生物制药技术(三)

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1、单击此处编辑母版标题样式,,单击此处编辑母版文本样式,,第二级,,第三级,,第四级,,第五级,,,*,第三章,,细胞工程制药,,,细胞工程,(cell engineering),是指应用现代细胞生物学、发育生物学、遗传学和分子生物学的理论与方法，按照人们的需要和设计，在细胞水平上的遗传操作，并通过细胞融合、,,核质移植、染色体或基因移植以及组织和细胞培养等方法，快速繁殖和培养出人们所需要的新物种的生物工程技术。,,1665,年英国物理学家胡克用自制的显微镜发现了细胞,.,胡克所用的显微镜及观察的栎树细胞壁,,1674,年荷兰科学家列文虎克才真正观察到了细胞,细胞是一切生命活动的基本结构和功能单

2、位。,,第一节 细胞融合,,,细胞融合,（,cell fusion),，又称体细胞杂交（,somatichybridiazation,），是指两个或更多个相同或不同细胞通过膜融合形成单个细胞的过程。,一、细胞融合的定义,广义：,,细胞融合,是指用人工方法使两种或两种以上的体细胞合并形成一个细,,胞，不经过有性生殖过程而得到杂种细胞的方法。,狭义：,,Muller,于,1838,年观察到脊椎动的肿瘤细胞能在体内自发地融合产生多核的肿瘤细胞。,,,Virchow,于,1858,年描述了正常组织、发炎组织以及肿瘤组织中的多核细胞现象。,,,Luginbuhl,于,1873,年观察到天花病人的血液中

3、也有多核的血细胞存在。,,,Lange,于,1875,年第一个观察到脊椎动物（蛙类）的血液细胞发生融合的过程。,,,Cienkawski(1876),、,Buck(1877),、,Geddes(1880),在无脊椎动中发现了细胞合并现象。,,,1958,年日本学者冈田（,Okada,）发现仙台病毒具有触发动物细胞融合的效应。,,,1974,年华裔加拿大学者高国楠创立了聚乙二醇（,PEG,）化学融合法。,,,1975,年,Kohler,和,Milstein,成功地融合了小鼠,B-,淋巴细胞和骨髓瘤细胞而产生能分泌预定单克隆抗体的杂交瘤细胞。,,,20,世纪,80,年代出现了电融合技术。,二、细胞

4、融合研究进展,,生物种类,细胞来源,成功年代,烟草两个种间,,苷蓝,——,青菜,,大豆,——,马唐草,,矮牵牛,——,龙面花,,大麦,——,花生,,大麦,——,大豆,,小麦,——,矮牵牛,,油菜,——,大豆,,玉米,——,大豆,,大豆,——,野豌豆,,大麦,——,蚕豆,,大豆,——,草香木犀,,酵母菌,——,鸡,,大豆,——,烟草,,大豆,——,秋水仙,,人,——,胡萝卜,,番茄,——,马铃薯,,人,——,小鼠,叶,——,叶,,叶,——,根,,愈伤组织,——,叶,,叶,——,花瓣,,种子,——,种子,,叶,——,悬浮细胞,,叶,——,花瓣,,叶,——,悬浮细胞,,叶,——,悬浮细胞,,悬浮细胞

5、,——,悬浮细胞,,叶,——,根,,悬浮细胞,——,叶,,原生质体,——,血红细胞,,悬浮细胞,——,叶,,悬浮细胞,——,叶,,腹水癌细胞,——,原生质体,,叶,——,根尖,,纤维肉瘤细胞,——,畸胎瘤细胞,1972,,1972,,1972,,1972,,1972,,1972,,1972,,1972,,1972,,1972,,1972,,1972,,1972,,1972,,1972,,1972,,1972,,1972,几种细胞融合成功的例子,,植物融合细胞成长状态对比,,,右瓶为地面融合的细胞，左瓶中为太空微重力环境下融合的细胞,,,动物细胞融合实验使用的小白鼠,,三、细胞融合的意义,理论上

