卫生化学紫外可见分光光度法课件

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1、,,单击此处编辑母版标题样式,,单击此处编辑母版文本样式,,第二级,,第三级,,第四级,,第五级,,*,精选PPT课件,*,,,,,,,单击此处编辑母版标题样式,,单击此处编辑母版文本样式,,第二级,,第三级,,第四级,,第五级,,*,精选PPT课件,-,可见分光光度法,*,,,,,单击此处编辑母版标题样式,,单击此处编辑母版文本样式,,第二级,,第三级,,第四级,,第五级,,*,精选PPT课件,*,单击此处编辑母版标题样式,,单击此处编辑母版文本样式,,二级,,三级,,四级,,五级,,,精选PPT课件,*,单击此处编辑母版标题样式,,单击此处编辑母版文本样式,,二级,,三级,,四级,,五级,

2、,,,*,卫生化学,第四章 紫外,-,可见分光光度法,1,,精选PPT课件,紫外,-,可见分光光度法（,ultraviolet-visible spectrophotometry,UV-Vis,）,是光谱分析法中一种重要的、广泛应用的分析方法。,,,光谱分析法（,spectroscopic analysis,）：,是指利用物质与辐射能作用时所吸收或发射辐射的特征和强度而建立起来的定性、定量及结构分析方法。,,,2,精选PPT课件-可见分光光度法,如原子吸收分光光度法,如原子发射光谱法,如紫外,-,可见、红外,如分子荧光分析法,3,,精选PPT课件,紫外－可见分光光度法,是根据物质,分子,对紫外

3、或可见光区电磁辐射的,吸收,特征和吸收程度建立起来的分析方法．,,紫外区波长,200,～,400nm,,,,可见区波长,400,～,760nm,,,特点,,灵敏度、准确度高、操作简便快速、应用广泛,,,,4,精选PPT课件-可见分光光度法,待测物质,5,,精选PPT课件,第一节　概述,,一、电磁辐射和电磁波谱,,光属于,电磁辐射,，基本单位是光子，光子具有波粒二象性：,,,波动性,6,精选PPT课件-可见分光光度法,光的传播速度：,,,c,－真空中光速,2.99792458×10,8,m/s,,n,－,折射率，真空中为,1,,λ,－,波长，单位：,m,cm,mm,,µm,nm,Å,（,1Å=1

4、0,-10,m,）,,γ,－,频率，单位：赫兹,(,周,)Hz,次,/,秒,,7,精选PPT课件-可见分光光度法,,光量子，具有能量：,,,,h,－,普朗克,(Planck),常数,6.626×10,-34,J·s,,γ,－,频率,,E,－,光量子具有的能量,,单位：,J(,焦耳,),，,eV(,电子伏特,),,1 eV= 1.602×10,-19,J,,,微粒性,8,精选PPT课件-可见分光光度法,,,,结论,:,一定波长的光具有一定的能量，波长越长,(,频率越低,),，光量子的能量越低。,,单色光：,具有相同能量,(,相同波长,),的光。,,混合光：,具有不同能量,(,不同波长,),的光复

5、合在一起,.,例如白光。,,,波粒二象性,9,精选PPT课件-可见分光光度法,高能辐射区,γ,射线 能量最高，来源于核能级跃迁,,,χ,射线 来自内层电子能级的跃迁,,光学光谱区 紫外光 来自原子和分子外层电子能级的跃迁,,可见光,,红外光 来自分子振动和转动能级的跃迁,,波谱区 微波 来自分子转动能级及电子自旋能级跃迁,,无线电波 来自原子核自旋能级的跃迁,,,,,,γ,射线→,X,射线→紫外光→可见光→红外光→微波→无线电波,波长,长,电磁辐射按波长顺序排列称为电磁波谱。,,10,精选PPT课件-可见分光光度法

6、,11,精选PPT课件-可见分光光度法,第二节 基本原理,,,1.,紫外,-,可见吸收光谱的形成,,当光通过气态、液态或固态的物质时，物质分子选择性吸收辐射，产生紫外,-,可见吸收光谱，又称为分子吸收光谱。,,,,,12,精选PPT课件-可见分光光度法,物质分子内部三种运动状态对应三种能级：,,电子绕核运动,（电子跃迁）,→,电子能级△,E,电,,原子在平衡位置上振动,→,振动能级,△E,振,,,分子绕轴转动,（分子转动）,→,转动能级,△E,转,,13,精选PPT课件-可见分光光度法,,电子基态,,电子激发态,J,3,,J,2,,J,1,J,3,,J,2,,J,1,J,3,,J,2,,J,1

