第6章外源化学物致突变作用

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1、单击此处编辑母版标题样式,,单击此处编辑母版文本样式,,第二级,,第三级,,第四级,,第五级,,*,*,*,第七章 外源性化学物致突变作用,,（,Mutagenesis of,Xenobiotics,),1,,一般毒性作用,,,特殊毒性作用,,,（,致畸、,致突变、,致癌）,——“,三致”作用,,,,2,,致突变作用,---,造就了“蜘蛛侠”？,3,,4,,,,,5,,6,,7,,8,,,,9,,10,,现实生活中,……,自然界中的自发突变,,,转基因的动、植物（红薯，蓝色玫瑰）,,,各种有害因素引起的突变（物理，生物，化学）,,外源性化学物,致突变作用,11,,12,,基本概念：突变、遗传毒

2、理学、致突变作,,用、致突变物,,致突变的类型：基因突变、染色体结构异,,常、染色体数目异常,【,内容,】,13,,致突变作用机制,,突变的后果：生殖细胞突变，体细胞突变,,机体对致突变作用的影响,,致突变试验,14,,第一节 概 述,15,,遗传与变异,,遗传,：,,生物物种以各种,繁殖,方式来保证世代间,生命的持续,。,,种瓜得瓜 种豆得豆,,变异,：,,,亲子之间或子代之间,出现不同程度的,差异,。,,,一、基本概念,,16,,突变（,mutation),：,遗传结构本身,的变化及其,引起的变异,,---,生物体的遗传物质发生了突然的、根本的变化，因为这种变化起源于基因和

3、染色体，因此，是可遗传的变异,.,,突变”这个词的来源：“突变”是由荷兰,De,Vries,（,1901,－,1903,）提出。他当时在栽培月见草，发现其中有多种可变遗传的变异，因这些变异是不连续的好象突然发生，故叫“突变”,,,孟德尔的豌豆杂交实验为现代遗传学,,奠定了基础,(,基因分离、自由重组,),17,,1909,年摩尔根,(Morgan),发现在红眼果蝇中有白眼果蝇,,,因发现了果蝇白眼突变的性连锁遗传，提出了基因在染色体上直线排列以及连锁互换定律,，,摩根,于,1933,年被授予诺贝尔奖。,,1946,年，摩根的学生，被誉为“果蝇的突变大师”的,米勒,，证明Ｘ射线能使果蝇的突变率提

4、高,150,倍，因而成为诺贝尔奖获得者,.,18,,基因与染色体,生物界都知道是遗传因子（即基因）决定了生物的遗传。但是，,基因究竟在细胞内的什么地方？,,摩尔根以果蝇为试验对象回答了这一问题，,基因在染色体,上,。,,19,,20,,21,,摩尔根和他的学生利用果蝇作了大量的研究。,1926,年出版,《,基因论,》,，建立了著名的,基因学说。,,Thomas Hunt Morgan,,（1866～1945）,22,,摩尔根在,《,基因论,》,中绘制了果蝇基因位置图，首次完成了当时最新的基因概念的描述：,,基因是在染色体上呈线性排列的遗传单位，它不仅是决定性状的功能单位，也是一个,突变单位,和

5、,交换单位,。,,至此，人们对基因概念的理解更加具体和丰富了。,,23,,摩尔根果蝇遗传实验具有划时代意义,◆,人类第一次把基因与染色体联系起来，认为基因是一种物质，是染色体上的一个特定的区段。,,◆确立并发展了染色体的遗传理论。,,24,,突变研究简史,年份,事 件,作者,1904,发现,X,射线可以改变生殖细胞的遗传物质,De,Vries,1927,用,X,射线照射发现可以引起基因突变,Muller,1943,发现芥子气可诱发基因和染色体畸变,Averbach,& Robson,1951,用,X,射线可诱发小鼠突变,,1966,化学物可诱发小鼠突变,Russed,1969,成立国际环

6、境诱变剂学会,Guttanach,25,,自发突变,(spontaneous mutation),:,是由于普遍存在的未知因素作用下，在自然条件下发生的突变,,,特点：,发生过程长、频率很低，与物种进化有关,从,发生原因上，可分为：,26,,诱发突变,(induced mutation),：,是指人为地造成突变,,,特点：,发生过程短、频率高，既可被人类利用，也可能对人类产生危害,27,,遗传毒理学,(genetic toxicology),：,研究化学性和放射性物质的,致突变作用,以及人类接触致突变物可能引起的,健康效应,的科学。,致,突变作用,（,mutagenesis),：,是指外来因