6、说任何细胞，都有可能通过体细胞杂交而成为新的生物资源。这对于种质资源的开发和利用具有深远的意义。,,融合过程不存在有性杂交过程中的种性隔离,,机制的限制，为远缘物种间的遗传物质交换提供了有效途径。,,体细胞杂交产生的杂种细胞含有来自双亲的核外遗传系统，从而产生新的核外遗传系统。,,,四、细胞融合的方法,诱导细胞融合的方法有,3,种,:,生物方法,(,常用仙台病毒,),,化学方法,(,常用聚乙二醇,),物理方法,,(,电激和激光,),,,1,、仙台病毒法,① 两个原生质体或细胞在病毒黏结作用下彼此靠近；,,② 通过病毒与原生质体或细胞膜的作用使两个细胞膜间互相渗透，胞质互相渗透；,,③ 两个原生

7、质体的细胞核互相融合，两个细胞融为一体；,,④ 进入正常的细胞分裂途径，分裂成含有两种染色体的杂种细胞。,,,仙台病毒诱导细胞融合经四个阶段：,,病毒促使细胞融合的主要步骤如下：,,① 两种细胞在一起培养，加入病毒，在,4℃,条件下病毒附着在细胞膜上。并使两细胞相互凝聚；,,② 在,37℃,中，病毒与细胞膜发生反应，细胞膜受到破环，此时需要,Ca,2+,和,Mg,2+,，最适,PH,为,8.0,一,8.2,；,,③,细胞膜连接部穿通，周边连接部修复，此时需,Ca2+,和,ATP,；,,④ 融合成巨大细胞，仍需,ATP,。,,用灭活的病毒诱导的动物细胞融合过程示意图,,,,聚乙二醇,(PEG),

8、结构为：,HOH,2,C,（,CH,20,CH,2,）,n,CH,2,OH,，分子量大于,,,200,小于,6000,者均可用作细胞融合剂。,,PEG,浓度以,W/W,；如将,10,克,PEG,与,10mlEagLe,氏液混合（假定,1ml,,,培养液为,1g,重,),，即成,50,％,PEG,溶液。,,PEG,经高压灭菌后，与温热的,Engle,氏液混合。,,通常用分子量低于,1000,的,PEG,作融合剂最好，,50,％,PEG,溶液能产生,,最多杂交细胞。,,PEG,溶液在,pH6.0,时细胞融合率最高。,2,、聚乙二醇（,PEG,）法,,聚乙二醇（,PEG,）法细胞融合过程,,PEG,

9、的作用机理,： 由于,PEG,分子具有轻微的负极性，故可以与具有正极性基团的水、蛋白质和碳水化合物等形成,H,键，从而在在质膜之间形成分子桥，其结果是使细胞质膜发生粘连进而促使质膜的融合；另外，,PEG,能增加类脂膜的流动性，也使细胞的核、细胞器发生融合成为可能。,,PEG,诱导融合的特点,：,其优点是融合成本低，勿需特殊设备；融合子产生的异核率较高；融合过程不受物种限制。其缺点是融合过程繁琐，,PEG,可能对细胞有毒害。,,聚乙二醇（,PEG,）法,细胞融合步骤,,,（,1,）将两种不同亲本细胞各,5×l0,6,混匀；,,（,2,）离心沉淀，吸去上清液；,,（,3,）加,1ml 50,％,P

10、EG,溶液，用吸管吹打，使之与细胞接触,1,分钟；,,（,4,）加,9ml,培养液，离心沉淀，吸去上清液；,,（,5,）加,5ml,培养液，分别接种,5,个直径,60mm,平皿，每个平皿加培养,,液至,5ml,，,37℃,的,CO,2,培养箱中培养。,,（,6,）,6—24,小时后，换成选择培养液筛选杂交细胞。,,,3,、电融合法,电融合法是,80,年代出现的细胞融合技术，在直流电脉冲的诱导下，细胞膜表面的氧化还原电位发生改变，使异种细胞粘合并发生质膜瞬间破裂，进而质膜开始连接，直到闭和成完整的膜，形成融合体。,,,电融合法的优点：,,融合率高、重复性强、对细胞伤害小；,,装置精巧、方法简单、

11、可在显微镜下观察或录像观察融合过程；,,免去,PEG,诱导后的洗涤过程、诱导过程可控性强。,,,电融合的基本过程：,,细胞膜的接触：,当原生质体置于电导率很低的溶液中时，电场通电后，电流即通过原生质体而不是通过溶液，其结果是原生质体在电场作用下极化而产生偶极子，从而使原生质体紧密接触排列成串；,,膜的击穿：,原生质体成串排列后，立即给予高频直流脉冲就可以使原生质膜击穿，从而导致两个紧密接触的细胞融合在一起。,,,电融合诱导法原理示意图,,五、影响细胞融合的因素,1,、亲本细胞表面性质,,2,、亲本细胞种类,,3,、细胞融合时的温度和运动状态,,4,、通氧状态,,5,、,PEG,,6,、离子浓度