7、,J,3,,J,2,,J,1,J,3,,J,2,,J,1,J,3,,J,2,,J,1,14,,精选PPT课件,物质对不同波长的光线具有不同的吸收能力，物质也只能,选择性地吸收,那些能量相当于该分子,振动能变化△,E,v,、转动能变化△,E,r,以及电子运动能量变化△,E,e,的总和△,E,的辐射。,,,由于各种物质分子内部结构的不同，分子的各种能级之间的间隔也互不相同，这样就决定了,物质对不同波长光线的选择性吸收,。,,,15,精选PPT课件-可见分光光度法,有色物质的不同颜色是由于吸收了不同波长的光,,（互补光）所致,。,16,精选PPT课件-可见分光光度法,2.,分子吸收光谱及其特征,将不

8、同波长的单色光依次通过一定的溶液，分别测出对各种波长的光的吸收程度（用,A,表示）。,,以波长为横坐标，吸光程度为纵坐标作图，所得的曲线称为,吸收曲线,（,absorption curve,）或,吸收光谱,(absorption spectrum),。,,17,精选PPT课件-可见分光光度法,吸收光谱特征：,定性依据,,吸收峰→,λ,max,,,吸收谷→,λ,min,,,肩峰→,λ,sh,,,末端吸收→饱和,σ-σ,跃迁产生,,,A,18,,精选PPT课件,19,,精选PPT课件,（一）有机化合物的电子跃迁类型,,P,x,P,y,P,z,P,x,P,y,P,z,π,π,*,σ,*,σ,n,二、

9、紫外－可见吸收光谱与分子结构的关系,,20,精选PPT课件-可见分光光度法,按能量大小：,σ→ σ,*,>,,n → σ,*,>,,π→ π,*,>,,n→ π,*,21,精选PPT课件-可见分光光度法,1. σ→σ,*,跃迁,．,,饱和烃类（单键， 且都是,σ,键）,吸收光能后多发生此类跃迁，此跃迁所需能量大，（大约,350k j /molσ,键）,,一般吸收＜,150 nm,的光，属于远紫外区 （真空紫外区）,,,,,,22,精选PPT课件-可见分光光度法,２．,n→σ,*,跃迁,含有,杂原子（,O,、,N,、,S,、,X,）的饱和烃衍生物,，这些杂原子上的,n,电子向着,σ,*,跃迁。吸

10、收波长在,200 nm,左右．,,,,,,23,精选PPT课件-可见分光光度法,３．,π→π,*,,,此跃迁所需能量小（约,200kj/mol,键）．吸收波长为,200nm,左右．具有,碳,—,碳双键（三键）,的化合物会发生此类跃迁．,,孤立的,π→π,*,跃迁,． 吸收波长在,160,～,190nm,左右,.,,如,CH,2,= CH,2,,,λ,max,=165nm ε=10,4,,共轭双键的,π→π,*,,跃迁,．,由于,π,与,π,键之间相互作用形成离域键，使,π→π,*,跃迁所需能量减小，而且共轭键越长所需能量越小．,,如丁二烯,CH,2,=CH-CH =CH,2,λ,m

11、ax,=217nm,ε= 21000,,24,精选PPT课件-可见分光光度法,４．,n→π*,,易发生在,含有杂原子的不饱和基团,中，如,C=O,、,C=S,、,—N=N—,等化合物。这些杂原子都有未成键的孤电子对．此类跃迁一般在近紫外区（,200-400nm,），但,ε,小，在,10,～,100,之间．,,25,精选PPT课件-可见分光光度法,1,．电荷迁移跃迁（亦称内,ox—red,过程）,,所谓迁移跃迁是指用电磁辐射照射化合物时，电子从给予体向接受体相联系的轨道上跃迁，过程见下：,,,N,C,H,3,C,H,3,－,+,hv,hv,C,R,O,+,_,吸收谱带较宽、吸收强度大、,ε,ma

