荧光定量PCR技术在临床诊断中的应用

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1、单击此处编辑母版标题样式,,单击此处编辑母版文本样式,,第二级,,第三级,,第四级,,第五级,,,,*,单击此处编辑母版标题样式,,单击此处编辑母版文本样式,,第二级,,第三级,,第四级,,第五级,,,,*,单击此处编辑母版标题样式,,单击此处编辑母版文本样式,,第二级,,第三级,,第四级,,第五级,,*,,*,,,单击此处编辑母版标题样式,,单击此处编辑母版文本样式,,第二级,,第三级,,第四级,,第五级,,*,,*,荧光定量PCR技术在临床诊断中的应用,,,,,,,九十年代中期,PCR,临床应用在国内全面展开,,1998,年 荧光定量,PCR,技术开始在中国应用于临床检测,,PCR,发展

2、简史,PCR,,(Polymerase,,Chain Reaction),1983 Cetus,公司的,Kary Mullis,于,12,月,16,日第一 次成功实验发明了,PCR,,1985,关于,PCR,的文章首次由,Kary Mullis,及其同事等人 在,《Science》,上 发 表,,1989 12,月,《Science》,杂志将,PCR,和它所使用的,Taq DNA,聚合酶命名为第一个“年度分子”。,,1993 Kary Mullis,，,Nobel Prize in Chemistry,,,,1995 Perkin Elmer,公司研制出荧光定量,PCR,技术,,,,,循

3、环次数,DNA,的链数,,1,,2,1,2,,2,,2,2,4,,3,,2,3,8,,10,,2,10,1024,,20,,2,20,1,048,576,,30,,2,30,1,073,741,824 10,亿,,,PCR,循环次数与,DNA,产量关系,PCR,循环,PCR,特点：高效扩增、忠实复制,,灵敏度高,,快捷,,简便,,对样品纯度要求低,,可以相对定量,,PCR,反应的特点,Ct,值的意义,Ct,值与重复性,,同一样本在相同条件下同时进行,96,次扩增,FQ-PCR,Ct,值与浓度,,不同的模板达到荧光域值时的,Ct,值不同,,,感染性疾病的诊断,,母婴传播的控制与观察,,遗传疾

4、病的诊断,,肿瘤的诊断,,法医学鉴定,荧光定量,PCR,的临床应用,早期诊断 （超早期诊断）,,,病情评估和预后判断,,,抗病毒药物疗效的观察、指导,,,新药验证,一 感染性疾病,,,1.,病原体含量与病情之间的关系,,,2.,病原体含量与用药之间的关系,,,3.,药物及疗法的研究与开发,,,4.,新的病原体分子诊断标准,,,5.,新的愈后指标,,,6.,传染病发病的监控、预测与预防,,临床应用,临床应用,,二 肿瘤,(HPV-,宫颈癌；,EBV-,鼻咽癌；,HP-,胃癌,),,,1.,肿瘤标志物：癌胚抗原、同功酶、抗体、激素、细胞因子、受体等,,,2.,肿瘤相关基因表达的检测：包括癌基

5、因抗癌基因、肿瘤转移基因及转移抑制基因,遗传病,,（,a,、,b-,地中海贫血、唐氏综合症、性别连锁遗传病,）,,1.,等位基因检测,,2.,多基因遗传病的突变检测,,3.,基因表达异常所致遗传病检测,,荧光定量,PCR,在病原体检测中的应用,一 肝炎病毒定量检测,,二 性病病原体检测,,三 结核杆菌及呼吸道病原体检测,,四 优生优育,(TORCH),相关项目检测,,,临床应用,肝炎病毒定量检测,,HBV,,HCV,临床应用,（一） 乙型肝炎病毒结构及特点,HBsAg,：,是,HBV,感染的主要标志,,HBsAb,：,保护性抗体,,,HBcAg,：,仅存于感染的肝细胞核内，,,一

6、般不存在于血循环中,,HBcAb:,非保护性抗体，,HBcAb-IgM,,提示,HBV,处于复制状态,,,HBeAg,：,HBV,复制及强感染性的指标,,HBeAb,：,有一定的保护作用，预后良好,HBV,HBV,（二）,HBV-DNA,与“两对半”,1. “,两对半” ：机体的免疫反应状态；,2. “,携带者”、“大三阳”、“小三阳”等免疫学指标不能,,,反应体内病毒复制水平与感染程度。,,FQ-PCR,：检测的是,HBV,本身的遗传物质,—DNA,，是,,,病毒存在和复制的最可靠、最直接的指标。,,3.,血清学指标,(,－,),不能排除,HBV,感染,。,,,,,,HBV,（二）,HB

