第4章蛋白质共价结构

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1、单击此处编辑母版标题样式,,单击此处编辑母版文本样式,,第二级,,第三级,,第四级,,第五级,,*,扬州大学生物科学与技术学院,,生物化学精品课程,*,Protein,第４章 蛋白质的共价结构,蛋白质 （Protein）,“生命是蛋白体的存在方式，这种存在方式本质上就在于这些蛋白体的化学组成部分的不断的自我更新。”,,,——,恩格斯《反杜林论》 1878年,,1838年，J. J. Berzelius提出，由proteios衍生而来， ——,第一重要，首要的物质,,蛋白质存在于,所有,生物细胞中，是构成生物体最基本的,结构物质和功能物质,。,,,蛋白质是生命活动的物质基础，参与了几乎所有的生命

2、活动过程。,一、蛋白质通论,（一）、蛋白质的化学组成和分类,１、元素组成,蛋白质是一类含氮有机化合物,,２、蛋白质的含氮量,蛋白氮占生物组织所有含氮物质的绝大部分。,,大多数蛋白质含氮量接近于,16%,,,蛋白质含量,=,每克样品中含氮的克数,,,凯氏定氮法,三聚氰胺,含氮量：66.7%,含氮量是蛋白质的倍。,３、蛋白质的分类,（1）、依据外形分类,,球状蛋白质：,globular protein,,,外形接近球形或椭圆形，溶解性较好,,纤维状蛋白质,：,fibrous protein,,形似纤维或细棒，分可溶性/不溶性两种,,膜蛋白质,：,membrane protein,,,亲水性残基少

3、于胞质蛋白,（2）、依据蛋白质的组成分类,单纯蛋白,,simple protein,,,单纯蛋白，仅由氨基酸组成,,缀合蛋白,,conjugated protein,由简单蛋白与其它非蛋白成分结合而成,单纯蛋白,清蛋白和球蛋白,,albumin and globulin,,广泛存在于动物组织,,谷蛋白和醇溶谷蛋白,glutelin and prolamin,,植物蛋白，不溶于水，易溶于稀酸/碱,,鱼精蛋白和组蛋白,碱性蛋白存在于细胞核,,硬蛋白,,存在于软骨、腱、毛发、丝等组织中，,,分为角/胶原/弹性/和丝蛋白等,缀合蛋白,糖蛋白：,简单蛋白+糖类物质,,脂蛋白：,简单蛋白+脂类

4、结合,,核蛋白,：简单蛋白+核酸,,磷蛋白：,含与Ser,Thr和Tyr残基的羟基酯化的磷酸基。,,金属蛋白：,含有金属离子的蛋白质,,血红素蛋白：,金属蛋白的一个亚类；辅基为血红素，是卟啉化合物。,,黄素蛋白：,含黄素，辅基为FMN和FAD。,,（3）蛋白质按生物学功能分类,酶：,如核糖核酸酶，胰蛋白酶等,,调节因子：,如胰岛素、促生长素、促甲状腺素等,,转运蛋白：,如血红蛋白、血清清蛋白、和葡糖转运蛋白,,贮存蛋白：,如卵清蛋白、酪蛋白、菜豆蛋白和铁蛋白,,收缩和游动蛋白：,肌动蛋白、肌球蛋白、动力蛋白,,结构蛋白：,角蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白、丝蛋白和蛋白聚糖,,支架蛋白：,如胰岛素受体

5、底物-1、A激酶锚定蛋白和信号传递转录激活剂,,保护和开发蛋白：,如免疫球蛋白、凝血酶、血纤蛋白原、抗冻蛋白、蛇和蜂毒蛋白、白喉毒素等,,异常蛋白：,如应乐果甜蛋白、节肢弹性蛋白和胶质蛋白,（二）、蛋白质的大小与分子量,蛋白质是分子量很大的生物分子,,对任一种给定的蛋白质，其所有分子在,AA组成和顺序以及肽链的长度,方面都应是相同的，即所谓均一的蛋白质。,人为规定,Pr,分子量上下限,,下限一般认为从胰岛素开始，其相对分子量为,5700,（,51,个氨基酸残基）,,某些,Pr,由两至多个亚基经 非共价结合而成（,寡聚蛋白,）分子量高达数百,/,千万。如谷酰胺合成酶（,12,个亚基组成），如烟草

