DNA的提取与鉴定

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1、,单击此处编辑母版文本样式,,第二级,,第三级,,第四级,,第五级,,,,*,单击此处编辑母版标题样式,,,,,核酸,提取与鉴定,一、核酸的理化性质,,核酸可分为核糖核酸,(,简称,RNA),和脱氧核糖核酸,(,简称,DNA),。,DNA,是储存、复制和传递遗传信息的主要物质基础。,,,,1,、核酸的酸碱性质,,核酸含有酸性的磷酸基和碱性的含氮的碱基，因此核酸是两性的电解质，具有等电点。,,,但磷酸基酸性相对较强，所以核酸通常表现为酸性。在一定的,pH,下，核酸能发生两性电离，从而使得核酸带上电荷，具有电泳行为。,2,、核酸的溶解度与黏度,,,DNA,与,RNA,都是极性化合物，都微溶于水，而

2、不溶于乙醇、乙醚、氯仿等有机溶剂。,,DNA,的黏度很大，当,DNA,溶液受热或其他因素作用下，发生双螺旋结构变为无规则线团结构，此时黏度降低，因此可用黏度做为,DNA,变性的指标。,3,、核酸的紫外吸收,,,由于核酸的组成成分是嘌呤碱、嘧啶碱（带有共轭双键）具有强烈的紫外吸收，所以核酸表现出强烈的紫外吸收性质，其最大的吸收峰在,260nm,。,,3,、增色效应,(hyperchromic effect),是指因,高分子结构,的改变，而使,摩尔吸光系数,增大的现象,核酸变性时，双螺旋结构被破坏，嘌呤碱、嘧啶碱暴露出来，其紫外吸收能力增强。,,4,、核酸的变性、复性及杂交,核酸的变性,:,在物理

3、和化学因素的作用下，维系核酸二级结构的氢键和碱基堆积力受到破坏，,DNA,由双链解旋为单链的过程。,,,核酸的降解,:,核苷酸间的磷酸二酯键的断裂,,,引起核酸变性的因素有：高温、强酸强碱,,,有机溶剂、尿素等,,当呈双螺旋结构的,DNA,溶液缓慢加热时，其中的氢键便断开，双链,DNA,便脱解为单链，这叫做核酸的“,溶解”,或,变性,。在适宜的温度下，分散开的两条,DNA,链可以完全重新结合成和原来一样的双股螺旋。这个,DNA,螺旋的重组过程称为,“复性”,。,,,热变性一半时的温度称为熔点或变性温度，以,Tm,来表示。,,DNA,的,G+C,含量影响,Tm,值。由于,G≡C,比,A=T,碱基

4、对更稳定，因此富含,G≡C,的,DNA,比富含,A=T,的,DNA,具有更高的熔解温度。根据经验公式,xG+C =,（,Tm - 69.3,）,× 2.44,可以由,DNA,的,Tm,值计算,G+C,含量，或由,G+C,含量计算,Tm,值。,（二）复性,,变性,DNA,在适当条件下，可使两条分开的单链重新形成双螺旋,DNA,的过程称为复性（,renaturation,）。,,,当热变性的,DNA,经缓慢冷却后复性称为退火（,annealing,）。,DNA,复性是非常复杂的过程，影响,DNA,复性速度的因素很多：,DNA,浓度高，复性快；,DNA,分子大复性慢；高温会使,DNA,变性，而温度过

5、低可使误配对不能分离等等。最佳的复性温度为,Tm,减去,25℃,，一般在,60℃,左右。离子强度一般在,0.4mol/L,以上,。,（二）基因,,基因,(,遗传因子,),是具有遗传效应的,DNA,片段，基因支持着生命的基本构造和性能。,编码区：是可以被转录的区域,,非编码区：不可以被转录的区域,,,密码子,：,遗传密码,(,英文：,Genetic code),是一组规则，将,DNA,或,RNA,序列以三个核苷酸为一组的密码子转译为蛋白质的氨基酸序列，以用于蛋白质合成。,,起始密码子为,AUG(,甲硫氨酸,),；终止密码子：,UAA,、,UAG,、,UGA.,细胞,DNA,的提取,过程,：,,,

6、,裂解：,破碎细胞，使细胞中的核酸游离在裂解体系中,,纯化：,使核酸与其它杂质彻底分离，如蛋白质、盐等,,总原则：,①应保证核酸一级结构的完整性；,,②排除其它分子的污染。,鉴定：,浓度、纯度、分子量、测序,,（技术：分光光度技术、凝胶电泳技术等）,1,、植物样品,,,新鲜组织,先用无菌生理盐水洗；,,干药材除去霉点，无菌水浸洗；,,（一）样品预处理（获取分散细胞）,,,,捣碎或剪碎；加,液氮,研磨成粉状。,2,、动物样品,（,1,）组织样品：,新鲜样品,，生理盐水洗，直接使用（或分装、,-70℃/,液氮低温保存）；,甲醛固定组织,要先去掉甲醛；,石蜡包埋组织,要经过组织切片和二甲苯脱蜡等处理

7、。,（,2,）血细胞样品：,（,3,）培养细胞：,,离心，弃细胞培养液；,,用缓冲液多次漂洗；,来源：,新鲜血液或者冻贮血液；,抗凝剂：,一般用,EDTA-Na,2,或,柠檬酸钠（枸橼酸钠 ），,不可使用,肝素；,,分离：,红白细胞，一般用明胶，加缓冲液悬浮白细胞。,（血清,DNA,是研究肿瘤的材料之一）,,3,、微生物培养物样品,,,离心获取菌体细胞，,,加缓冲液洗涤，,,加缓冲液悬浮菌体细胞。,4,、微生物混合样品,,,用缓冲液悬浮菌体，低速离心，沉淀杂质。,,高速离心获取菌体细胞。,,用缓冲液洗涤菌体细胞。,,加缓冲液悬浮菌体细胞。,（二）提取用具预处理,1,、,DNA,提取用具的处理,