7、V-DNA,与“两对半”,HBsAg(,－,),,,HBV-DNA(,＋,),,,HBeAg (,－,),,HBV-DNA(,＋,),,4.,也可能出现,HBsAg(,＋,),，,HBV-DNA(,－,),。,,5. HBsAb (,＋,),、,HBcAb (,＋,),、,HBeAb (,＋,),三抗体阳性,,,与,HBV DNA 2.5×,10,3,copy,/ml,结果解释。,HBV,(,三,),,HBV-DNA,定量检测的临床意义,3. HBV-DNA,定量与预后,,,a.,含量高者急性肝炎患者易慢性化,,,b.,癌变的几率明显高于含量低者,,1. HBV-DNA,定量与,HBV,复制

8、水平及传染性,,2. HBV-DNA定量与乙肝药物疗效,,,a. 专家提出<10,3,copy /ml做为阴性或临床治愈标准,,b. HBV-DNA定量分析与,干扰素,治疗(前、中、后),,c.,拉咪呋啶,HBV,感染与,干扰素,治疗,治疗前：,,,a:,治疗前,HBV,低水平复制者对干扰素的反应性明,,,显优于高水平复制者。,,b:,治疗前,HBV DNA,含量特别高者大多没有疗效。,,c: HBsAg,转阴的几乎都是那些治疗前血清,HBV,,DNA,含量较低者。,HBV,感染与,干扰素,治疗,治疗中：,,a:,病毒复制水平迅速降低者，有望治愈。,,,b:,相反，治疗期间,HBV DNA

9、,复制水平下降较慢，,,,或下降幅度较小，或者变化不明显者，大多是,,,干扰素治疗无效。,HBV,感染与,干扰素,治疗,治疗后：,,,a:,治疗结束后，采用,PCR,定量法检测，,HBV,,DNA <10,3,copy/ml,者，可能不再复发。,,b:,终止治疗后,HBV DNA,仍保持较低水平者，,,,反跳的可能性较大。,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,ALT,Months after Start of Therapy,0,Normal Alt,,治疗前,1,2,3,4,5,6,12,24,,,,,,,,,,,,,,,,

10、,,,,HBV DNA,HBe Ag,HBs Ag,Poor Response to IFN Therapy,CHRONIC HEPATITIS B,,拉咪呋啶：,,,有显著降低高病毒载量作用，近期疗效颇有优势，但是长期使用可导致HBV变异，患者易出现耐受性，而且容易出现停药后反弹。,,HBV感染与,拉咪呋啶,治疗,0,,-20,,-40,,-60,,-80,,-100,,治疗周数,拉米夫定,安慰剂,血清,HBV DNA;,,中位,%,变化,0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52,,,,,,,,,,,,

11、,,,,,,,,,,,,,,,,,,n=192,,n=404,n=171,,n=359,,拉米夫定抑制血清,HBV DNA,HBV,(,三,),,HBV-DNA,定量检测的临床意义,4. HBV-DNA,定量有助于指导怀孕与孕期，哺乳期检查,5.,肝脏移植与,HBV-DNA,Mazzaferro,等报告：,< 10,3,copy /ml,无一例再发肝炎,,>10,5,copy /ml,发生了严重,HBV,再感染,6.,血液制品和献血员的筛选,病毒特点：,,1.,单正链,RNA,病毒,,2. E1,和,E2,区基因高度变异性,（一）丙型肝炎病毒特点,HCV,感染特点：,,HCV,在血中含量极微,

12、；,,输血后肝炎主要致病因子,；,,免疫学标志仅有抗,-,HCV,，非中和抗体，产生时间不一,；,,有一部分人感染,HCV,后，不产生抗,-,HCV ；,,感染易于慢性化,(50-85%)；完全康复者仅19.3%；,,疫苗研制尚不成功,;已经有4000万感染者，占3.2%。,,单链,RNA,(,二,),,HCV,-RNA,定量检测的临床意义,1.,早期诊断,,,a.,临床以,< 80 copy/ml,做为无感染或治愈标准。,,b. HCV,感染,1-3W,，即可检出,HCV-RNA,的存在。,,c.,严格筛选献血员,,,提高对窗口期感染者的检出率。,,d.,医疗纠纷中的“举证倒置”，病人入院前