6、花叶病毒（,2130,个亚基和一条,RNA,链构成。,蛋白质与多肽无严格的界线,,,——,通常将,6000Dr,以上的多肽称为蛋白质。,,蛋白质分子量变化范围很大,蛋白质——月示——胨——多肽——肽——AA,,1*10,4,5*10,3,2*10,3,1000 200 100,,-500,对于不含辅基的单纯蛋白质，相对分子量/110,≈,aa残基数,,20种aa的平均分子量约为138，,,较小的氨基酸占优势，因此平均分子质量为128。,,形成一个肽键失去一分子水（分子量18），aa残基的平均分子量为110。,100个氨基酸残基的蛋白质，分子量约为多少？,（三）、蛋白

7、质构象和结构的组织层次,蛋白质的结构层次,一级结构,二级结构,,三级结构,,四级结构,高级结构,,空间构象,蛋白质的各级结构的基本概念,一级（1,o,）结构,：,肽链中的氨基酸排列顺序。,,二级（2,o,）结构：,多肽链借助氢键排列成自己特有的,a,螺旋和,b,折叠股片段,。,,三级（3,o,）结构：多肽链借助各种非共价键（非共价力）弯曲、折叠成具有特定走向的紧密球状构象。,,四级（4,o,）结构：寡聚,蛋白质中各亚基之间在空间上的相互关系和结合方式。,一个蛋白质分子为获得复杂结构所需的全部信息都含于1,o,结构即多肽链的氨基酸序列中,示,,例,肌红蛋白的三级结构和丙酮磷酸异构酶的三级结构,血

8、红蛋白四级结构,（四）、蛋白质功能的多样性,1. 催化功能-酶,,2. 调节功能-激素、基因调控因子,,3. 转运功能-膜转运蛋白、血红/血清蛋白,,4. 贮存功能-乳、蛋、谷蛋白,,5. 运动功能-鞭毛、肌肉蛋白,,6. 结构成分-皮、毛、骨、牙、细胞骨架,,7. 支架作用-接头蛋白,,8. 防御功能-免疫球蛋白,,9. 异常功能,生老病死，万物轮回,(蛋白质层次),生（诞生、生长）：,在酶催化下老细胞,,计划性凋亡和新细胞的再生,（新陈代谢）,、活细胞,的代谢,,老？,蛋白质功能普遍衰退(?),,病—,个别蛋白质的功能障碍,,死？,蛋白质功能的全部停止/分解,,,,,蛋白质——生物功能分子

9、,单细胞生物,胞外酶,,鞭毛-,蛋白质（运动器官）,,细胞壁-糖、脂、,肽,,细胞膜-,载运蛋白、膜蛋白,,细胞质-,酶蛋白,（催化物质代谢）,,细胞核-,酶蛋白,（遗传）,多细胞动物,个体层次,毛发、皮肤,,-,角蛋白,骨骼、牙齿,,-钙+胶原蛋白,,肌肉,,-肌球蛋白/肌丝蛋白,二、肽（peptide）,AA-NH,2,与另一AA-COOH间失水形成的,酰胺键,,称,肽键,，所形成的化合物称,肽,。,由两个,AA,组成的肽称为,二肽。,,含几个至十几个,AA,的肽链称为,寡肽,,由,20,个,AA,以上组成的肽则称为,多肽。,,组成多肽的,AA,单元称为,氨基酸残基。,多肽链中AA残基按一

