16,同工酶实验,五、电 泳,,,电压和电流：电压180V， 电流流18－30mA；,,,溴酚蓝跑至分离胶末端，电泳结束。,17,同工酶实验,六、染色与观察,揭去上面长型玻璃板，凝胶从短型玻璃板上剥离，慢慢地把胶板冲入白瓷盘或大培养皿内，避光于37度摇床中染30min。,,,观察拍照,18,同工酶实验,m：肌肉（muscle）；l：肝脏（liver）；k：肾脏（kidney）；s：脾脏（spleen）；h：心（heart）； e：眼睛（eye）；f：鳍（fin）；g：鳃（gill）；b：脑（brain）,19,同工酶实验,思考题：,根据实验过程的体会，总结如何做好聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳？哪些是关键步骤？,,为什么要在样品中加入少许溴酚蓝和,甘油,溶液？分别有何用途？,20,同工酶实验,谢谢,21,同工酶实验,附：,分离胶、浓缩胶配方,储备液,A储备液,C储备液,双蒸水,,E储备液,,(APS),TEMED,总体积,用量（ml）,2.5,5.0,12.5,100ul,,10ul,20,储备液,B储备液,D储备液,双蒸水,F储备液,E储备液,,(APS),TEMED,总体积,用量（ml）,1.25,2.5,1.2,5,60ul,,16ul,10,22,同工酶实验,