13、后进行,HCV,-RNA,检测。,,,,,,HCV,HCV,(,二,),,HCV-RNA,定量检测的临床意义,2. HCV-RNA,载量与抗,-HCV,滴度、,ALT,水平之间的相关性。,,,抗,-HCV,滴度和,ALT,异常率随着,HCV-RNA,载量升高而增加,。,,3. HCV-RNA,是评价抗病毒治疗效果的重要指标。,4.,慢性丙型肝炎长期抗,-HCV,阳性，这时如果进行,HCV-RNA,,,定量检测可以鉴别活动性、复制程度。,二　常见性传播疾病病原体,一　淋球菌（,NGH,）,,二　沙眼衣原体（,CT,）,,三　解脲脲原体（,UU,）,,四　梅毒螺旋体（,TP,）,,五　单纯庖疹

14、病毒（,HSV,）,,六　乳头瘤病毒（,HPV,）,,七　人类免疫缺陷病毒（,HIV,）,,八,EV71 A16,通用型,,STD,艾滋病,,,,,艾滋病是英文,AIDS,（,Acquired Immunity Deficiency Syndrome),的中文译音，全称是“获得性免疫缺陷综合征”。它可以由人类免疫缺陷病毒（,HIV,Human-being Immunity Deficiency Virus,），又称艾滋病病毒引起的疾病。当病毒侵入人体后，经一段时间的潜伏期，破坏人体的免疫力，从而发病，病死率高，是一种严重的传染病。,,艾滋病是一种有明确病原体的可通过人之间一定传播途径传播的慢性

15、传染病，属于,《,传染病防治法,》,中规定的乙类传染病,,HIV,病毒：多亚型和多变异,HIV-1,和,HIV-2,,M,组、,O,组和,N,组,,亚性型：,A-K,,CRF,：基因重组亚型，主要是,HIV-1,型,,毒株亚型监测的意义,,,不同亚型与不同传播途径的关系：,B,主要通过男性同性性行为和静脉注射吸毒传播，,C,主要异性性接触传播,,,流行地理和传播线路的分析：东南亚区域的,C,亚型和,B,亚型,,,重组亚型传播效力变化及对流行的影响：东欧的,B/A,重组流行、泰国的,A/E,重组,,艾滋病病毒在外界的抵抗力,HIV,病毒一旦离开宿主细胞在外界环境中生存能力很快消失,,,HIV,对

16、环境中的物理因素和化学因素抵抗力均较弱，比乙型肝炎病毒（,HBV,）的抵抗力低得多,,,对,HBV,有效得消毒和灭活方法均适用于,HIV,,,典型进展者：,8-10,年潜伏期后成为艾滋病人，,80% -90%,,,快速进展者：,CD4,细胞,2-5,年内迅速下降，,HIV,病毒载量一直维持较高水平，而且分离的,HIV,有均一性。,,,长期存活者（又称长期不进展者）：维持,15,年以上，而且,CD4,计数维持正常，在所有感染者中比例一般在,8%-10%,。,,,HIV,感染的三种结局,艾滋病的诊断,HIV,感染者：确定,HIV,感染的个体,,,抗体检测：初筛和确认,,,辅助诊断,,,艾滋病病人：

17、临床诊断标准见国家标准,《HIV/AIDS,的诊断标准和防治原则,》,,GB16000-1995,,,荧光定量,PCR,的应用为艾滋病的初筛和辅助,,,检查提供了有力的工具,NGH,淋球菌感染与致病,1.,人是淋球菌的惟一宿主。,2.,发病率最高，在所,STD,疾病中，高达,60%,左右。,3.,发病趋势：,,a.,男性多于女性。,,b.,城市走向农村，,,c.,高收入阶层向低收入阶层扩展,4.,人对淋球菌感染无天然抵抗力，免疫不持,,,久，再感染和慢性患者普遍存在。,,5.,如母亲为淋病患者，婴儿出生时易患上淋球菌性结膜炎,CT,沙眼衣原体感染与致病,1.,严格的细胞内寄生。,2.,不仅可致

18、眼部感染、肺部感染、,也是,STD,的主要,,,病原体。,3.,近年来在欧美等国，沙眼衣原体的感染率和危害,,,性已超过淋球菌而居,STD,之首。,4.,在我国，在非淋球菌性尿道炎中，居首位。,5.,泌尿生殖道感染，妨碍妊娠。,6.,盆腔感染，可致生殖能力损害。,UU,解脲脲原体感染与致病,合成尿素酶，分解尿素,,2.,在非淋球菌性尿道炎其感染率仅次于衣原,,,体感染，居第二位。,3.,流产超过,4,次以上者，检出率高达,80%,。,4.,有,30-40%,男性尿道炎是由感染,UU,所致。,5.,与男性不育相关。男性不育患者精液中，脲原体检出率高达％。检出率随精子数减少和精子活动力下降而升高。