12、及种类,,7,、,PH,值,,,,六、细胞融合的基本操作过程,① 制备原生质体,,,由于微生物及植物细胞具有坚硬的细胞壁，因此通常需用酶将其壁降解。动物细胞则无此障碍。,,,② 诱导细胞融合,,,两亲本细胞,(,原生质体,),的悬浮液调至一定细胞密度，按适当比例混合后，逐渐滴人高浓度的聚乙二醇,(PEC),等诱导融合，或用电激的方法促进融合。,,,③ 筛选杂合细胞,,,将上述混合液移到特定的筛选培养基上，让目的杂合细胞生长，其他细胞无法生长。藉此获得具有双亲遗传特性的杂合细胞。,,植物细胞融合过程,人造小鼠培育过程示意图,,七、 杂种细胞的筛选,根据已经发生融合的细胞中所含有核的类型，可将其

13、分为以下几种类型：,,异核细胞：非同源细胞的融合体。,,同核细胞：两个相同细胞的融合体。,,多核细胞：含有双亲不同比例核物质的融合体。,,常用的杂种细胞筛选方法：,基于酶缺陷型细胞和药物抗性所建立的杂种筛选,,基于营养缺陷型细胞所建立的杂种筛选,,由温度敏感型细胞组成的杂种细胞的筛选,,具有所需性状杂种细胞的筛选,,第二节,,动物细胞培养技术及其应用,,一、通过动物细胞培养可生产的生物制品,1、病毒疫苗,,2、非抗体免疫调节剂,,3、多肽生长因子,,4、激素,,5、酶,,6、病毒杀虫剂,,7、肿瘤特异性抗原,8、单克隆抗体,,9、细胞本身,,二、 动物细胞的形态和生理特点,1,、动物细胞的形态

14、,动物细胞属于真核细胞，结构复杂，分化精确，不同细胞执行不同的功能，具有不同的形态。,但细胞在离体培养时形态会发生变化，根据不同的需要将离体培养的细胞分为：,,,贴壁细胞,、,悬浮细胞,和,兼性贴壁细胞,。,,（,1,）、,贴壁细胞,（,anchoraged-dependent cell,,）,,生长时必须要有给以贴附的支持物表面，细胞依靠自身分泌的或培养基中提供的贴附因子才能在该表面上生长和繁殖。,,,大多数动物细胞都属于此类。,,,,贴壁细胞,在表面上生长时有两种形态,:,,成纤维样细胞型和上皮样细胞型。,,（,2,）、,非,贴壁细胞,（,anchoraged-independent ce

15、ll,）,生长不依赖支持物表面，在培养液中悬浮生长。,,如：血液、淋巴细胞、肿瘤细胞和某些转 化细胞，,Namalwa,细胞。,,（,3,）,兼性贴壁细胞,,对支持物的依赖性不严格，既可贴壁生长， 也可悬浮生长。,,,如：,CHO,细胞、,BHK,细胞、,L929,细胞。 理想的药物生产细胞系,,2,、动物细胞生理特点,,（,1,）分裂期长 ，细胞生长缓慢，易受微生物污,,染，培养时需要抗生素。,（,2,）细胞生长需贴附于基质，并有接触抑制现象。,（,6,）动物细胞蛋白质的合成在内质网上进行，,,多数为糖蛋白，需要糖基化。,（,3,）正常二倍体细胞的寿命是有限的，正常二倍体细胞传代培养都是有限

16、的。,（,4,）动物细胞对周围环境十分敏感。,（,5,）动物细胞对培养基要求很高。,,,,动物细胞能精确地转译和加工较大或更复杂的克隆蛋白质,;,多半可分泌到细胞外，提取纯化方便,;,蛋白质经糖基化修饰后与天然产物更一致，适合于临床应用。,,,动物细胞作为宿主细胞生产药物优点：,,缺点：,培养条件要求高、成本高、产量低。,,三、生产用动物细胞的获得,直接取自动物组织、器官，经过粉碎、消化后获得的细胞悬液。,1,、原代细胞,,原代细胞经过传代、筛选和克隆，从而从多种细胞成分的组织中挑选并纯化出某种具有一定特征的细胞株。,2,、二倍体细胞,,通过转化形成，变成了异倍体，有无限增殖能力。转化可自发，