7、  素特别是化学因子引起细胞核中的,遗传  物质发生改变的能力,，而且此种改变可 随同细胞分裂过程而传递。,28,,致突变物,(mutagen),：,凡能,引起生物体遗传物质发生改变的化学物质或任何环境因子,，又称诱变剂，也称为遗传毒物。,29,,直接致突变物（,direct-acting mutagen),：,,具有很高的化学活性，其原型就可引起生物体突变的物质。,,,间接致突变物（,indirect-acting mutagen),：,本身不能引起突变，必须在体内经过,代谢活化,，才具有致突变性的物质。,30,,环境中的致突变因素,,1.,化学物质,,天然存在的

8、致突变物：如黄曲酶毒素、亚硝酸盐等,,人工合成的致突变物,,,抗癌药物,：如环磷酰胺等,,,烷化剂,：如环氧乙烷、氮芥、硫芥等,,,有毒金属,：如六价铬、有机汞等,,,农药,：如乐果、敌百虫等,,,食品添加剂,：如奶油黄、胭脂红、食用蓝,1,号和,2,号等,,,其他,：如多氯联苯、氯乙烯、苯等,31,,物理因素：,电离辐射、温度剧烈变化等,32,,,1986,年,4,月,26,日，原苏联在乌克兰境内修建的切尔诺贝利核电站发生爆炸并引起大火。该事故导致约８吨的强辐射物严重泄露，造成了史无前例的放射性污染，其危害至今也未能完全消除。,,切尔诺贝利事故增加儿童体内,DNA,变异。,在医院接受治疗,,

9、的受辐射的孩子,,33,,3.,生物因素：,病毒、基因工程等,转基因鲑鱼,(,上,),比同年龄的野生鲑鱼,(,下,),重,11,倍,,34,,第二节 化学毒物致突变的类型,从遗传学角度或突变角度分为：,,基因突变,,染色体结构改变,,染色体数目改变,35,,从机理角度分为：,,对,DNA,为靶的损伤（包括基因突变和染色体畸变）,,不以,DNA,为靶的损伤,(,染色体数目异常）,36,,基因突变（,genetic mutation),：,是指基因在结构上发生了碱基对组成和排列序列的改变（,point mutation),。,,不能应用光学显微镜直接进行观察，须采用理化或生物学方法才能检出。,,光

10、学显微镜可分辨的物质最小为,0.2μm,,,相当于,4.7×10,6,个核苷酸对的长度,,一、基因突变,37,,基因突变：可分为,碱基置换和移码突变,两种类型。,,突变基因：,基因内存在的突变的基因,,野生型基因：,没有发生突变的基因,38,,(,一,),碱基置换（,base,subsititution,),转换,(transition),：,即嘌呤到嘌呤或嘧啶到  嘧啶的变化,颠换,(,transversion,):,即嘌呤到嘧啶或嘧啶  到嘌呤的变化,碱基置

11、换是某一碱基配对性能改变或脱落而引起的突变。,39,,A G T C,腺嘌呤 鸟嘌呤 胸腺嘧啶 胞嘧啶,40,,Transitions are more common than,transversions,,41,,42,,后果,,同义突变,(synonymous mutation),：,指没有改变基因产物氨基酸序列的突变。,,,,GGG,和,GGA,均编码,(,glycine,,,Gly,,,甘氨酸,),

12、,,43,,错义突变,(,missense,mutation),：,指碱基序列的改变引起了,产物氨基酸序列,的改变,,单核苷酸替代,44,,无义突变,(nonsense mutation),：,指某个碱基的改变使代表,某个氨基酸的密码子,变为蛋白质合成的,终止密码子,，导致多肽链在成熟之前终止合成的改变。,,终止密码子：,UAA UAG UGA,45,,,终止密码的突变,,链终止突变：,指无义突变使肽链过早终止。,,延长突变：,指如果终止密码子因突变而为氨基酸编码，结果产生过长的肽链的现象。,46,,指发生一对或几对,不等于,3,的倍数,的碱基减少或增加，以致从受损点开始碱基序列完全改变，形成

13、错误的密码，并转译为不正常的氨基酸。,,由于碱基序列所形成的一系列,三联体密码子,相互间并无标点符号，于是从受损位点开始密码子的,阅读框架,完全改变。,（二）移码突变（,frameshift,mutation),47,,48,,结果,,是从,原始损伤的密码子,开始一直到信息,末端,的氨基酸序列,完全改变,。,,使读码框架,改变其中某一点形成无义密码,，于是产生一个,无功能的肽链片段,。,,移码突变较易成为,致死性,突变。,49,,单碱基置换,单碱基缺失,50,,基因突变的案例,——,白化病,突变,--,黑色素生成缺陷,--,眼、毛发色素缺乏,,,发病率，,2/1000,,,常染色体隐性遗传,5