19、,,1.,非培养或形态学检查的诊断技术，快速、特异、敏感。,,2.,对无症状或症状轻者，可以早期确诊。,,3.,对,NGH,、,CT,、,UU,等混合感染者，诊断和鉴别诊断。,,4.,指导用药、考核疗效。,,,,荧光定量,PCR,诊断,NGH/CT/UU,的意义,NGH/CT/UU,NGH/CT/UU,荧光定量,PCR,诊断,NGH/CT/UU,的意义,5.,不孕不育、优生优育。,,6.,流行病学调查，为性传播疾病的监控提供依据。,,7.,,CT,、,UU,是,FDA,批准的,PCR,检测试剂盒，可作为首选,,,方法，在临床推广应用。,,人乳头瘤病毒感染与致病,1. HPV,具有宿主和组织特

20、异性，只能感染人的皮肤和黏膜上皮细胞，人是,HPV,的惟一宿主。,,,2.,有,100,多个型。,,,3.,低危型：,HPV 6,、,11,引起良性病变,(,尖锐湿疣,、喉乳头瘤等,),,HPV,人乳头瘤病毒感染与致病,HPV,4.,高危型：,HPV 16,、,18,引起恶性肿瘤,(,宫颈癌,、,,肛门癌、口腔癌等,),,,5.,免疫原性低，易形成持续性感染。,,,6.,新生儿产道感染。,HPV,1.,对典型病例可以明确诊断。,,2.,对临床表现和组织病理改变都不典型的病例同样可以做出诊断。,,3.,对亚临床和隐性,HPV,感染做出诊断。,,4.,基因分型。,,5.,考核疗效与预后。,,6.,

21、病毒载量与患癌症风险,。,,,,HPV,,荧光定量,PCR,检测,HPV,的意义,HPV,检测方法,二代杂交捕获,HC-II,（核酸杂交检测）,,,原理：在分子水平采用基因杂交,-,化学发光,-,信号放大的 检测技术,,,,高危型：混合探针,(,鸡尾酒探针,),,13,种：,16,、,18,、,31,、,33,、,35,、,39,、,45,,51,、,52,、,56,、,58,、,59,、,68,型,,,低危型：,5,种：,6,、,11,、,42,、,43,、,44,型,,,唯一获美国,FDA,认证可用于临床的,HPV DNA,检测技术,,,已获欧洲,CE,及中国,SDA,认证,,HC-II,

22、基本原理与实验步骤图示,,原理,是利用对抗体捕获信号的放大和化学发光信号的检测,,计算机,,判读,,15 min后,DNA-RNA,,杂交,,60 min,抗体,,捕获,,60 min,化学发光检测,,30 min,DNA,,分解,,45 min,特点：,,,检测方法简单且效率高,,,,,,高危HPV检测敏感度高（98%）,,比细胞学具有更高的敏感度,,,,,,高的阴性预测值（99%）,,,如,HPV DNA,检测阴性，该妇女在5～10年内患宫颈癌的机会几乎为零,,有 统一的临床判定标准（≥1.0pg/ml为阳性）,重复性好,,操作不受采集样本的影响，不受操作环境的误差影响,,,,,检测范围：

23、,,,可同时检测,13,种高危型,HPV,：,16,，,18,，,31,，,33,，,35,，,39,，,,45,，,51,，,52,，,56,，,58,，,59,、,68(,与,HSIL/,癌有关,),,荧光定量,PCR,有其优于普通,PCR,的特点，可以与,第二代杂,,,交捕获,(HC),试验,一起用于粗筛高风险人群,.,HPV,手足口病（,hand-foot-mouth disease,，,HFMD,）,为全球性传染病，世界大部分地区均有流行的报道。,,1957年在加拿大首次报告，新西兰Seddon于1957年最早加以描述，1958年加拿大Robinson从患者粪便和咽拭中分离出CoxA

24、16，同时患者血清抗体有四倍增长,初步查明CoxA16为本病病原；,,1959年提出HFMD命名，HFMD在全球广泛流行，无明显的地域分布。,,之后世界各地均经常发生由各型柯萨奇、埃可病毒和EV 71引起的手足口病流行。,,发热, 不适, 咽喉肿痛, 口腔、手、脚侧面及掌心、屁股出现小泡,,传染性极高,,病程约1周,,HFMD,的,病原,手足口病可由多种肠道病毒所引起，其中包括,,CoxA5,A10, A16, A19, EV71,以及部分埃可病毒和柯萨,,奇B组病毒, 以CoxA16 和 EV71最为常见,,传播途径: 粪-口途径传播,:,唾液与粪便;,,呼吸道传播,:,空气飞沫;,,接