12、x,≥10,4,，是强吸收带。,电子接受体,电子接受体,电子给予体,电子给予体,电子接受体,电子给予体,（二）无机化合物的电子跃迁类型,26,精选PPT课件-可见分光光度法,2,．配位场跃迁,,四、五周期中的过渡金属元素分别有,3d,和,4d,轨道，镧系锕系分别含有,4f,和,5f,轨道， 在配体存在下过渡元素五个能量相等的,d,轨道和镧、锕元素七个能量相等的,f,轨道分别分裂成几组能量不等的,d,轨道及,f,轨道,.,当它,们吸收光能后，低能态的,d,电子或,f,电子可以分别跃迁到高能态的,d,轨道及,f,轨道上去。 一定要有配体的配位场作用,.,,27,精选PPT课件-可见分光光度法

13、,28,,精选PPT课件,1,．,生色团（发色团）：,能吸收紫外,-,可见光的基团,,,,有机化合物：具有不饱和键和未成对电子的基团,,具,n,电子和,π,电子的基团,,产生,n→ π,*,跃迁和,π→ π,*,跃迁,,跃迁,E,较低,,例：,C,＝,C,；,C,＝,O,；,C,＝,N,；,—N,＝,N—,,注：当出现几个发色团共轭，则几个发色团所产生的,,吸收带将消失，代之出现新的共轭吸收带，其波,,长将比单个发色团的吸收波长长，强度也增强,,29,,精选PPT课件,,2,．助色团：本身无紫外吸收，但可以使生色团吸收峰加强同时使吸收峰长移的基团,,有机物：连有杂原子的饱和基团,,例：,—OH

14、,，,—OR,，,—NH—,，,—NR2—,，,—X,30,精选PPT课件-可见分光光度法,5,．红移和蓝移：,,由于化合物结构变化（共轭、引入助色团取代基）,,或采用不同溶剂后,,,吸收峰位置向长波方向的移动，叫红移,（长移）,,,吸收峰位置向短波方向移动，叫蓝移,（紫移，短移）,31,,精选PPT课件,三、光的吸收定律,,（一）,Lambert-Beer,定律,,一束单色光通过含吸光物质的溶液时,,,I,a,,入射光,I,0,,透过光,I,t,,反射光,I,r,I,0,＝,I,a,+ I,t,+ I,r,≈ I,a,+ I,t,,由上式可知,,I,0,不变，若,,I,a,↑,则,I,t,↓

15、,,反之亦然,32,精选PPT课件-可见分光光度法,我们把：,I,t,／,I,0,=,,T,称作透光率（度）,,,T ×100 = T%,称作百分透光率（度）,,T,越大，表示溶液对光的吸收越少,,T,越小，表示溶液对光的吸收越多,,常用吸光度来表示物质对光的吸收程度：,,,,33,精选PPT课件-可见分光光度法,朗伯定律,(1760,年,) :,,,A=lg(I,0,/I,t,)=k,1,b,,当入射光的,λ,,吸光物质的,c,一定时,,,溶液的吸光度,A,与液层厚度,b,成正比。,,比尔定律,(1852,年,):,,A=lg(I,0,/I,t,)=k,2,c,,当入射光的,λ,,液层厚度

16、,b,一定时,,,溶液的吸光度,A,与吸光物质的,c,成正比。,,34,精选PPT课件-可见分光光度法,,朗伯,-,比尔定律,,,,,式中：,A,：吸光度；,,,T,:,透射率；,,,b,：液层厚度,(,光程长度,),，通常以,cm,为单位；,,,c,：溶液的浓度，单位,mol·L,-1,或,g·L,-1,；,,,K,：吸光系数,,,意义,:,当一束平行单色光通过均匀、非散射的溶液时，其吸光度与溶液中吸光质点的浓度和吸收层厚度的乘积成正比,.,,35,精选PPT课件-可见分光光度法,值得注意的是：,,透过率,T,与,c,或,b,之间的关系是,指数函数,关系．,,吸光度,A,与,c,或,b,之间

17、是简单的,正比例,关系．,,1.0,,,,0.5,,,,0,A,C,C,100,,,,,,,50,,,,,,0,T %,,T,＝10,–,A,=10,-,Kb c,,A,＝,-lg,T,＝-lg(,I,t,/,I,0,)=,K b c,,36,精选PPT课件-可见分光光度法,应明确定律的三个应用条件：,,1,）稀溶液（,C,＜,0.01mol/L),,2,）入射光为单色光,,3,）均匀介质，可以为固体、液体和气体,,,吸光度特性,——,加和性：,,A,总,=A,1,+A,2,+A,3,+A,4,…..,,,37,精选PPT课件-可见分光光度法,吸光系数,（,Absorptivity）,,,c