17、在传代过程中自己转变成可无限增殖的细胞；也可人为转化，采用某些试剂处理，或从动物的肿瘤组织中建立的细胞系。,3,、转化细胞系,,常用的生产用动物细胞：,WI-38,：人二倍体细胞系，成纤维细胞，能产生胶原，,,倍增时间为,24,小时，有限寿命,50,代，用于制,,备疫苗。,MRC-5,：人二倍体细胞系，成纤维细胞，有限寿命,42-,,46,代，用于制备疫苗。,CHO-K1,：从中国仓鼠卵巢中分离的上皮样细胞，用于,,构建工程菌。,BHK-21,：从仓鼠幼鼠的肾脏中分离。成纤维样细胞，,,用于构建工程菌，可生产疫苗。,Vero,： 从非洲绿猴肾中分离，贴壁依赖的成纤维细,,胞，用于制备疫苗。

18、,Namalwa,：从淋巴瘤病人分离，生产干扰素。,SP2/0-Ag14,：从抗羊红细胞活性的小鼠脾细胞和骨髓,,瘤细胞系融合获得，生产单克隆抗体。,,四、 动物细胞的培养条件和培养基,1,、动物细胞在体外培养所需条件,（,1,）水质要求：,培养时常采用经活性炭、微滤、超滤、反渗透四级净化处理制得的达到国家标准的纯 净水。,（,2,）,pH,：,影响细胞的存活力，生长及代谢，细胞生长的最适,pH,因细胞类型不同而异，范围为,7.0-7.5,。,,,（,3,）渗透压：,在细胞培养的所有操作中，为了使与细胞接触的所有液体都保持较合适的渗透压,,和,pH,,都必须采用等渗的溶液。,,（,4,）温度：

19、,动物细胞对温度特别敏感，一般动物细胞特别是哺乳动物细胞的最佳培养温度为,(37,士,0.5℃),。,（,5,）,溶氧：,保证有适量的氧气供应。,,,（,6,）灭菌：,所有的与细胞接触的设备、器材和溶液都必须保持绝对无菌，避免污染。,,2,、动物培养基的种类和组成,（,1,）、天然培养基：血浆凝块、血清、淋巴液、胚胎浸液、羊水、腹水。,（,2,）、合成培养基：组成稳定、可大量生产供应，成分为氨基酸、维生素、糖类、无机盐、小牛血清等。,（,3,）、无血清培养基：在天然或合成培养基的基础上添加激素、生长因子、结合蛋白、贴附和伸展因子及其他元素。,,,,（,1,）提供激素及低分子量营养物。,,（,2

20、,）提供结合蛋白质，能识别维生素、脂类、,,金属和其他激素等。,,（,3,）有些情况下，结合蛋白能与有毒金属和热,,原结合，起到解毒作用,,（,4,）起酸碱度缓冲剂作用。,,（,5,）提供蛋白酶抑制剂，使细胞传代时使用的,,胰蛋白酶失活，保护细胞不受损伤。,,血清主要功能：,,,（,1,）在进行激素和药物研究时，血清成分与激素或药物结合的结果，干扰了其对细胞的作用。,,（,2,）在进行细胞营养研究时，由于血清组成的复杂和不稳定，妨碍对细胞营养要求的确切了解。,,血清对实验的负面影响：,（3）干扰对培养细胞释放产物的分析,,（4）血清只能过滤消毒，过滤消毒只能除去细菌，但不能除去血清中可能含有的

21、病毒和支原体。,,（5）血清中可能有抑制病毒的因素，干扰病毒研究实验。,,,,五、动物细胞,大规模,培养技术,1,、动物细胞的大规模培养方法,(1),悬浮培养,（,2,）贴壁培养,（,3,）贴壁,-,悬浮培养,①微载体培养,②包埋培养,③微曩培养,,(1),悬浮培养,所谓悬浮培养，是指细胞在生物反应器中自由地悬浮于培养基中生长增殖的过程。,,,优点：,操作简便，培养条件较均一，传质和传氧较好，放大效应小，设备相对简单，可以借鉴微,,生物工程的经验。,,,缺点：,细胞密度较低。,,（,2,）贴壁培养,贴壁培养是让细胞贴附于某种固体表面生长繁殖的培养方法。,,优点：,适用的细胞种类广，较容易使细胞