25、触传播,,,疱疹液中含大量病毒，疱疹破溃后病毒排出。,,HFMD为全球性传染病，在全球广泛分布，无明显的地域分布, 但,,近年EV71在东南亚一带流行, 引起较多的重症和死亡病例。,,在80年代和90年代，中国手足口病的流行主要以,,CoxA16为主，2008年，CoxA16 和EV71 共循环引起手,,足口病爆发, EV71在大部分省市为优势病毒。,,,人肠道病毒感染的一般致病机制,,进入途径,口腔/呼吸道,咽喉及下肠胃道,传播,扁桃体,、,深层淋巴结,、,肠道淋巴结,微病毒血症,先天性感染,神经系统,心,脏,肝脏,、,,胰脏、,,肾上腺,呼吸系统,皮肤及黏膜,病毒血症,神经系统,抗体产生

26、,、,病毒血症消失,，,病毒感染症状改善,飞沫、接触、饮食,肌肉,致病特点,①,隐性感染多见，很少引起腹泻，婴幼儿、免疫力低下的成人易感。,,,②,病毒在机体肠道中增殖,，,很少引起肠道症状，是以消化道为原发灶的全身感染。,,③,不同人肠道病毒可引起相同症状，同一种人肠道病毒可引起不同临床表现。,,④,感染过程中形成病毒血症。,,中国,HFMD,的流行,1981,年，我国在上海首次报道了,HFMD,病例,,1987,年在中国分离到,CVA16,,1995,年以来，我国陆续在武汉、深圳、上海、重庆、山东和安徽等地的,HFMD,患者中分离到,EV71,病毒。,,2007,年，山东,发生了手足口病爆

27、发流行,，累计,报告,HFMD,病例,39,，,606,例，其中,14,例病例死亡。实验室检测发现,EV71,是引起山东临沂,HFMD,的主要病原，同时还检测到,Echo3,和,/,或,CVA16,。,,2008,年全国出现,HFMD,爆发流行,,,以,HEV71,为优势,,CVA16,还有其它,EV,共循环引起,,加强,HFMD,病原检测和监测的十分必要,,依据台湾,1998-2008,和中国大陆,2007-2008,年的经验,,,,,掌握手足口病病原谱，特别是,EV71,感染所占的比例，对析,,,,判断,HFMD,疫情导致重症和死亡的比例有重要的科学参考价值。,手足口病的实验室检测,手足口

28、病的诊断一般是通过采集适当的临床标本后进行基因检测、抗原检测、血清学抗体检测、病毒分离和病毒鉴定，如果没有采到合格的临床标本，或无法进行实验室检测。,,,很多血清型的肠道病毒能引起手足口病，不同细胞系对不同病毒的敏感性是有所不同的，而不同时期肠道病毒的流行株也不同。,,,通常用于肠道病毒分离的细胞系为,RD,、,HEp-2,、,Vero,等，联合使用上述的两种或更多细胞有助于分离到更多的肠道病毒。,,,病毒实验室检测类型,-,病毒实验室诊断方法,检测抗体,/,抗原,检测病毒,检测核酸,,ELISA/HI/PA,蛋白印迹,病毒分离,ELISA,电镜,中和试验,RT-PCR,实时荧光定量,PCR,

29、套式,PCR,LAMP,免疫荧光,基因芯片,每种方法,,各有优势,,,,依据病毒,,来定检测策略,New molecular tools,,for epidemiology,,studies and diagnosis,三　结核杆菌与呼吸道病原体检测,TB,：,Tubercle bacilli,,CP,：,Chlamydia pneumonia,,MP,：,Mycoplasmal pneumonia,,SARS,：,severe acute respiratory syndrome,,H1N1,甲型流感,,呼吸道合胞病毒,,ＥＢ病毒,,Ｈ７Ｎ９禽流感病毒（２０１３.０５.２１）,,结核杆菌流行

30、现状（,1,）,罗伯特,·,科赫（１８４３,——,１９１０），德国细菌学家，结核杆菌发现者,,结核病是一个全球性的问题，近年来在世界范围内出现流行，且呈增长的趋势,,TB,结核杆菌流行现状（,2,）,我国结核病的疫情仅次于印度而居世界第二位,,2000,年，全国人口结核感染率为,44.5%,，其中,15,～,44,岁人群占了,53,％ ，每年约有,25,万人死于结核病,结核杆菌引起的感染,,肺部感染：原发性肺结核，开放性肺结核。,,,肺外感染：脑、肾、骨、关节、生殖结核、肠结核、结核性腹膜炎、全身性结核。,,常规结核病实验室诊断方法及不足,1.,痰涂片作抗酸染色：,阳性率低 、费时,,2.,细