8、,要求无菌；试剂、器材高压干燥等进行无,DNA,酶处理。,2,、,RNA,提取用具的处理,要求无菌，防止二次污染。,,RNA,易被,RNase,水解，,RNase,无处不在且耐高温，提取条件要求严格。,,二、真核生物基因组,DNA,的常规提取,裂解细胞，溶出,DNA,除去杂质,重新溶解,DNA,沉淀、浓缩,DNA,,⒈,破碎细胞，溶解,DNA,：,,用提取液（裂解液）破坏细胞壁、细胞膜和核膜。,,,微生物样品提取液：含表面活性剂,SDS,、溶菌酶等,,动物样品提取液：含,SDS,、蛋白酶,K,等,,植物样品提取液：含,CTAB,,,核酸酶可被,Ca,2+,、,Mg,2+,等激活，提取液均含有螯

9、合剂（如,EDTA,，柠檬酸等），螯合这些离子。,2,、除去杂质（主要是蛋白质）,,（,SDS,，破膜、蛋白质变性沉淀）,——,苯酚抽提蛋白质,——,氯仿抽提、萃取苯酚,,,经离心后溶液分为三层：上层是核酸溶液、中间不溶物为变性蛋白质，下层是苯酚氯仿溶液。,蛋白质,苯酚氯仿,核酸溶液,3.,沉淀,DNA,,有机溶剂沉淀,DNA,：,2,倍体积无水乙醇（或,1,倍体积的异戊醇）,,,再用,75%,乙醇清洗多次。,,,4.,重新溶解,DNA,,将,DNA,溶于水或,TE,溶液。,DNA,提取的一般流程,（一）核酸浓度检测,OD,260,＝,1,时（比色皿厚度,1.0cm,）,,双链,DNA,浓度为

10、,50 μg/ml,，,,单链,DNA,或,RNA,浓度为,40 μg/ml,。,,,DNA(μg/ml) = OD,260,×50,,RNA,（,μg/ml,）,= OD,260,×40,二,、,核酸的鉴定,（二）核酸纯度检测,（,紫外吸收法,）,核酸在,260 nm,处有吸收峰，蛋白质在,280 nm,有吸收峰,,核酸的纯度用,OD,260,/OD,280,比值表示。,,DNA,样品：,,OD,260,/ OD,280,,＝,1.8,，,DNA,纯度高,,OD,260,/ OD,280,> 1.8,，含,RNA,，或,DNA,部分降解,OD,260,/ OD,280,< 1.8,，含苯酚或

11、蛋白杂质,,RNA,样品：,,,OD,260,/ OD,280,,＝,1.8~2.0 —RNA,纯度高,,,< 1.8,，含蛋白杂质；,> 2.0,，,RNA,出现降解,（三）核酸完整性检测,核酸样本的完整性和分子量可通过琼脂糖凝胶电泳测定（,RNA,常采用甲醛琼脂糖变性凝胶电泳），溴化乙锭染色，紫外灯观察。,凝胶上,RNA,存在处可观察到清晰的条带。完整性良好的总,RNA,应该清晰地看到,28s rRNA,、,18s rRNA,、,5s rRNA,的三条带，其中,28s rRNA,的亮度应为,18s rRNA,的两倍，,5s rRNA,较弱。,电泳：带电颗粒在电场的作用下发生迁移。,根

12、据电泳支持介质分为,琼脂糖凝胶电泳：,,多用于鉴定较大核酸片段（,0.1~60 kb,）,,,聚丙烯酰胺凝胶电泳：,,用于鉴定较小的核酸片段（,50~1000 bp,）,电泳,琼脂糖凝胶电泳,琼脂糖是从琼脂中提纯出来的一种多糖。凝胶具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度，低浓度的琼脂糖形成较大的孔径，而高浓度的琼脂糖形成较小的孔径。,琼脂糖浓度,(,％,),线型,DNA,分子的分离范围,(kb),0.3,5,～,60,0.6,1,～,20,0.7,0.8,～,10,0.9,0.5,～,7,1.2,0.9,～,6,1.5,0.2,～,3,12.0,0.1,～,2,琼脂糖凝胶电泳有许多优

13、点：,,操作简单，电泳速度快，分离核酸范围广；,,电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好；,,电泳后区带易染色，便于定量测定；,,可用于核酸的纯化和分离（电洗脱法）；,,可制成干膜可长期保存。,,RNA,可以使用非变性或变性凝胶电泳进行检测。,,在非变性电泳中，可以分离混合物中不同分子量的,RNA,分子，但是无法确定分子量。,,RNA,变性电泳：,,RNA,为单链分子，局部形成发卡结构，直接电泳无法确定分子量。,,只有在变性情况下，,RNA,分子完全伸展，迁移率才与分子量成正比。,,方法：,,,电泳前样品保温,60℃,，,RNA,分子伸展。,,凝胶中加有甲醛，使,RNA,在电泳过程中保持单链结构。,操作流程大致为：,,,凝胶的制备→加样→电泳→染色→观察和拍照,电泳缓冲液：,TAE,、,TBE,（用于电泳和制胶）,上样缓冲液：,制胶,加样,