14、1,,全色盲，双色盲，色弱（红绿蓝三原色）,,,发病率，男性,7%,，女性,0.49%,,,X,染色体隐性遗传（交叉遗传）,,,尚无有效的治疗方法,（色盲,矫正隐形眼镜,，改善色觉,,,提高色调分辨能力）,,基因突变的案例,——,色盲症,52,,53,,基因突变的案例,——,多毛症,23,岁的墨西哥男子丹尼,·,出生后就患有一种罕见的多毛症，全身都被浓厚的黑色毛发覆盖，看起来就像传说中的恐怖“狼人”。,,,据悉，,丹尼一家五代人都患有这种“狼人综合征”，,他和,26,岁的哥哥拉里从小便被当成“怪物”，被关进笼子中四处展出。,,,祖母,携带这种变异基因，将它传给了后代。哥哥拉里、堂姐妹莉莉和卡拉

15、、亲妹妹贾米、,6,岁侄女丹尼拉等,54,,,‘狼人综合征’和月亮以及狼没有任何联系，而是与基因有关。,,,多毛症基因曾是人类身上的一种“失传基因”。,当远古时代的人类还是长满毛发的,灵长类动物,时，身上就存在着这种基因，但当人类渐渐进化后，这种基因变得不再需要，就开始发生突变而“关闭”。然而丹尼的家族不知何故，他们体内被“关闭”的多毛症基因现在又被“打开来了”。,,,“狼人综合征”非常罕见，,患病概率只有,100,亿分之一，且没有根治办法,。,,,55,,二、染色体畸变,(chromosome aberration),56,,染色体结构异常（畸变,）（,structural chromoso

16、me aberration),：,是指由于染色体或染色单体,断裂,，造成染色体或染色单体,缺失或引起各种重排,，从而出现染色体结构异常。,,,断裂剂：,凡能引起,染色体断裂,的物质。,57,,染色体畸变又可分为,,染色体畸变（,chromosome-type aberrations),：,指染色体中,两条染色单体同一位点受损,后所产生的结构异常,,染色单体畸变（,chromatid,-type aberrations),：,指畸变涉及复制染色体中两条染色单体中的,一条,58,,染色体结构异常的类型,类型：,,缺失,,重复,,倒位,,易位,,59,,(1),缺失（,deletion),：,染色体

17、上丢失了一个片段。,,一个染色体发生一次或多次断裂而不重接，就会出现一个或多个,无着丝粒断片,和,一个缺失了部分染色质并带有着丝粒,的异常染色体。,60,,(2),重复：,在一套染色体里，一个染色体片段出现不止一次。,61,,(3),倒位,(inversion),：,一个染色体片段被颠倒了。,倒转,180,,再重接,,臂间倒位,：如果颠倒的片段包括着丝点，称为臂间倒位；,,臂内倒位,：如不包括着丝点，称为臂内倒位。,,染色体的臂间倒位,,62,,(4),易位,(translocation),：,从某个染色体断下的节段接到另一染色体上称为易位。,,相互易位,63,,染色体结构异常是染色体或染色

18、单体,断裂,所致。,,当断端不发生重接或虽重接而不在原处，即可出现,染色体结构异常,。,64,,三、染色体数目异常,Normal human,Karyotype,: 46,XY,65,,动物正常体细胞染色体数目,2n,为标准，为,二倍体。染色体数目,异常可表现为,整倍性畸变,和,非整倍性畸变,。,,整倍性畸变可能出现,单倍体、三倍体或四倍体,。超过二倍体的整倍性畸变也统称为多倍体。非整倍性畸变系指比二倍体多或少一条或多条染色体,(2n+1, 2n-1),。,66,,整倍性畸变,67,,非整倍性畸变,68,,缺体,是指缺少一对同源染色体；,,单体或三体,系指某一对同源染色体相应地少或多一个,,四

19、体则指其比同源染色体多一对。,,人类中常见有三种三体：,,（,1,）,21-,三体，即,Down,氏综合征；,,（,2,）,18-,三体，即,Edward,综合征,,（,3,）,13-,三体，即,Patau,综合征。,,69,,患儿具明显的特殊面容体征：眼距宽，鼻根低平，眼裂小，眼外侧上斜，有内眦赘皮，外耳小，舌胖，常伸出口外，流涎多。,3.,男性,唐氏婴儿长大至青春期，也,不会有生育能力,。,,4.,,易患各种感染,，如存活至成人期，则常在,30,岁以后即出现老年性痴呆症状。,70,,,突出的面部特征包括枕骨突出，外耳旋转有畸形，眼裂短，嘴巴小,,桡骨发育不全，半椎骨，手握拳呈手指交错，并指