31、胞培养“金标准”：,周期太长,(3-4W),,3.,血清学诊断：,,,a.,接种,BCG,可出现阳性,,b.,不能区分活动性结核病和治愈后留下损伤灶的病人,,c.,交叉反应，假阳性,,不能早期诊断！容易漏诊、误诊！,TB,荧光定量,PCR,检测,TB-DNA,的意义,1.,能稳定检测,10copy,的,TB-DNA,，灵敏度高 ，特异性强,,,2.,早期、快速、准确地诊断结核病。,,,痰液、肺及支气管灌洗液,——,肺结核,,,血液,——,播散性结核和各脏器的结核病,,,脑脊液,——,中枢神经系统结核病,,,宫颈拭子、尿道拭子,——,泌尿生殖道结核病,TB,3.,荧光定量,PCR,检出结核杆菌阳

32、性率显著高于痰涂片抗酸染色和改良罗氏培养法。,,,,4. TB-DNA,浓度可用于判断疗效：,,,痰标本中结核杆菌的数量呈逐渐下降趋势 ，,TB-DNA,拷贝数下降。根据病原体,DNA,浓度，对药物治疗及疗效观察提供参考依据,TB,荧光定量,PCR,检测,TB-DNA,的意义,CP,、,MP,感染可致咽炎、支气管炎和肺炎，潜伏期约,2-3,周，通常起病较缓慢。持续性咳嗽。,,肺炎衣原体,(CP),、肺炎支原体,(MP),感染与致病,CP/MP,MP,肺炎约占非细菌性肺炎的,1/3,以上，或各种原因,,,引起的肺炎的,l0,％。,,MP,感染与小儿支气管哮喘密切相关。,CP,感染与冠心病存在密切

33、的关系,,肺癌、支气管扩张患者中,CP,感染率相对,较高,,荧光定量,PCR,用于非典型性肺炎的诊断,,意义：,1.,直接检测病原体，早期、快速、特异诊断非典,,,型性肺炎。,,2.,治疗方案与细菌、病毒感染的治疗方案不同,,3.,流行病学调查。,,,,,TB,、,MP,、,CP,已被许多医院尤其是妇幼保健医院和儿童医院纳为肺部感染的常规检测项目,,,MP/CP/SARS,甲型,H1N1,流感,,流行性感冒简称流感，是由甲、乙、丙三种流感病毒引起的急性呼吸道传染病。甲型流感病毒根据其表面,(H,和,N),结构及其基因特性的不同又可分成许多亚型，至今甲型流感病毒已发现的血凝素有,16,个亚型,(

34、H1-H16),，神经氨酸酶,9,个亚型,(N1-N9),。,,,“,猪流感”更名为“甲型,H1N1,流感”,,世界卫生组织,4,月,30,日宣布，从当日起，该组织不再使用“猪流感”一词指代当前疫情，而开始使用“,A,（,H1N1,）型流感”一词。与之相对应，我国的官方文件从,5,月,1,日起相继用“甲型,H1N1,流感”代替原来的“人感染猪流感”。,,世界卫生组织发言人说，之所以更改叫法，是因为“猪流感”一词容易误导消费者，美国和墨西哥等国的猪肉及猪肉制品已明显受到其他国家进口禁令影响。,,世界卫生组织的声明说，根据目前掌握的科学依据，此次流行的病毒仅在人际间传播，尚无证据表明它在猪群内传播

35、，或由猪向人传播，也无证据表明人因食用猪肉或相关产品染病。,,病 原 学,,甲型,H1N1,流感病毒属于正粘病毒科，典型病毒颗粒呈球状，直径为,80 nm~120 nm,，有囊膜。囊膜上有许多放射状排列的突起糖蛋白，分别是血凝素,HA,、神经氨酸酶,NA,和,M2,蛋白。病毒颗粒内为核衣壳,,,呈螺旋状对称,,,直径为,10nm,。甲型,H1N1,流感病毒为单股负链,RNA,病毒，基因组约为,13.6 kb,，由大小不等的,8,个独立片段组成。,,,流行,病,学特点,传染源,,主要为病猪和携带病毒的猪，感染猪流感病毒的人也被证实可以传播病毒。感染这种病毒的动物均可传播。,,传播途径,,主要为呼

36、吸道传播，也可通过接触感染的猪或其粪便、周围污染的环境或气溶胶等途径传播。某些毒株如,H1N1,可在人与人之间传播，其传染途径与流感类似，通常是通过感染者咳嗽或打喷嚏等。,,易感人群,,普遍易感。患者多数年龄在,25,岁至,45,岁之间，目前报道以青壮年为主，应注意老人和儿童。,,,临床表现,潜伏期一般,1,至,7,天左右，较流感、禽流感潜伏期长。,,,,,,人感染,甲型,H1N1,流感后的早期症状与普通人流感相似，包括发热、咳嗽、喉痛、身体疼痛、头痛、发冷和疲劳等，有些还会出现腹泻或呕吐、肌肉痛或疲倦、眼睛发红等。,,,,,部分患者病情可迅速进展，来势凶猛、突然高热、体温超过,39℃,，甚至