10、定顺序排列：,氨基酸顺序,,含游离,,-氨基的一端：氨基端或,N-端,,含游离,,-羧基的一端：羧基端或,C-端,,AA顺序是从N-端开始以C-端氨基酸残基为终点,,如上述五肽：Ser-Val-Tyr-Asp-Gln,,反过来写的是一个不同的肽,肽键是aa间的基本连接方式。证据：,１、Pr中游离α－氨基和α－羧基很少。,,２、人工合成的多肽能被蛋白酶水解。,,３、Pr能发生双缩脲反应（紫红色或蓝紫色）,,４、人工合成的多聚aa的Ｘ－射线衍射图案和红外吸收光谱与天然的纤维状蛋白质十分相似。,,５、我国首次人工合成－结晶牛胰岛素。,（一）、肽和肽键的结构,肽键的特点是：,,——N上孤对电子与羰

11、基有明显的共轭作用,。,,①肽键中C-N键有部分,,双键性质,,——不能自由旋转,,②组成肽键原子处于,,同一平面（肽平面）,,③,键长及键角一定,,④大多数情况以,反式,,结构存在,共价主链,,（二）、肽的物理化学性质,离子晶格，在水溶液中以偶极离子存在。,,肽末端,α-,羧基,pKa,值比游离,AA,中的大。,,肽末端,α-,氨基,pKa,值比游离,AA,中的小。,,酸碱性质取决于：,,,—α-,羧基、,α-,氨基、侧链基团的解离,,等电点，静电荷为零时溶液的,pH,值。,,肽的化学反应也和,AA,一样，游离的,α-,羧基、,α-,氨基、侧链基团可以发生类似,AA,的反应，如茚三酮反应。,

12、,具有双缩脲反应,—,肽特有的反应。,（紫红色或蓝紫色）,（三）、 天然存在的活性肽,生物体中多肽最重要的存在形式是作为,蛋白质的亚单位,；,,有许多分子量比较小的寡（多）肽以,游离状态,存在，这类肽通常都具有特殊的生理功能，常称为,活性肽,。,,如：脑啡肽、激素类多肽、抗生素类多肽、,,,谷胱甘肽,、蛇毒多肽等,,+,H,3,N-,Tyr-Gly-Gly-Phe,-Met-COO,-,,+,H,3,N-,Tyr-Gly-Gly-Phe,-Leu-COO,-,,Met-,脑啡肽,Leu-,脑啡肽,,,,L-Leu-D-Phe-L-Pro-L-Val,,,,,,,L-Orn

13、 L-Orn,,,,,,,,L-Val-L-Pro-D-Phe-L-Leu,,,,,短杆菌肽S(环十肽),,,由细菌分泌，含有D-AA和一些不常见AA，如鸟氨酸（,Ornithine, Orn,）。,,鹅膏覃碱是一种环状八肽，真核生物RNA聚合酶II的抑制剂（能与RNA聚合酶紧紧结合）,三、蛋白质一级结构的测定,蛋白质,AA,顺序测定是蛋白质化学研究的基础,,1953,年,测定了胰岛素的一级结构,,现已有成千上万种不同蛋白质的一级结构被测定。,,什么是Pr的一级结构？,蛋白质中氨基酸的排列顺序。,1.样品必需纯（>97%以上）,,,,,计算每种AA的个数,

14、,蛋白质测序前提,（一）、蛋白质测序策略,(1),测定蛋白质分子中多肽链的数目,,通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分子量之间的关系，即可确定多肽链的数目。,蛋白质一级结构的测定,（一）、蛋白质测序策略,(2),,多肽链的拆分,,蛋白质一级结构的测定,（一）、蛋白质测序策略,,几条多肽链借助,非共价键,连接在一起，称为寡聚蛋白质，血红蛋白为四聚体，烯醇化酶为二聚体。,,可用8mol/L,尿素或6mol/L盐酸胍处理，即可分开多肽链(亚基)。,,蛋白质一级结构的测定,（一）、蛋白质测序策略,(3),,断开二硫键,,在8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存在下，用过量的,,-巯基乙醇,处理，