22、达到较,,高密度。生产上一般采用转瓶培养，具有投资少、设备简单、技术成熟、重现性高、放大只是简单地增加转瓶数的优点,,缺点：,劳动强度大、操作手续繁琐、占用空间大、按体积,,计算产率低、监测和控制环境条件受到限制等。,,（,3,）贴壁,-,悬浮培养,①微载体培养,微载体培养即 是指将贴附着贴壁细胞的微载体悬浮于培养基中，使细胞在微珠表面生长繁殖的培养方式。,优点,:,a.,比表面积大，它的单位体积培养基的细胞产率高,;,,b.,具有悬浮培养和贴壁培养两种培养的优点，简化了细胞生长各种环境因素的检测和控制，培养系统重现性好,;c.,用简便的显微镜观察即能监测出细胞在微珠表面的生长情况,;d.,培

23、养基利用率高,;e.,收获细胞过程简单,; f.,放大容易,；,g.,劳动强度小,;,,h.,培养系统占用空间小。,,② 包埋培养,将动,,物细胞与海藻酸钠混匀,(,此时呈液态,),，然后将这种混合液滴入到,CaCl,2,溶液中，即形成海,,藻酸钙凝胶，此凝胶颗粒如上述微载体一样可用于悬浮培养。,,优点：,负荷量大、细胞泄,,漏少、制备方法简单、细胞因被保护抗机械剪切力强、抗污染能力强。,,缺点：,存在扩散,,限制，如大分子基质不能渗透进凝胶内，颗粒太大时细胞生长不良,.,,③微曩培养,把生物活性物质完整的活细胞或组织包在薄的半透膜中，即称为微囊技术。营养物质和氧可通过膜孔进入囊内，细胞代谢的

24、小分子产物可排出囊外，分泌的大分子产物，不能透过膜孔，积聚在囊内。,,优点：,a.,细胞密度大,；,b.,产物单位体积浓度高,；,c.,分离纯化操作经济简便,,,产品纯度高。,,缺点：,但微囊技术成功率一般只有百分之五十左右，培养液用量大，囊内部分死亡细胞对产物污染。,,2,、动物细胞大规模培养操作方式,（,1,）、分批式培养,,分批式培养是指将细胞和培养基一次性装人反应器内进行培养。细胞不断生长，营养不断消耗，产物不断形成。经过一段时间培养后，将整个培养液,(,连同细胞,),取出，进行产物分离。,CO,2,培养箱,,（,2,）、半连续式培养,,半连续式培养又称为反复分批式培养或换液培养，是指

25、在分批式操作的基础上，取出部分反应液，剩余部分重新补充新的营养成分，再按分批式操作的方式进行培养。,,3.,灌流式培养,,灌流式培养是指细胞接种后进行培养，一方面新鲜培养基不断加人反应器，另一方面又将反应液不断地取出，但细胞停留在反应器内，使细胞处于一种恒定的营养状态。,,3,,、,动物细胞大规模培养生物反应器,①,优良的传质、传热、混合性能，且对动物细胞剪切力小,;,,②,理化参,,数易于检测和调节控制,;,,③,可用高压蒸汽灭菌,;,,④,结构简单、清洗操作方便,;,,⑤,密封性能好。,理想的反应器应具备的性能,:,,（,1,）、通气搅拌反应器,,（,2,）、气升式生物反应器：,,,,空气

26、提升式生物反应器两种构型：,,内循环式、外循环式,,,,,空气流速一般控制在,0.01,～,0.06,m,3,/m,3,.min,,反应器高径比一般为,(3:1),～,(12:1),,,,,（,1,）没有移动部件，产生的湍动温和而均匀，剪切力相当小，细胞损伤率比较低。,,（,2,）完全密封，便于无菌操作，不易污染。,,（,3,）设计简单，便于放大生产。,,（,4,）直接喷射空气供氧，氧传递速率高，液体循环量大，使细胞和营养成分能均匀地分布于培养基中。,,优点：,,（,3,）、中空纤维生物反应器,,第三节,,植物细胞培养技术及其应用,叶绿体,线粒体,细胞壁,细胞膜,液泡,细胞质,光面内质网,细胞