37、继发严重肺炎、急性呼吸窘迫综合征、肺出血、胸腔积液、全血细胞减少、肾功能衰竭、败血症、休克及,Reye,综合征、呼吸衰竭及多器官损伤，导致死亡。,实验室检查,外周血象：白细胞总数一般不高或降低。重症患者多有白细胞总数及淋巴细胞减少，并有血小板降低；,,血清学诊断：可使用间接,ELISA,、抗原捕捉,ELISA,、荧光免疫法等；,,反转录,-,聚合酶链式反应（,RT-PCR,）：由于,PCR,技术具有简便、快速、灵敏、特异性强等特点，已用于猪流感病毒基因的检测和分子流行病学调查等；,,4,,病毒分离：从患者呼吸道标本中（咽拭子、口腔含漱液、鼻咽或气管吸出物、痰或肺组织）分离,甲型,H1N1,流感

38、病毒。常用的方法有鸡胚接种法和细胞培养法。现有的诊断方法中，病毒分离法是较敏感的，但需要,2-3,周时间。,人感染猪流感的诊断标准,医学观察病例：曾到过甲型,H1N1,流感疫区，或与病猪及甲型,H1N1,流感患者有密切接触史，,1,周内出现流感临床表现者。列为医学观察病例者，对其进行,7,天医学观察（根据病情可以居家或医院隔离）。,,2,疑似病例：曾到过疫区，或与病猪及甲型,H1N1,流感患者有密切接触史（也可流行病学史不详），,1,周内出现流感临床表现，呼吸道分泌物、咽试子、痰液、血清,H,亚型病毒抗体阳性或核酸检测阳性。,临床诊断病例：被诊断为疑似病例，且与其有共同暴露史的人被诊断为确诊病

39、例者。,,确诊病例：从呼吸道标本或血清中分离到特定病毒；,RT-PCR,对上述标本检测，有甲型,H1N1,病毒,RNA,存在，经过测序证实，或两次血清抗体滴度,4,倍升高，可确诊为人感染甲型,H1N1,流感。,四,TORCH,感染特点与检测,TOX :,Toxoplasma  gondii,,RV:,Rubella virus,,,CMV:,Human cytomegalovirus,,HSV:,Herpes simplex virus,TORCH,TORCH,感染特点,,,,,1.,母,-,胎传播的主要病原体,,,2.,引起胎儿畸形新生儿缺陷的重要原因,,,3.,自然状态下呈隐性感染,,,4

40、.,怀孕、多次输血、,AIDS,等易发生显性感染,,5.,可致多发性、全身性感染,,,6.,只有风疹可获得长久的免疫力，可用疫苗预防,,,,,TORCH,(,一,),弓形虫感染与致病,滋养体如弓形 ，广泛分布，人兽共患。,,寄生在有核细胞中，猫和猫科动物是终宿主,,易感者多，免疫者少,,我国智力低下儿的弓形虫感染率,28,％,,,畸形儿的弓形虫抗体,IgM,阳性率％,,艾滋病患者约有,20,％～,80,％合并弓形虫感染 ，造成艾滋病死亡的一个重要并发病,,TORCH,–,TOX,人群自然感染率达到,60-90%,，多为隐性感染,,免疫功能低下,(,怀孕、多次输血、器官移植、,AIDS),发生显

41、性感染,,可发生垂直传播，是宫内感染和胎儿畸形的主要病毒之一,,围生期感染,,血、尿、乳汁、精液、分泌物中都可检出病毒,,,,,,,(,二,),人巨细胞病毒感染,与致病,TORCH-CMV,风疹是一种世界性的病毒传染病， 是造成畸胎及先天性疾病的病毒之一,,出疹前,1,周至出疹后,5,天均有传染性,,人是风疹病毒的唯一宿主,,风疹感染后可获得持久的免疫力，临床显性再感染并不多见。,,(,三,),人风疹病毒感染与致病,TORCH-RV,先天性风疹感染往往发生在母体初次感染之时，可致先天性风疹综合症,(CRS),三联症：白内障、耳聋、心脏病。,,妊娠时体内皮质类固醇激素的增加以及细胞免疫功能的减弱