15、使二硫键还原为巯基，然后用,烷基化试剂保护,生成的巯基，防止重新被氧化。,蛋白质一级结构的测定,,,,,,,,巯基（-SH）的保护,（一）、蛋白质测序策略,,,蛋白质一级结构的测定,(4),测定每条多肽链的AA组成，并计算出AA成分的分子比,部分样品进行完全水解，测定氨基酸组成,（一）、蛋白质测序策略,(5),分析多肽链的N-末端和C-末端,,,,(6),多肽链断裂成多个肽段,,采用两/多种,不同的断裂方法,将多肽,,断裂成两套或多套肽段，并将其分离。,蛋白质一级结构的测定,（一）、蛋白质测序策略,(7),测定每个肽段的氨基酸顺序,蛋白质一级结构的测定,(8),确定肽段在多肽链中的次序,,利用

16、两/多套肽段的AA顺序彼此间的交错重叠，拼凑出整条多肽链的AA顺序。,(9),确定原多肽链中二硫键的位置。,,（一）、蛋白质测序策略,蛋白质一级结构的测定,胃蛋白酶水解,两类多肽链末端氨基酸残基：,,N-端氨基酸,,C-端氨基酸,,在肽链氨基酸顺序分析中，最重要的是N-端氨基酸分析法。,,,（二）、末端氨基酸残基测定,Sanger法,,1、 末端分析,,二硝基氟苯（DNFB）法,O,2,N,F,N,O,2,+,,H,2,N,C,H,C,R,O,H,N,C,H,C,R,O,O,2,N,N,O,2,H,+,H,2,O,O,2,N,N,O,2,H,N,C,H,C,R,O,O,H,+,氨基酸,DNF

17、B,N-端氨基酸,DNP衍生物,DNP-氨基酸,（二）、末端氨基酸残基的鉴定,N,碱性条件,二硝基苯衍生物,黄色,二甲氨基萘磺酰-AA有强荧光，检测灵敏度高,,,丹磺酰氯（DNS）法,（二）、末端氨基酸残基的鉴定,、 末端分析,1,,N,碱性条件,(DNS-aa),,,苯异硫氰酸酯（PITC)法,（二）、末端氨基酸残基的鉴定,、 末端分析,1,,N,—N=C=S +,N—CH— CO—NH—C·······,H,H,R,1,PITC,—N—C—,N—CH—CO—NH—C·······,H,H,R,S,PTC-多肽,—N—C,H,R,S,N,C,C,O,PTH-氨基酸,,无水HF,苯异硫

18、氰酸酯PITC,R,2,多肽,+,N—CH— CO—NH—C·······,H,H,R,2,R,3,少一个氨基酸的多肽,肽链外切酶:从多肽链N-,端逐个向里水解,,根据不同反应时间测出释放的AA种类和数量，,,按反应时间和AA残基释放量作动力学曲线,,蛋白质N-末端残基顺序。,,最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶,,—水解以Leu残基为N-末端的肽键速度最大。,④氨肽酶法,（二）、末端氨基酸残基的鉴定,、 末端分析,1,,N,氨基酸酰肼可与苯甲醛缩合成不溶于水的物质。,,上清中的氨基酸可通过其他方法鉴定,①,,肼解法,（二）、末端氨基酸残基的鉴定,、 末端分析,2,,C,1～n-1,（二）、末端氨基

19、酸残基的鉴定,、 末端分析,2,,C,,,,C,末端AA α氨基醇,,,水解肽链，鉴定,α氨基醇,②,,还原法,硼氢化锂,肽链外切酶:从多肽链C-,端逐个水解,,根据不同反应时间释放出的AA种类和数量,,蛋白质C-末端残基顺序。,,四种羧肽酶：A,B,C和,Y,；,,A,和B(胰脏)、C(柑桔叶)、Y(面包酵母),,∽A:除Pro/Arg/Lys/外所有C-末端AA残基,,∽B:只水解Arg和Lys为C-末端残基的肽键,,∽Y：可作用于任何一个C-末端残基的肽键,③,羧肽酶法,（二）、末端氨基酸残基的鉴定,、 末端分析,2,,C,（三）、二硫键的断裂,盐酸胍/尿素解离多肽链