18、---,mol / L,,ε,---,摩尔吸光系数,,,L · mol,–1,· cm,-1,c--,g / L,,a---,吸光系数,,,L · g,–1,· cm,-1,c--,g / 100 mL,,E,1%,1cm,---比吸光系数,,100mL · g,–1,· cm,-1,表示方法,,,,,相互换算：,38,精选PPT课件-可见分光光度法,摩尔吸光系数,ε,,,物理意义：,当一定波长的单色光通过浓,度为,1mol/L,， 吸收池厚度为,1cm,的溶液时测得的吸光度。,,入射波长不同，,ε,不同,,溶剂不同，,ε,不同,,物质性质不同，,ε,不同,,,,,,,ε,可作为定性依据,39

19、,精选PPT课件-可见分光光度法,在最大吸收波长,λ,max,处，常以,ε,max,表示 。,,,40,精选PPT课件-可见分光光度法,（二）,偏离,Beer,定律,的因素,,偏离,Beer,定律的主要因素表现为以下两个方面,:,,1,）光学因素,,2,）与试样溶液有关的因素,,,1.0,,,,0.5,,,,0,A,C,,,正偏离,负偏离,41,精选PPT课件-可见分光光度法,1.,光学因素,,,1,）非单色光的影响：,,非单色光指的是包含一定波长范围的有限宽度的谱带，是以,λ,０,（中心吸收波长）为中心的一狭窄波长范围的复合光，对于带宽为△,λ,（即图中的Ｓ＝,λ,２,－,λ,１,）的单色光

20、，测得的吸光度一般小于,λ,０,处的真实吸光度值，从而产生负偏离。,,42,精选PPT课件-可见分光光度法,2,）杂散光的影响：,,,杂散光是指从单色器分出的光不在入射光谱带宽度范围内，与所选波长相距较远。,,杂散光来源：仪器本身缺陷；光学元件污染造成。,,◆,若样品不吸收,I,S,,则（,I,0,+I,s,）／（,I+I,s,）＜,I,0,／,I,， 使,A,↓,◆,若样品吸收,I,S,，则反之，Ａ,↑。,,43,精选PPT课件-可见分光光度法,2.,溶液的物理及化学因素的影响,１）溶液浓度的影响,,Beer,定律的假定：所有的吸光质点之间不发生相互作用；,,假定只有在稀溶液,(C < 1

21、0,-2,mol/L),时才基本符合。当溶液浓度,C>10,-2,mol/L,时，吸光质点间可能发生缔合等相互作用，直接影响了对光的吸收。,,44,精选PPT课件-可见分光光度法,２）体系（介质）不均匀的影响,,根据定律的应用条件之三（即均匀介质），一般真溶液质点小，对光的散射不特别厉害，但混浊液散射比较突出。,,胶体、乳胶、悬浮物、沉淀等非均相体系产生的光散射会引起对朗伯,-,比耳定律的偏离。,,解决的办法：用空白做对比。,,45,精选PPT课件-可见分光光度法,第三节　紫外,-,可见分光光度计,,一、分光光度计的主要部件,,,,,,碘钨灯,氘灯,单色器,,,,,,,参比池,样品池,,,,,

22、,,,,,光电倍增管,数据处理和仪器控制,,,光源,样品池,单色器,检测器,数据处理,,仪器控制,46,精选PPT课件-可见分光光度法,,白炽光源：如钨丝灯、碘钨灯,(,可见光区，,320,～,2500 nm),,气体放电光源：如氢弧灯（氢灯）、重氢灯（氘灯）,(,紫外区，,180,～,375 nm),、 氙灯（紫外、可见光区均可用作光源）,,,,1.,光源（辐射源）,,47,精选PPT课件-可见分光光度法,,,48,精选PPT课件-可见分光光度法,２．单色器,作用：将光源辐射的复合光按波的长短顺序色散为单色光,,包括,狭缝、准直镜、色散元件,,1),狭缝,,入口狭缝：限制杂散光的进入,,出口