20、,(,趾,),,71,,突变的类型,,72,,第三节 化学毒物致突变作用的机制及后果,73,,（一）碱基损伤,,1.,碱基错配,,烷化剂,(,alkylating,agent):,是,指对,DNA,和蛋白质具有强烈烷化作用的物质,,一般情况下甲基化＞乙基化＞高碳烷基化,,烷化剂所致甲基化易产生碱基错配,一、引起突变的,DNA,变化,74,,目前认为最常受到烷化的是,,鸟嘌呤,的,N,－,7,位，其次是,O,－,6,位,,腺嘌呤的,N,－,1,、,N,－,3,和,N,－,7,也易烷,化,腺嘌呤 鸟嘌呤 胸腺嘧啶

21、 胞嘧啶,75,,,,76,,AP,位点（,apurinic,or,apyrimidinic,site),：,是指丢失碱基的,DNA,留下了一个无嘌呤或无嘧啶的位点,77,,嵌入剂（,intercalating agent),：,指能以,静电吸附形式,嵌入,DNA,单链的碱基之间或,DNA,双螺旋结构的相邻多核苷酸链之间的物质,,常见的嵌入物,：,多环芳烃的环氧化物,，,吖啶（,ādìng,）,类,化合物，,联苯胺,等。其共同的结构特征为：平面多环状结构，一般是三个环，长度极为相似约,6.8,Å,。,2.,平面大分子嵌入,DNA,链,3.4,Å,78,,,A,,G,,G,,A,T,

22、,C,,C,,T,解 链,A,,G,,G,,A,A,,G,,,G,,A,,A,,G,,,G,,A,,T,,C,,A,,C,,T,,插入一个碱基,嵌 入,嵌 入,,A,,G,,G,,A,模板链,嵌 入,嵌 入,A,,G,,G,,A,T,,C,,,T,缺失一个碱基,,编码链,79,,有些化学物的结构与碱基非常相似，称碱基类似物,,它们,能在,S,期中可与天然碱基竞争，并取代其位置,,例如,5-,溴脱氧尿嘧啶核苷能取代胸腺嘧啶；,,,2-,氨基嘌呤,(2-AP,）,能取代鸟嘌呤,3.,碱基类似物取代,A,＝,T,→,A,＝,5BU,80,,化学物可对碱基产生,氧化作用,，从而破坏或改变碱基的结构，进

23、而引起链断裂；,,有些化学物质可在体内形成,有机过氧化物或自由基,，如甲醛、氨基甲酸乙酯和乙氧咖啡碱等，可,间接使嘌呤的化学结构破坏,，容易出现,DNA,链断裂。,4.,碱基的化学结构的改变或破坏,81,,（二）,DNA,链受损,1.,二聚体的形成：,紫外线 环丁烷嘧啶和,4-6,光产物 阻止,DNA,复制 引起细胞死亡,82,,活性化学物质与细胞 大分子之间通过共价键形成的稳定复合物如生物毒素、多环芳烃和芳香胺类致癌物可使,DNA,形成,大加合物,，使,DNA,的立体构象发生明显变化，阻断受损部位的半保留复制和转录,2.DNA,加合物形成,83,,4

24、.DNA-,蛋白质交联（,DNA-protein,,,crosslinks,，,DPC,）,：,如亚硝酸、丝裂霉素,C,、氮和硫的芥子气以及各种铂的衍生物,3.DNA-DNA,交联（,DNA-DNA,crosslinks,，,DDC,）：,DNA,分子上一条链的碱基与互补链上的相应碱基形成共价连接,84,,二、引起突变的细胞分裂过程改变,a,是中心粒，,b,是纺锤丝，,c,是染色体，,d,是着丝点。纺锤丝把着丝,,点（内部已经一分为二）拉开，复制过的染色体就一分为二了。,,85,,一些化学物能作用于纺锤体，中心粒或其他核内细胞器，,从而干扰有丝分裂过程,,诱发这种作用的物质称为有丝分裂毒物，又

25、称,干扰剂,86,,秋水仙碱,是典型的引起细胞分裂,完全抑制,的物质，因此这种效应又,称秋水仙碱效应或细胞有丝分裂。,,有些干扰剂仅使细胞群体的,有丝分裂数减少,，被称之为抗有丝分裂剂。,87,,引起非整倍性的原因,不分离（,nondisjunction,),,一种是同源染色体在第一次减数分裂中联会复合中不分离（可能联会复合体受损）,,另一种是姊妹染色单体在有丝中或第二次减数分裂中因着丝粒受损未纵裂而不分离,88,,不分裂的结果是纺锤体的一极接受了同源或,,两个染色单体，而另一极则没有。,89,,只有一条染色体或一对染色体不分离，在子细胞中将多出一条,,或一对染色体，而在另一个子细胞中将少一条