42、，这种对正常人无害的再感染有可能造成病毒蔓延以至影响胎儿。,,TORCH-RV,(,三,),人风疹病毒感染与致病,HSV,原发感染多为隐性，大多无临床症状或呈亚临床表现,,HSV-1,主要引起,口唇疱疹,，疱疹性结膜炎、脑炎，皮肤性疱疹,,HSV-2,主要引起,原发性,生殖器疱疹,,(,80%),。,,HSV,感染后大多数个体不能彻底消灭病毒，也不能阻止复发，病毒以潜伏状态长期存在宿主体内。,,TORCH-HSV,(,四,),,人单纯疱疹病毒感染与致病,妊娠期妇女因,HSV-1,被激活，可通过胎盘感染胎儿，引起胎儿畸形、智力低下、流产等。,,围产期感染可引发新生儿疱疹，死亡率高达,50%,以上

43、。,,HSV,常与,HIV-1,同时感染，并能促进病情发展，引起严重的局部和播散性感染。目前认为,HSV,是一种调节因素，能激活,HIV,复制,,与宫颈癌关系密切,。,,TORCH-HSV,(,四,),,人单纯疱疹病毒感染与致病,常规,TORCH,检测方法与不足,组织培养或病原体分离：慢，费力，阳性率低。,,血清学诊断：,,,IgG,： 人群自然感染率高达,60-90%,。,,IgG(,＋,),不能区别既住感染与现症感染；,,新生儿,IgG(,＋,),不能说明有感染。,,,IgM,：,IgM(,＋,),可能是原发性感染；,,,IgM(,－,),不能排除感染。,,TORCH,局限性：,1.,不能

44、定量分析,,,2.,抗体的产生受多种因素的影响,,,3.,交叉反应，假阳性,,,荧光探针检测,TORCH,的优势,原理：直接检测,TORCH,病原体的核酸,,优点：灵敏、快速，特异,,意义：早期诊断，妇幼保健、优生优育,,,1.,筛选,TORCH,患者，提高出生人口素质。,,,2.,有利于预测胎儿宫内感染状况及妊娠结局。,3. TORCH,感染孕妇的治疗效果观察。,,,4.,器官移植、免疫系统疾病等病人监控。,,5.,建立,TORCH,的分子诊断标准,,TORCH,TORCH,,,,,,,,,,,,,,,,TORCH,检测核酸与检测标本的比较,检验报告单结果读取,3.637E+06,检测下限,

45、: 1000,拷贝,/,毫升,,3.637×10,6,1.000E+03,copy/ml,,,如果是标本量是可以定量的，如血液、脑脊液等，则检测结果报告为：,copy/ml,,,如果是标本量不能定量，如分泌物等，则结果只能报告为：,copy,,,1.,亲子鉴定,,2.,法医物证,,技术的法医学应用,,4.,罪犯鉴定,,,法医鉴定,免疫学诊断主要是抗原抗体反应，应用于临床通常在体内产生抗体以后，而许多病原体的免疫学检测存在较长的,“,窗口期,”,，不利于对疾病的早期诊断；,PCR,方法直接检测病原体的,DNA/RNA,，能大大缩短,“,窗口期,”,，其高灵敏度的检测显然也有利于疾病的早期诊断,。

46、,疾病的早期诊断,,1,乙型肝炎,病毒,（,HBV,）,; 2.,,丙型肝炎,病毒,（,HCV,）,,3,淋球菌,(NGH);,4,人类免疫缺陷病毒（,HIV,）,,5,解脲脲原体,(UU),6,肺炎支原体,(MP),,7,单纯疱疹,II,型,8,人巨细胞病毒,（,HCMV,）,,9,人乳头瘤病毒,（,HPV,）,6,、,11,,10,高危型人乳头瘤病毒,（,HPV 8,个型）,,11,沙眼衣原体,(CT),12,a-,地中海贫血,,13,结核分支杆菌,(TB),14,新型冠状病毒,(SARS),,已经获得欧盟ＣＥ论证,已获证书,,,荧光定量,PCR,技术中国专利,,,国家重点新产品,,,多种荧光,PCR,试剂盒新药证书,,多项国家、省部级等科技进步奖,,,三十余项国家、省部级重点科研项目,,,业务遍布全国,３０２６,家医疗卫生单位,达安烙印,人有了知识，就会具备各种分析能力，,,明辨是非的能力。,,所以我们要勤恳读书，广泛阅读，,,古人说“书中自有黄金屋。,,”通过阅读科技书籍，我们能丰富知识，,,培养逻辑思维能力；,,通过阅读文学作品，我们能提高文学鉴赏水平，,,培养文学情趣；,,通过阅读报刊，我们能增长见识，扩大自己的知识面。,,有许多书籍还能培养我们的道德情操，,,给我们巨大的精神力量，,,鼓舞我们前进,。,