20、间的非共价力。,,应用过甲酸氧化法或巯基还原法拆分多肽链间的二硫键。,1、酸水解,常用6,M,盐酸或4,M,硫酸,,优点：水解产物不消旋,,缺点：,Trp,被沸酸完全破坏,,含羟基Ser、Thr、Tyr部分分解,,,Asn、Gln,酰胺基被水解,（四）、氨基酸组成的分析,2、碱水解,一般用5,M,氢氧化钠,,缺点：许多AA受到不同程度的破坏,,部分水解产物发生,消旋化,,优点：,Trp,不受破坏,（四）、氨基酸组成的分析,1、,酶解法:,,内切酶：,胰蛋白酶,、糜蛋白酶、,,胃蛋白酶、嗜热菌蛋白酶,,外切酶：羧肽酶和氨肽酶,多肽链的选择性降解,（五）、多肽链的部分裂解和,,肽段混合物的分离纯化

21、,目前序列分析方法最长只能几十个残基，因此需要裂解多肽，然后分离纯化。,R,1,=Lys（K）或Arg（R）,,专一性较强，水解速度快,,R,2,=Pro,（抑制）,肽链,水解位点,胰蛋白酶,trypsin,减少断裂点：,,保护Lys侧链ε-NH,2,或修饰Arg胍基,,增加断裂点：,,将Cys变为类似Lys的结构,R1=Phe（F）、 Trp（W）Tyr（Y）等疏水性AA,,Leu、Met和His稍慢,,R2=Pro（抑制）,,pH8-9,肽链,水解位点,糜蛋白酶/胰凝乳蛋白酶（,chymotrypsin）,水解速度与相邻AA性质有关: 酸性：-/碱性：+,R2=Phe（F）、 Trp（W）

22、、 Tyr（Y）、Leu（L）、Ile（I）、Met（M）、Val（V）及其它疏水性强的AA水解速度较快,,肽链,水解位点,R2= Pro或Gly，不水解,,R1或R3=Pro，抑制水解,嗜热菌蛋白酶,（thermolysin),R1和/或R2＝Phe（F）、Trp（W）、Tyr（Y）、 Leu（L）及其它疏水性AA水解速度较快,,,R1=Pro（抑制）,,pH2,,肽链,水解位点,胃蛋白酶,Pepsin,肽链,水解位点,羧肽酶和氨肽酶,2、化学裂解法,,,①溴化氰水解法,(Cyanogen bromide),,——选择性地切割由Met羧基形成的肽键。,,（五）、多肽链的部分裂解和,,肽段混合

23、物的分离纯化,多肽链的选择性降解,,,②NH,2,OH断裂：,,较专一性断裂Asn-Gly之间的肽键,,Asn-Leu及Asn-Ala键也能部分断裂,,,3、肽段的分离纯化：,,,凝胶过滤、凝胶电泳和HPLC法,,N-端分析法特点：能够不断重复循环，将肽链N-端氨基酸残基逐一进行标记和解离。,1、,Edman,法,（六）、肽段氨基酸序列的测定,（,苯异硫氰酸酯法）,Edman于1950年首先提出。,无水,氨基非质子化,PITC,PTC-肽,,2、氨肽酶法或羧肽酶法,3、质谱法（MS）,,,灵敏度高、所需样品少、测定速度快,核糖体,蛋白质链,,根据核苷酸序列的推定法：,,（1）用待测的蛋白质作