26、或一对梁色体。,90,,染色体丢失（,chromosome loss),纺缍体形成的不完全障碍或着丝粒受损使细胞分裂过程中个别染色体行动滞后没有进入子细胞核,联会复合体形成障碍和第一次减数分裂时着丝粒早熟分离而产生非整倍性,91,,引起整倍体的原因,核内,复制（,endoreduplication,),第一次有丝分裂染色体及其着丝粒虽已完成正常复制，但纺缍体形成受到完全的障碍，全部姊妹染色单体不能分开，细胞也不能进行分裂，形成间期四倍体细胞核,第二次有丝分裂：恢复正常的复制和分开，中期便可见每四条染色单体整齐排列的现象,92,,1,、在细胞增殖过程，细胞周期正常染色体复制，但在接下,,来的有丝

27、分裂期，染色体分裂时，染色单体不能分离，产生,,一个,4,倍体细胞。,93,,2,、由于接受分裂错误，配子为,2,倍体，而不是,,单倍体，所以会产生一个多倍体的受精卵。,94,,,非整倍体和多倍体是由于染色体分离异常而产生的,95,,(,二）不以,DNA,为靶的损伤机制,1.,对,DNA,合成和修复有关的酶系统的作用,一些氨基酸类似物可,使与,DNA,合成有关的酶系统遭受破坏从而诱发突变，脱氧核糖核苷三磷酸,在,DNA,合成时的不平衡也可诱发突变,,铍和锰除可直接,与,DNA,相互作用外，还可与酶促防错修复系统相作用而产生突变,,96,,2.,对纺缍体的毒作用,与微管,蛋白二聚体结合,,与微管

28、上的巯基结合,,破坏已组装的微管,,妨碍中心粒移动,,其他作用,97,,四、突变的后果,突变的后果取决于化学毒物所作用的靶细胞,,体细胞：,其影响仅能在直接接触该物质的个体身体上表现出来，不可能遗传到下一代（肿瘤）,,生殖细胞：,其影响有可能遗传到下一代,,（遗传性疾病）,98,,DNA,损伤修复的效率,体细胞突变,生殖细胞突变,良性肿瘤,恶性转化,细胞衰老,未,分化的胚胎细胞,分化的胚胎细胞受损,显性,致死,隐性致死,存活突变,动脉硬化,未知疾病,癌变,老化,出生缺陷（流产,/,死胎）癌变,出生缺陷（功能或结构畸形）,流产死产,出生缺陷基因负荷,先天性疾病,化学物和遗传危害示意图,99,,（

29、,1,）致死性突变：,,显性致死：,精子不能受精，或,突变配子与正常配子结合后，在着床前或着床后的早期胚胎死亡。基因的致死作用在杂合子中即可表现的称为显性致死。,,,隐性致死：,需要纯合子或半合子才能出现死亡效应，杂合子则不出现死亡。,1.,生殖细胞突变的后果,100,,（,2,）非致死性突变（可遗传的改变）,,先天畸形等遗传性疾病,,遗传易感性改变,致死性突变将导致死胎，它影响后代的数量而非质量。,,非致死性突变主要影响后代的质量。,101,,生物个体生殖细胞发生突变或染色体畸变后，有些可能会在世代传递、选择过程中在人群中固定下来，增加人类的遗传负荷,遗传负荷（,genetic load),

30、：,指人群中每个个体所携带有害基因或致死基因的平均水平,102,,（,1,）癌变：,体细胞突变是细胞癌变的重要基础，在许多肿瘤中，都可观察到癌基因的活化和抑癌基因的失活，并存在缺失、易位、倒位等染色体畸变,2.,体细胞突变的后果,103,,104,,（,2,）致畸胎：,致突变物可透过胎盘作用于胚胎体细胞引起畸胎，所以致畸作用不完全是亲代生殖细胞突变的后果,,（,3,）其他不良后果：,动脉粥样硬化、衰老,,105,,第四节 机体对致突变作用的影响,106,,DNA,执行高保真的复制,,修复,DNA,损伤,,损伤耐受机制,:,是指,DNA,遗传可绕过那些阻止,DNA,复制的,DNA,损伤机制,,修

31、复机制：直接修复和切除修复,遗传信息代,,代相传，并,,且高度保真,,107,,DNA,损伤、修复及后果,108,,一、,DNA,损伤的修复,(,直接修复,),1.,光复活（,photoreactivation,),：,修复紫外线损伤产生的胸腺嘧啶二聚体，广泛存在原核和真核生物体内,(,光裂合酶,),,2.“,适应性”反应：,主要,是,O,6,-,甲基鸟嘌呤,-DNA,甲基转移酶（,MGMT),修复鸟嘌呤,O,6,位的,烷基化损伤。,109,,（,1,）识别：,糖基化酶识别异常的碱基，随后使异常嘌呤的,N-9,位或异常嘧啶的,N-3,位与脱氧核糖之间的键发生水解，形成无嘌呤或嘧啶的位点（,ap

