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1、单击此处编辑母版标题样式,,单击此处编辑母版文本样式,,第二级,,第三级,,第四级,,第五级,,*,,*,,临床ELSA的基本原理和方法,,,,EL|SA的基本原理,,EL|SA是指以酶作为标记物、以抗原和抗体之间免疫,,结合反应为基础的固相吸附测定方法。因此,一个,,ELISA测定试剂,其有机组成部分包括:(1)包被,,的抗原或抗体的固相支持物,即聚苯乙烯塑料微孔或,,试管;(2)酶标记的抗体或抗原和(3)酶的反应底,,物等。抗原或抗体的固相化,并不影响其免疫结合活,,性,酶标记的抗体或抗原亦是如此,并且标记酶的活,,性不因标记过程而丧失。整个测定中,抗原与抗体的,,结合反应在固相支持物上进
2、行,反应结果的判断,以,,酶与其底物作用后的显色或产生荧光或发光反应为标,,准,显色或产生荧光或发光的强度,与临床标本中待,,测物的浓度成正比或反比关系。目前国内的ELSA试,,剂盒均以酶的显色反应来完成测定,,,,固相上抗原抗体相互作用的免疫化学,,通常所提到的抗原与抗体的相互作用,,一般指的是在液相状态下,而在固相状态,,下,抗原与抗体的结合反应有其相应的特,,点,主要表现在以下四个方面。,,,,)固相上抗原与抗体结合反应所需要的时间较液相状态,,下长,,通常,固相免疫测定如ELSA中,抗原与抗体结合达到,,平衡所需要的时间,较液相免疫测定要长,并随液体所占体,,积与界面抗体或抗原受体所占
3、体积比的增加而增加。当在微,,孔板孔内进行免疫测定时,界面反应动,,其对扩散作,,用有很强的依赖性,扩散性越强,则反应所需时间越短,结,,合越充分。这一点可通过旋转振荡来达到,微孔的旋转振荡,,可促使液体进入到可与抗体或抗原包被的界面接触的较小的,,区域内。也可在微孔中放,,性的塞子以使反应液体成为,,个小体积,或使用一个具有大表面的多孔的基质如硝酸纟,,维素,或使用微颗粒来做到这一点。微颗粒小于1μm时,在,,测定时即成胶体悬液,而当颗粒或珠较大时,则会在没有振,,荡时,由于重力的作用而分开。所有上述方法均是通过减少,,液体所占体积与界面抗体或抗原受体所占体积比,从而减少,,固相免疫测定的扩
4、散依赖,,,,二)固相上抗原与抗体接触表面的反应体积远小于液相,,测定,,此处的反应体积并非是微孔中的液体体积,而是固相,,免疫测定中与固相包被的抗体或抗原有接触的部分,这部,,分体积到底有,,难测定,但比反应,,液体体积,,要少得多。相抗原抗体反应发生于液体相界,,能处于一级结合键的引力距离内,小于100A。液相中待,,测抗原或抗体要进入到这个结合界面,需要经过扩散或质,,量转移。微颗粒的反应表面区域较微孔要大得多,因而处,,抗原抗体结合界面的体积占总反应体积的比例亦高得多。,,反应的效率更,,这也是全自动化免疫测定分,,析仪均采用微颗粒固相的重要原,,可参与结合反应,,的抗体或抗原的浓度取
5、决于可参与结合的反应体积,,反应体积,从而难以使用通常的质量作用,,抗体反应的Keq,,值与液相抗原与抗体反应的Keq值没有可比性,,,,(三)固相上抗原和抗体间结合后的离解速率较液相测定低,,固相免疫测定中固相表面上抗原和抗体间的相互作用,类似于细胞,,表面上蛋白与其受体间的结,,表明,细胞表面上的蛋白与受体结,,应的离,,免疫测定,,涉及到细胞表面受体的聚,,由于多价复合物离解的减,,合力增加。研,,想的拉原和体也是成簇或集,,的离解,,呔其结佥所需的能昰要大·表明在初始結拿键形成后,又形成了恣级结,,的和来,,或抗原,常以很高的浓度,,使抗原和抗体有离解发,,较液,,种极缓慢的,,使得E
6、LSA和固相免疫测,,测定的反复洗涤步骤,也可使受体配体,,保持处于结合状态。,,,,(四)微孔内特异抗体免疫测定的亲和力依赖性,,使用固相包被的复杂抗原进行微孔内特异抗体的免疫测定,与液,,相测定,,相互作用的稳定,,微孔内特异抗体的免疫测定亲和力依赖性和极,,抗原浓度极,,附的抗原因为变性或空间位阻而致抗原表位丧失的结,,由于固相吸附发,,异拉体与甚结仓的亲和,,/m浓度被动吸,,的60-80%,,的吸,,在固相,,就,,500-800ng抗,,m抗体的血清的,,000稀释可提供大于10倍过量的,,吸附,,限性,不能解,,结合的低亲和力,而更可能是由于,,的丧失所致,,,,(五)固相的抗体
7、或抗原与液相中的抗体或,,抗原在构型上不一样,,固相化的抗体或抗原可能与液相中的抗体,,或抗原所展示的构型不一样,对抗体或抗原,,由于固相化尤其是被动吸附或其它吸附方式,,所致的构型改变已有众多的文献报道,,,,临床ELsA测定的常用模式,,ELSA依其测定抗原和抗体的不同,测定模式有,,很多,如直接法、间接法、双抗体夹心法(直接、,,司接)、竞争抑制法(直接、夹心等)、捕获法,,等[4]。在临床实验室,常用的ELSA测定模式有,,双抗体夹心法、间接法、双抗原夹心法、竞争抑,,制法和捕获法等。在抗原的测定上,蛋白大分子,,抗原测定用的最多的模式是双抗体夹心法,而对,,只有单个抗原表位的小分子,
8、则使用竞争抑制法,,抗体的测定通常使用间接法、双抗原夹心法、竞,,争抑制法和捕获法等。,,,,(一)抗原测定ELSA模式,,1.双抗体夹心法对于含多个抗原表位的大分子蛋白,使用双抗体,,lSA模式测定相当简便,现有的测蛋白抗原的商品试剂盒基本上,,都采用此种测定模式。具体测定方法如下。,,(1)首先以双抗体之一于碳酸盐缓冲液中2~8℃下过夜包被聚苯乙烯,,固相,形成固相,,洗涤去除未与固相结合或结,,牛血清或牛血清白蛋白或明胶等封闭,洗涤去除未结合的部分及杂,,(2)加入含待测物的临床样本如血清(浆)等,温育(通常为37℃,,后,洗板;此时,待测抗原就会与固相上特异抗体结合而,,吸附于固相,,(3)加入酶标记的双抗体,,温育(通常为37℃,,定时间后,,洗板;此时,在固相上即形成双抗体与特异抗原的夹心产物。,,(4)加入酶底物,温育(通常为37℃下)显色测定,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,
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