27、核,粗面内质网,高尔基体,,植物,细胞培养,技术就是为了某种目的而在细胞水平上对离体植物细胞或原生质体进行的一系列生物工艺学操作。它包括分离、培养、再生以及一系列相关的操作。,一、概念,,植物细胞全能性,二、植物细胞培养的,理论基础,,,植物细胞全能性,（,totipotency,）：指植物的每个细胞都包含着该物种的全部,遗传信息,，从而具备发育成完整植株的遗传能力。在适宜条件下，任何一个细胞都可以发育成一个新个体。,1958,年，美国科学家斯图尔德将胡萝卜韧皮部的一些细胞进行培养，由于细胞分化而最终发育成完整的新植株。,,,,植物体细胞培养产生完整植物示意图,细胞培养形成的胡萝卜植株,,,,

28、,植物细胞比微生物细胞大,5,0,～,,100倍。,,,在细胞培养过程中，其细胞形态有明显变化。,,,,三、植物细胞特性,,1、细胞形态特征：,,在间歇培养时，培养初期，多半是比较大的游离细胞，接着便开始分裂，随着分裂，原来较大的细胞分裂成一个一个较小的细胞，同时，较小的细胞聚集成细胞块，在生长停止后，细胞伸长、肥大，块状细胞游离分散。,,,,,植物细胞分批培养时，细胞生长呈,S,型曲线，植物细胞生长速度比较缓慢,。,,,,诱导期,,对数增殖,,,转换,,,衰减期,,,静,,止,,0 40 80 120 160

29、 200,,细胞浓度,(,g/L),,培养时间,(,h),,植物细胞生长曲线,,,2、植物细胞有纤维素细胞壁，细胞耐拉不耐扭，抵抗剪切力差。不能耐受强力通风搅拌。（一般为50,～,,100,r/min，,通气为：0.5,m,3,/ m,3,·min）,,,,植物细胞特性,,,3、,培养过程生长速度缓慢，易受微生物污染，需用抗生素。,,,,植物细胞特性,,,4、培养液粘度大，植物细胞体积大，在培养液中所占的容积可高达40%,～,50%，植物细胞培养液的粘度和微生物发酵液表现出明显不同，它随细胞浓度的增加，粘度显著上升。,,,植物细胞特性,,,植物细胞特性,,5、植物细胞的二级代谢产物大都

30、送到液泡内堆积而非如微生物排出细胞外，目前产量较低。,,植物细胞培养与微生物培养的比较,特性 微生物 植物细胞,,大小 2,μm,3,＞10,5,μm,3,,,单一细胞 经常 一般以群体发育,,由单细胞生长成细胞群 是 少有,,加成时间 大于1,h

31、 1,d,,接种浓度 小 细胞在培养液中浓度为5%,～,20%,,染色体数目 单或双倍体 单、双、多及不定倍体混合生长,,切力 不敏感 敏感,,单一培养的变异 安定 变异很大,,发育 可形成孢子或假菌丝 形成器官或胚,,通气需求 高，1,～,2,m,3,/m,3,.min,低，0.2,～0

32、.3,m,3,/m,3,.min,,产物形成 进入菌丝 进入液泡,,四、植物细胞培养条件,（一,),、外植体的制备,,,,所谓的外植体是指将外界生长的植物的细胞和组织经过一系列的无菌处理形成的有活性的无菌组织和细胞。,,制备外植体的原则是无菌和有活性，如果外植体被微生物污染则难以存活。,,（二）、无菌操作,,无菌操作是贯穿于整个组织培养过程的一门关键技术，甚至可以说组织培养的前提就是无菌。事实上外植体的制备过程就是无菌处理过程，而其后的一系列操作都是在无菌环境下进行的。,,（三）、人工培

33、养环境,,能否把植物组织培养做到满意的人工调控，关键在于人工培养环境，包括光照、温度、,,湿度、培养基等。,,,培养基包括植物生长必需的16种营养元素和某些生理活性物质。所有这些物质可概括为5大类：,,,,1、植物细胞培养基的营养成分,,,,,有,13,种植物必需的元素,,,N,、,P,、,K,、,Ca,、,Mg,、,S,、,Fe,、,B,、,Mn,、,Cu,、,Zn,、,Mo,、,Cl,，,前,6,种为大量元素，后,7,种属微量元素。,I,虽不是植物生长所必需的，但几乎所有组织培养基中都有，有些培养基还加入,Co,、,Ni,、,Ti,、,Be,，、,Al,等元素。 。,（1）无机营养物：,,