32、urinic-apyrimidinic,site, AP,位点）。,3.,切除修复,110,,（,2,）插入酶将正确碱基插入,AP,位点,,（,3,）,DNA,聚合酶合成,DNA,片段，填补空缺,,（,4,）,DNA,连接酶将新合成的补片接上,111,,112,,切除修复分为：,,碱基切除修复（,BER),：,,核苷酸切除修复（,NER),：,总基因组修复（,GGR),；,转录偶联修复（,TCR),,错配修复（,mismatch repair,，,MMR),：,识别并切除错配的碱基对，如,G:T,和,A:C,113,,114,,115,,116,,4.DNA,双链断裂修复,,同源重组修复,,（

33、,homology recombination,，,HR),,,非同源末端连接,(non-homology end joining,，,NHEJ),117,,易错修复（,error-prone repair),：,是指突变作为修复的结果或作为损伤旁路发生的,DNA,修复,,光复活、适应性修复和切除修复倾向于无误修复,,双链断裂修复就是易错修复,118,,1.DNA,损伤不仅可因外源性因素所致，也可因内源性因素所致,,2.,不同类型,DNA,损伤通过不同的,DNA,修复途径修复,DNA,损伤修复的一般特点,119,,3.,不同类型,DNA,损伤修复速度是不同的,,4.DNA,损伤修复机制有些是基

34、本的，有些是可诱导的,,5.DNA,损伤修复功能存在物种和个体差异,120,,突变模式：,,,DNA,损伤,----,修复,----,突变,任何,DNA,损伤，只要修复无误，突变就不会发生，如果修复错误或未经修复，损伤就固定下来，于是发生突变,121,,遗传毒物,终致突变物,+DNA,解毒,,加,合,物,,DNA,损伤,修复,无错,易错,修复,复制后修复,细胞死亡、,,静止状态的细胞,DNA,复制,加合的碱基错配,损伤正在复制的,DNA,,突 变,细胞存活,细胞存活,122,,第五节 观察化学毒物致突变作用  的基本方法,123,,致突变试

35、验的应用,中国预防医学博士张学明,:,煎炸鱼中合有强致癌物,———,杂环胺。,,,杂环胺的形成量主要受煎炸、烤的温度影响，其次是煎烤时间。煎炸温度小于２００℃，杂环胺的形成量就很少；如果煎炸温度超过２００℃，煎炸时间少于２分钟，杂环胺的形成量也很少；在煎炸的鱼外面挂上一层淀粉糊再炸，也能预防杂环胺形成。,,,美国加州科研人员发现，高温烹调或油炸的肉食中合有突变源，对经过高温烹调的牛肉、鸡、鱼等进行检验，结果测出１０种致癌化合物，这次研究证实，突变源不是由于炭火等热源将肉烧糊所致，而是肉食本身成分在加温２００℃以上时的产物。,124,,（,1,）检测外源化学物的致突变性，预测其对哺乳动物和人的致

36、癌性,,（,2,）检测外源化学物对哺乳动物生殖细胞的遗传毒性，预测其对人类的遗传危险性,致,突变试验的目的,125,,一、观察项目的选择,1.,观察效应终点的类型：,,（,1,）,DNA,完整性改变,,（,2,）,DNA,重排或交换,,（,3,）,DNA,碱基序列改变（基因突变）,,（,4,）染色体完整性改变（染色体畸变）,,（,5,）染色体分离改变（非整倍体和多倍体）,126,,试验组应包括每一类型的遗传学终点，如细胞回复突变试验、微核试验、细菌,DNA,修复试验和体外姐妹染色单体交换试验（,SCE),，,这一组试验包括主要类型遗传学终点,2.,试验组合的原则,127,,试验组应包括体内试验

37、与体外试验，体外试验（,+S9,和,-S9),和体内试验细胞突变试验为阳性者有必要进行生殖细胞突变试验,试验组中的指示生物应包括几个进化阶段，至少要包括原核细胞与真核细胞两个系统,128,,二、常用的致突变试验,1.,鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验（,Ames,试验）,,原理：,检测受试物诱发鼠伤寒沙门氏菌组氨酸营养缺陷型突变株,(his-),回复突变成野生型,(his+),的能力,129,,组氨酸突变菌,(his-),：,在不含组氨酸的最低营养平皿上不能生长,,回复突变成野生,型,(his+),：,可在不含组氨酸的最低营养平皿上生长,130,,131,,132,,标准试验菌株有四种：,TA,97