23、狭缝：让色散后所需波长的光通过。,,2,）,准直镜（透镜或反射镜）,,把来自入口狭缝的发散光变成平行光,,把来自色散元件的平行光聚焦于出口狭缝。,,49,精选PPT课件-可见分光光度法,3,）色散元件,,常用的色散元件有,三角棱镜和光栅,,棱镜,：依据不同波长光通过棱镜时折射率不同,,50,精选PPT课件-可见分光光度法,光栅,,在镀铝的玻璃表面刻有数量很大的等宽度等间距条痕,(600,，,1200,，,2400,条,/mm ),，利用光通过光栅时发生衍射和干涉现象而分光。,,优点：波长范围宽,,,色散均匀,,,分辨性能好,,,使用方便,,,,51,精选PPT课件-可见分光光度法,3,．吸收池

24、,又名,:,比色皿,，用于盛待测及参比溶液,,玻璃,——,能吸收,UV,光，仅适用于可见光区,,石英,——,不能吸收紫外光，适用于紫外和可见光区,,要求：匹配性（对光的吸收和反射应一致）,,52,精选PPT课件-可见分光光度法,4,．检测器,作用：是检测通过溶液后的透过光强度　　（光信号，并把光信号转变成电信号）,,１）光电管,,,锑铯作阴极：紫敏（,200,～,6,25nm),,,银／氧化银：红敏（,625,～,1000nm),,,,,,,,,,,,,,,90V DC,,直流放大,阴极,,R,-,+,光束,e,阳极丝（,Ni,）,抽真空,53,精选PPT课件-可见分光光度法,２）光电倍增管

25、（,photomultiplier tube, PMT,）,,,,,,,,,,,石英套,光束,,栅极，,Grill,阳极,屏蔽,光电倍增管的放大倍数，主要取决于电极间的电压。,,,,,,54,精选PPT课件-可见分光光度法,二、分光光度计的类型,55,精选PPT课件-可见分光光度法,１．单波长单光束分光光度计,,56,精选PPT课件-可见分光光度法,,特点：,,结构简单、价格低廉,,使用时来回拉动吸收池→移动误差,,比色池配对,,受光源、检测器的波动影响,,不能自动记录吸收光谱。,,57,精选PPT课件-可见分光光度法,2,．单波长双光束分光光度计,,58,精选PPT课件-可见分光光度法,59

26、,精选PPT课件-可见分光光度法,,特点：,,不用拉动吸收池，可以减小移动误差,,比切光器的频率慢的光源、检测器的波动不影响,,可以自动扫描吸收光谱,60,精选PPT课件-可见分光光度法,３．双波长分光光度计,,61,精选PPT课件-可见分光光度法,特点：,,利用吸光度差值定量,,消除干扰和吸收池不匹配引起的误差,,比切光器的频率慢的光源、检测器的波动不影响,,,62,精选PPT课件-可见分光光度法,三种分光光度计的区别,,63,精选PPT课件-可见分光光度法,第四节 分析条件的选择,一、溶剂选择,,1.,考虑溶剂的截止波长,,截止波长,：用,1cm,光径的吸收池装溶剂，用空气为参比，改

27、变照射波长，当吸光度,A,＝,l,时，此时的波长称为该溶剂的截止波长。,,在选择测量波长时注意：溶剂必须能让所选择的光透过，即所选波长不能小于溶剂的最低使用波长（,截止波长）,。,,,,,,64,精选PPT课件-可见分光光度法,65,2.,考虑溶剂的极性,,溶剂的极性对物质的吸收峰位置的影响不同,,当极性增加时，,,π→π,*,的吸收峰,发生长移（红移）,,n→π*,的吸收峰,发生短移（蓝移、紫移）,,,△,,E,n →π*,,,△,,E,π→π*,,,△,,E,n →π*,,,△,,E,π→π*,,无溶剂化作用,有溶剂化作用,π,π,*,n,π,π,*,n,65,精选PPT课件-可见分光光度

28、法,,,二、显色反应条件的选择,,（一）显色反应及要求,,1.,显色反应,,显色剂,：能与无色物质生成有色物质的试剂,,显色反应,：将被测组分转变成有色物质的反应,,常见的显色反应,：配位、偶合、氧化还原反应,,,,66,精选PPT课件-可见分光光度法,２．显色反应的要求,,,灵敏度高,，一般,ε> 10,4,;,,选择性好,，干扰少；,,对照性好,：显色剂在测定波长处无明显吸收,,,,△,λ,max > 60 nm;,,反应生成的有色化合物,组成恒定，稳定,;,,显色条件易于控制，,重现性好,,,,67,精选PPT课件-可见分光光度法,（二）显色反应条件的选择,,１．显色剂的用量：,,M,,