24、抗原免疫动物 抗体,,（2）分离多核糖体,,（3）抗体沉淀此种蛋白质多核糖体,,（4）分离该蛋白质的模板mRNA，,,（5）反转录成cDNA,,（6）根据测定cDNA序列推测蛋白质的AA序列。,,,注意：必须知道蛋白质N-末端和C-末端氨基酸残基,（七）、肽段在多肽链中次序的决定,重叠肽（overlaping peptide）,胃蛋白酶,处理没有断开二硫键的多肽链,,经电泳分离各肽段,,用过甲酸,断开二硫键,，含有-S-S-的肽段带电性质发生变化，转向90℃二次电泳，曾含二硫键的肽段迁移率发生变化,,然后同其它方法分析的肽段进行比较，确定二硫键的位置,（八）、二硫键位置的确定,胃蛋白酶,,

25、最适pH约2，此时二硫键不断开,,专一性低、肽段短,（九）、蛋白质测序举例,（十）蛋白质序列数据库,,,,,. nlm.,,,同源蛋白质：,来自,不同,生物体、 执行同一 /相似功能的蛋白质,同种蛋白质：,来自,相同,生物体、 执行同一功能的蛋白质 同源蛋白质的AA序列具有明显的相似性 ——序列同源性（,sequence homology,） 不变残基/可变残基,1、同源蛋白质,四、蛋白质的AA序列与生物功能,（一）同源蛋白质的物种差异与生物进化

26、,一百多个AA残基 MW约12.5×10,3,2 8个不变残基,序列间AA差异数与物种间系统发生差异成比例；进化位置上相差愈远，AA序列之间的差别愈大。,细胞色素C的AA序列差异可用于核对各物种间的分类学关系以及绘制系统树/,进化树,。,2、细胞色素C与系统树,invariant residues (yellow),,conservative substitutions (blue),,nonconservative or variable residues (unshaded),Conservation and variation of cytochrome c sequen

27、ces,序列同源关系表明随机突变导致一级,,结构方面AA取代/趋异事件的进化顺序。,1、氧合血红蛋白,（二）同源蛋白质具有共同的进化起源,该酶类活性中心的,Ser,残基,起关键作用,,胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶、,,凝血酶和纤溶酶,,有,序列同源性,,对,底物偏爱不同,2、丝氨酸蛋白酶类,卵清中的溶菌酶（,lysozyme,）,,α- 乳清蛋白（,lactalbumin,）,,——三级结构很相似,,也可能具有共同的祖先。,3、一些功能差异很大的蛋白质,（三）血液凝固与AA序列的局部断裂,,,凝血酶原,血液凝固：在凝血因子的作用下，可溶性的血纤蛋白原转变为不溶性的血纤蛋白网。,可溶性的,

28、,血纤蛋白原,酶,有活性的凝血酶,不溶性的,,血纤蛋白网,,（一）肽的人工合成 保护（,氨基、羧基、侧链活性基团,） 活化（,氨基、羧基,） 缩合剂 （二）胰岛素的人工合成（三）固相肽合成,五、肽与蛋白质的人工合成,树脂,挂接,1.有一多肽经酸水解后产生等摩尔的Lys，Gly和A1a.如用胰蛋白酶水解该肽，仅发现有游离的Gly和一种二肽。下列多肽的一级结构中，哪一个符合该肽的结构?,,,,,,,,,,,,,,,，4-二硝基氟苯法(FDNB法),,B.二甲氨基萘磺酰氯法(DNS-Cl法),,,D.苯异硫氰酸法(PITC法),,,,选

29、择题,3.用下列方法测定蛋白质含量，哪一种方法需要完整的肽键?,,,,,,,,4.下列关于蛋白质中L-氨基酸之间形成的肽键的叙述，哪些是正确的?,,(1).具有部分双键的性质,,(2).比通常的C-N单键短,,(3).通常有一个反式构型,,(4).能自由旋转,,A.1,2,3 B.1,3 C.2,4 D.4 E.1,2,3,4,,1 珠蛋白也是球蛋白,,2 用羧肽酶A水解一个肽，发现从量上看释放最快的是Leu，其次是Gly，据此可断定，此肽的C端序列是――gly-leu,,3 等电点不是蛋白质的特征参数,,4 催产素和加压素只有三个氨基酸地残基不同,,5 胰蛋白