38、,和,TA,98,检测移码突变、,TA,100,检测碱基置换突变、,TA,102,对醛、过氧化物及,DNA,交联剂较敏感,,这四个试验菌株除了含有,his-,突变，还有一些附加突变，以提高敏感性,133,,只要在一种试验菌株得到阳性结果，即认为受试物是致突变物,,仅当四种试验菌株均得到阴性结果，才认为受试物是非致突变物,结果判断,134,,不加,S,9,混合液得到阳性结果，说明受试物是直接致突变物,,加,S,9,混合液才得到阳性结果，说明该受试物是间接致突变物,135,,2.,微核试验（,micronucleus test,，,MNT),微核（,micronucleus):,是指染色体无着丝点

39、断片或因纺锤体受损伤而丢失的整个染色体在细胞分裂的后期仍留在子细胞的胞质内，成为一个或几个规则的次核,136,,137,,,正常细胞、微核细胞,138,,,正常细胞、微核细胞和核异常细胞,指示正常细胞； 指示微核细胞； 指示核异常细胞 （,2.5×100,）,139,,常用啮齿类动物,骨髓嗜多染红细胞,(PCE),做微核试验,,PCE,是红细胞成熟的一个阶段，此时红细胞的主核已排出，微核容易辩认，,PCE,胞质含,RNA,染色与成熟红细胞易于区别，故为骨髓微核试验的首选细胞群,140,,3.,单细胞凝胶电泳（,single cell gel electrophoresis,，,S

40、CGE),在单细胞水平上定量检测,DNA,损伤,141,,原理：,在电泳槽中，,DNA,断片在电场的作用下，由细胞核中移出，并向阳极泳动，经荧光染色后见到细胞核和移出的,DNA,断片，形成有如彗星一样的彗星头和彗星尾，故又称,彗星试验（,comet test),142,,NaAsO,2,,染毒,SCGE,观,,察细胞,DNA,,损伤彗星图,,0.0 µmol/L 1.0 µmol/L 2.5 µmol/L,5.0 µmol/L 10

41、.0 µmol/L,143,,4,、,染色体畸变分析,chromosome aberration assay,观察染色体形态结构和数目改变，又称细胞遗传学试验。,,将观察细胞停留在细胞分裂中期相，用显微镜检查染色体畸变和染色体分离异常。,144,,人类染色体,G,显带示意图,口诀：一秃二蛇三蝶飘　四像鞭炮五黑腰六号ｐ似小白脸　七上八下九两条十号ｑ三深带好　十一低来十二高十三四五一个样　着色深带一二一十六深带连着点　十七深带跑得远十八人小肚子大　十九中间一点腰二十头重脚轻　　二十一像葫芦瓢二十二两两一点,Y,黑脚，,X,ｐｑ一担挑,145,,146,,常染色体异常,,147,,常

42、染色体异常,Down syndrome,,(,trisomy,21):,先天愚型,或,唐氏综合征,,148,,,149,,Patau syndrome (,trisomy,13),:serious eye, brain, circulatory defects as well as cleft palate. Children rarely live more than a few months.,150,,151,,Edward's syndrome (,trisomy,18),:,almost every organ system affected. Children with full,

43、Trisomy,18 generally do not live more than a few months.,,,,152,,染色体结构改变,153,,染色体结构改变,Deletion,:,cry,of the cat,A specific deletion of a small portion of chromosome 5; these children have severe mental retardation, a small head with unusual facial features, and a cry that sounds like a distressed ca

44、t.,154,,一条染色体的两条单体在同一位置发生同源片段的变换，称为姐妹染色单体交换。由于交换是对等的，所以染色体的形成没有改变，但用特殊的培养液和处理方法可以显示出来,5,、姐妹染色单体交换,,Sister-,chromatid,exchange, SCE,155,,156,,SCE,的遗传学意义还不完全清楚，是否存在自发的,SCE,也还有争议，交换的机理尚未完全阐明，但它显然与,DNA,损伤和修复过程有关。作为一种简便和敏感的遗传学指标，它在诱变和肿瘤研究等领域中的应用十分广泛。例如，目前已知许多环境诱变剂、职业有害因素、抗肿瘤药物、病毒等都可以引起,SCE,率增加，,Bloom,综合征

45、患者和某些肿瘤患者的,SCE,率也明显上升。,157,,6,、果蝇伴性隐性致死试验,Sex-linked recessive lethal test, SLRL,利用隐性基因在伴性遗传中具有交叉遗传特征，选择黑腹果蝇，给雄蝇受试物，如雄蝇的,X,染色体有突变，传给,F1,代雌蝇，再通过,F1,代雌蝇传给,F2,代雄蝇，使位于,X,染色体上的隐性基因在半合型雄蝇表现出来。,158,,159,,160,,7,、显性致死试验,Dominant lethal test,显性致死突变指哺乳动物生殖细胞染色体发生结构和数目变化，出现的受精卵在着床前死亡和胚胎早期死亡。,,它是评价化学毒物对雄性动物的生殖细