29、+,,R,,MR,,（待测物）（显色剂） （有色物）,,68,精选PPT课件-可见分光光度法,２,.,溶液的酸度,,1,）酸度对显色剂颜色的影响,,许多有机显色剂本身就是酸碱指示剂，当溶液酸度改变时，显色剂本身就有颜色变化,,2,）酸度对显色反应的影响,,ＨＲ　　　　Ｈ,＋,＋　　Ｒ,－,＋　　　　　　　　　　　　 　Ｍ,＋,ＭＲ,,,69,精选PPT课件-可见分光光度法,(3),酸度对金属离子存在状态的影响,,当被测离子是容易水解的金属离子时，若酸度低于某一限度，被测离子形成,羟基配合物、多核羟基配合物、碱式盐或氢氧化物沉淀,，,不利于光度分析。,,70,精选PPT课件-可见分光光度法,3

30、,．显色温度,,当温度升高：,,（,1,）反应速度加快；,,（,2,）某些有色配合物发生分解或氧化还原反应；,,（,3,）使有色配合物的摩尔吸光系数改变,,,,71,精选PPT课件-可见分光光度法,A,4,．显色时间,,显色反应可能：,,瞬间完成，长时间内保持不变；,,迅速完成，但颜色逐渐减退；,,需要一定时间才能完成。,,72,精选PPT课件-可见分光光度法,５,.,干扰的消除（样品成份较复杂时）,,消除办法有：　１）加入配合掩蔽剂　２）加入氧化剂或还原剂　３）选择适宜的显色条件，控制酸度．　４）分离干扰离子,,73,,精选PPT课件,二、测量条件的选择,（一）测量波长的选择,,1,

31、）,λ,max,,吸光度大，灵敏度高,2,）若,λ,max,处有干扰，只能遵循“吸收大，干扰小”的原则，可选另一灵敏度稍低．但能避免干扰的入射光波长。,,,,74,精选PPT课件-可见分光光度法,（二）吸光度读数范围的选择,,光度误差：指的是读数误差为单位百分透光度（,ΔT%,,=±1%,）时所引起的浓度相对误差（,ΔC,／,C,）,,分光光度计的读数标尺：,,75,精选PPT课件-可见分光光度法,由于,T,与浓度,c,不是线性关系，故不同浓度时的仪器读数误差∆,T,引起的测量误差∆,c/c,不同,。,,,,,其中：,ΔT→,为透光率读数误差,T →,为透光率大多数分光光度计的,ΔT,在,

32、±0.002,～,0.01,之间。,,76,精选PPT课件-可见分光光度法,在用分光光度计进行比色测定时，最好控制在：　　 Ｔ％在,15%,～,65%,A,在,0.8,～,0.2,之内读数比较合适,而当Ｔ％＝,36.8% ( T=0.368),,A = 0.4343,时，误差最小,,,77,精选PPT课件-可见分光光度法,（三）参比溶液,(reference solution),的选择,,也称,空白溶液,(blank solution),，作用是调节透光度Ｔ为,100%,,吸光度Ａ＝０,,有下列几种，应合理选择：１）溶剂参比：当溶液中只有待测组分在测定波长下有吸收，而其他组分均无吸收时，

33、,可用纯溶剂作参比溶液，称为“溶剂空白”,。,,78,精选PPT课件-可见分光光度法,２）试剂参比：,,如果除待测组分外，显色剂和其它试剂在测定条件下也有吸收时，则取与测定试液时所用的,显色剂和其它试剂作为参比溶液,（只是不加待测组分）,,,３）试样参比：,,如果只是试样基体有色，而显色剂无色，并且也不与试样基体显色，则用,不加显色剂的试样溶液作为参比溶液,,,79,精选PPT课件-可见分光光度法,４）平行操作空白：,,在测量波长下，干扰组分与显色剂有反应,,,又无法掩蔽消除时：,,①掩蔽被测组分，再加入显色剂,,,作参比,.,,②加入等量干扰组分到空白溶液中,,,作参比,.,,,80,精选P