30、酶专一地切在多肽链中碱基氨基酸的N端位置上,,6 溴化氰能作用于多肽链中的甲硫氨酸键,,7 在蛋白质和多肽分子中，连接氨基酸残基的共价键除肽键外，还有就是二硫键,,二、是非题,（－）,（－）,（＋）,（－）,（－）,（＋）,（＋）,1 胰凝乳蛋白酶专一性的切断,,和,,的羧基端肽键,,2 胰岛素的分子量大约是,,,3 一条肽链；Asn－His－Lys－Asp－Phe－Glu－Ile－Arg－Glu－Tyr－Gly－Arg经胰蛋白酶水解，可得到,,个肽,,4 肽经溴化氰（CNBr）处理后，在,,残基右侧的肽键被裂解，裂解后该残基变成,,,5 继Sanger之后，,,与,,二人共同建立了蛋白质一级

31、结构的测定技术获得了诺贝尔奖,,6 胰蛋白酶的专一性就是在,,残基右侧的肽键上水解,填空题,7 胰岛素是,,分泌的多肽激素，是由前胰岛素原经专一性蛋白水解，失去N端的,,成为,,。再经肽酶激活失去,,）肽，最后形成具有生物活性的胰岛素,,8 一个球状蛋白质，含100个氨基酸，估计它的分子量是,,,9 胰岛素是A,B两条肽链通过正确匹配的,,连接而成的蛋白质，在体内从一条肽链的前体经过,,的加工剪裁而成,,10 肽链的末端可以用,,，,,，,,和,,法测定，而,,和,,法则是测定C末端氨基酸最常用的方法,,11 羧肽酶B专一地从蛋白质的羧端切下,,残基,问答题,1、下列试剂和酶常用于蛋白质化学的

32、研究中： CNBr 异硫氰酸苯酯 丹黄酰氯 脲 6mol/LHCl β-巯基乙醇 水合茚三酮 过甲酸 胰蛋白酶 胰凝乳蛋白酶 其中哪一个最适合完成以下各项任务？（a）测定小肽的氨基酸序列。（b）鉴定肽的氨基末端残基。（c）不含二硫键的蛋白质的可逆变性。若有二硫键存在时还需加什么试剂？（d）在芳香族氨基酸残基羧基侧水解肽键。（e）在蛋氨酸残基羧基侧水解肽键。（f）在赖氨酸和精氨酸残基侧水解肽键。,2、由下列信息求八肽的序列。（a）酸水解得 Ala，Arg，Leu，Met，Phe，Thr，2Val（b）Sanger试剂处理得DNP-Ala。（c）胰蛋白酶处理得Ala，Arg，

33、Thr 和 Leu，Met，Phe，2Val。当以Sanger试剂处理时分别得到DNP-Ala和DNP-Val。（d）溴化氰处理得 Ala，Arg，高丝氨酸内酯，Thr，2Val，和 Leu，Phe，当用Sanger试剂处理时，分别得DNP-Ala和DNP-Leu。,Ala-Thr-Arg-Val-Val-Met-Leu-Phe,3．一五肽用胰蛋白酶水解得到两个肽段和一个游离的氨基酸，其中一个肽段在280nm有吸收，且 Panly反应、坂口反应都呈阳性；另一肽段用溴化氰处理释放出一个可与茚三酮反应产生棕褐色产物的氨基酸，此肽的氨基酸排列顺序如何？,,,4．某肽经 CNBr水解得到三个肽段，这三个肽的结构分别是：Asn－Trp－Gly-Met，Gly-Ala－Leu，Ala－Arg－Tyr－Asn－Met；用胰凝乳蛋白酶水解此肽也得到三个肽段，其中一个为四肽，用 6mol/L盐酸水解此四肽只得到（Asp）2和 Met三个氨基酸，问此肽的氨基酸排列顺序如何？,