46、胞遗传毒性较好的方法之一。,161,,8,、,荧光原位杂交技术,Fluorescence in situ hybridization, FISH,利用荧光探针，将已标记或经特殊修饰的核酸探针与已固定的组织、细胞或染色体中,DNA,、,RNA,杂交，继而通过分析标记探针在被检对象中的显示状况而达到对特殊目标顺序进行检测、定位的目的。,162,,An example of FISH-treated metaphase chromosomes,chromosomes,1, 2, and 4 were labeled yellow with FISH and the other chromosomes

47、 were,,stained red. Translocations between yellow and red chromosomes are detected. The left picture,,represents a normal cell and the right picture is an example of reciprocal translocation with two,,bi-color chromosomes (indicated by two arrows).,163,,致突变试验的应用实例,——,如何设计？,分组（化合物）,,选择致突变实验组合,,体外，体内,

48、,观察遗传学终点,,做出评价,,164,,致突变实验的应用实例,165,,166,,167,,168,,169,,170,,致突变实验的应用实例,——,空气污染,家庭装潢有害气体致小鼠遗传毒性实验,,,171,,172,Ames Test,(one prokaryote,mutagenicity,),,Founder,of the Ames test:,Bruce Ames and his coworkers of the California University.,,Bruce Ames (1928– ),,,A bacteriologist who developed a method

49、to test chemicals for the mutation rate they induced in bacteria.,172,172,,Salmonella,typhimurium,strains,鼠伤寒沙门氏菌,wild type,:,can,synthesize,histidine,and hence can grow in its absence.,,Auxotroph,(,营养缺陷型,),:,,will,not grow,in the absence of,histidine,.,173,173,,,,174,174,,,,175,175,,Principle of Am

50、es test,It depends on the ability of,mutagenic chemicals to,bring about reverse mutations,in mutant,Salmonella,typhimurium,strains,鼠,(,伤寒沙门氏菌,),that have,defects,in the,histidine,biosynthesis pathway,.,Auxotroph strains,Prototroph,chemical mutagens,Reverse mutation (back mutation):,176,176,,Bacteria

51、l tester strains in Ames test,strain TA-1535,:,base-pair substitution,.,,,–GAG- (,leucine,) –GGG- (,proline,),,strains,TA-1537, TA-1538,: has a +/- (C),frameshift,mutations,;,177,TA97,98,:,frameshif,mutations;,,TA 100,: base-pair substitution;,,,TA 102,:,nonsense mutation,(-TAA- in place of

52、 the-CAA-),,more sensitive but less specific.,,177,,,,178,,179,S-9 fraction,:,,,,liver homogenate,Supernatant,fraction,9000 g, 20 min,179,179,,180,,,Function:,,providin,g the activating enzymes involved in,,the toxicity of chemicals to animals.,,Grouping:,,,180,a number of concentrations,are tested;

53、,,positive controls:,(,Mitomycin,C,,,丝裂霉素,C,;,,,daunorubicin,,正定霉素,;,2-AF,,2-,氨基芴,).,,negative controls,: lack only the test compound;,,Parallel tests,without the S-9 fraction,:,,help distinguish between chemicals with intrinsic,,mutagenic potential and those that require,,metabolic activation.,180,

54、,181,,181,Figure Protocol for the Ames test for mutagenesis,Direct mutagen,Indirect mutagen,181,,,,182,,183,,1.,阴性、阳性对照的设立：,,阴性对照：即未处理对照或溶剂对照,,阳性对照：用某种已知能产生阳性反应的物质作对照,三、致突变试验中的一些问题,184,,2.,体外试验活化系统的采用,,许多化合物不具有致突变性，经哺乳动物代谢才转变成致突变物。由于微生物和培养的哺乳动物细胞缺乏整体动物体内的许多代谢能力。必须加入代谢活化系统以检出前致突变物。,185,,（,1,）盲法观察,,

55、（,2,）阴性对照和阳性对照的设立,,（,3,）资料的统计学分析,,（,4,）试验结果的重现性,3.,致突变试验的质量控制措施,186,,4.,阴性结果的判定条件,① 最高剂量应包括受试物溶解度许可或灌胃量许可的最大剂量,,② 各剂量的组间差距不应过大，以防漏检仅在非常狭窄范围内才有突变能力的某些外源化学物,187,,阳性结果应当具有剂量,-,反应关系，即剂量越高，致突变效果越大，并在一组或多组的观察值与阴性对照之间有显著差异,188,,基本概念：突变、遗传毒理学、致突变作用、致突变物,,致突变的类型：基因突变、染色体结构异 常、染色体数目异常,,致突变作用机制,,突变的后果：生殖细胞突变，体细胞突变,,机体对致突变作用的影响,,致突变试验,,189,,