34、PT课件-可见分光光度法,第五节　　定性与定量分析,一、定性分析,,1.,定性鉴别的依据：,光谱特征（光谱形状,,,吸收峰数目，吸收峰的波长位置，强度和吸收系数等）,,2.,定性分析方法缺陷：,,只能定性分析化合物所具有的生色团与助色团；,,光谱信息在紫外,-,可见光谱范围重叠现象严重。,,,81,精选PPT课件-可见分光光度法,,3.,定性鉴别的方法：对比法,,1,）对比吸收光谱的一致性,,同一测定条件下，与标准对照物谱图或标准谱图进行对照比较,,82,精选PPT课件-可见分光光度法,2,）对比吸收光谱的特征值,,83,精选PPT课件-可见分光光度法,二、定量分析及应用示例,,（一）定量分析

35、方法,,１．标准曲线法,,,前提：固定仪器和测定条件,84,精选PPT课件-可见分光光度法,例：,芦丁含量测定,,标液：分别移取,0.02000mg/ml,标样,0,～,5ml→25ml,,供试液：样品,25mg→25ml,0.710mg/25mL,85,精选PPT课件-可见分光光度法,２．直接比较法（对照法，外标一点法）,,前提：固定仪器和测定条件,,,截距为,0,,,标样与样品浓度相近,,过程：,λ,一定→分别测定,A,样,和,A,标,,,计算：,C,C,86,精选PPT课件-可见分光光度法,练习,例：维生素,B,12,,的水溶液在,361nm,处的百分吸光系数为,207,，用,1cm,比

36、色池测得某维生素,B,12,溶液的吸光度是,0.414,，求该溶液的浓度,解：,87,精选PPT课件-可见分光光度法,练习,例：精密称取,B,12,样品,25.0mg,，用水溶液配成,100ml,。精密吸取,10.00ml,，又置,100ml,容量瓶中，加水至刻度。取此溶液在,1cm,的吸收池中，于,361nm,处测定吸光度为,0.507,，求,B,12,的百分含量,解：,88,精选PPT课件-可见分光光度法,练习,例：,解：,89,精选PPT课件-可见分光光度法,练习,,解：,2,．精密称取,0.0500g,样品，置于,250mL,容量瓶中，加入,,,0.02mol/L HCL,溶解，稀释至

37、刻度。准确吸取,2mL,，稀释至,,,100mL,。以,0.02mol/L HCL,为空白,,,在,263nm,处用,1cm,吸收池,,测定透光率为,41.7%,，其摩尔吸光系数为,12000,，被测物分,,子量为,100.0,，试计算,263nm,处 和样品的百分含量。,90,精选PPT课件-可见分光光度法,３．双波长分光光度法（等吸收波长法）,,,400,500,600,700,800,0,50,100,150,200,,,,1,MAX,,2,a,b,,,A,λ,1,=,A,a,λ,1,+,A,b,λ,1,A,λ,2,=,,A,a,λ,2,+,A,b,λ,2,∆A=,,A,λ,1

38、,-,A,λ,2,=,,A,a,λ,1,+,A,b,λ,1,-,,A,a,λ,2,-,,A,b,λ,2,,∵,A,b,λ,2,=,,A,b,λ,1,,∴,∆A=,,A,a,λ,1,-,,A,a,λ,2,=,,（,ε,2,－,ε,1,）,b c,a,,,91,精选PPT课件-可见分光光度法,双波长法的优点：,,１）免了参比液，消除了比色皿所引起的误差．,,２）免解联立方程（只相对于单波长分次测而言）,,３）适合于混浊试样，有效地消除了背景吸收（因为Ａ,Ｓ,在,λ,1,,及,λ,2,处可以抵消）,,,4.,导数光谱法（略）,,5.,催化动力学分光光度法（略）,92,精选PPT课件-可见分光光度法,优点：１）使显色剂溶解度增加２）使,ε↑,３）,λ,max,红移４）能改变,pH,对配合物的影响,（二）应用示例（自学）,93,精选PPT课件-可见分光光度法,此课件下载可自行编辑修改，此课件供参考！,,部分内容来源于网络，如有侵权请与我联系删除！感谢你的观看！,此课件下载可自行编辑修改，此课件供参考！,,部分内容来源于网络，如有侵权请与我联系删除！感谢你的观看！,