34、,,,一类是有机营养物质，为植物细胞提供,C,、,H,、,O,、,N,等必须元素，如糖类，,AA,等；,,,另一类是一些生理活性物质，在植物代谢中起一定作用。如：维生素及单核苷酸等。,,,（2）有机物质：,,主要加入植物天然的,5,类激素物质及其人工合成的类似生长激素物质。,,,（3）植物生长刺激物质：,植物天然的5类激素物质有：,生长素类、细胞分裂素类、赤霉素类、脱落素类和乙烯类。,,,这些物质不是植物细胞生长所必需的，但对细胞生长有益。如活性炭可以降低组织培养物的有害代谢物浓度，对细胞生长有利。液体培养基中加入琼脂糖，可改善培养细胞的供氧状况。,,,,（4）其他附加物：,,,植物天然汁液如

35、西瓜汁、生梨汁等，它们的作用是供给一些必需的微量营养成分、生理活性物质和生长激素物质等。,,（5）其他对生长有益的未知复合成分,,2、光,,,植物细胞代谢产物的合成受光质和光量的调节。,,,,对于黄酮、黄酮醇、花色素苷、萘醌、多酚、挥发油、萜烯和其他次级代谢的合成和积累来讲，光质和光量具有重要的影响。,,,,,,,最适生长温度25～30℃，此外，温度对培养基成分的利用速度也有一定的影响。,,3、温度,,4、,pH,值,通过细胞膜进行的,H,+,离子传递对细胞的生育环境、生理活性来说无疑是重要的。在培养过程中，通常,pH,作为一个重要参数被控制在一定范围内。植物,细胞培养,的适宜,pH,值一般为

36、,5,～,6,。,,5、通气,通气是细胞液体深层培养重要的物理化学因子。好气培养系统的通气与混合及搅拌是相互关联的。对摇瓶试验，通常,500mL,的三角瓶内装,80,—,200mL,的植物,细胞培养,液较适宜。当然，气液传质还与瓶塞的材料有关。试验表明，从溶氧速率考虑，以棉花塞最好，微孔硅橡胶塞次之，铝箔塞最差。,,,,Kessell,和,Carr,在验证溶解氧对搅动通气培养的胡萝卜细胞生长和分化的影响时，发现有一个临界氧水平。在临界水平之上，生长不受溶解氧的影响，根据干重或细胞数目计算的生长呈指数增加。而低于这个临界值时，干重增加呈线性，而细胞数目仍以指数形式增加。,,,,,五、植物细胞培养

37、技术：,组织培养指以分离出的植物各部位的组织或诱导的愈伤组织为外植体的离体无菌培养。用于研究植物的生长发育、分化和遗传变异；进行无性繁殖；制取代谢产物。,1,．,,组织培养：,人参愈伤组织,,,细胞培养指以单个的游离细胞,(,如用果酸酶从组织中分离的体细胞，或花粉细胞、卵细胞,),为接种体的离体无菌培养。,2,．,,细胞培养,常用的植物细胞培养有花粉培养和原生质体培养两大类。,,（,1,）花粉培养,在无菌条件下取出花药或从花药中取出花粉粒（小孢子），置于人工培养基上进行培养，形成花粉胚或花粉愈伤组织，最后长成花粉植株。,,首先用纤维素酶或果胶酶除去植物体细胞的细胞壁得原生质体。原生质体在良好的

38、培养基上可以生长与分裂，并通过愈伤组织诱导分化长出茎、叶，再长出根而形成植株。,（,2,）原生质体培养,,3,．,,悬浮细胞培养：,将植物细胞或较小的细胞团悬浮在液体培养基中进行培养，在培养过程中能够保持良好的分散状态。这些小的细胞聚合体通常来自植物的愈伤组织。,,六、植物细胞培养方法,植物细胞培养有悬浮培养和固定化细胞培养两种。,,1,、悬浮培养,①,.,半连续培养法：每隔一定时间（如,1,～,2,天）收获部分培养物，再加入等量培养基的方法。,,②,.,连续培养法：即培养若干天后连续收获细胞的同时不断补充培养液的方法。,,2,、固定化细胞培养,细胞固定化是将细胞包埋在惰性支持物的内部或贴附在

39、它的表面。,,（,1,） 平床培养系统,,（,2,）立柱培养系统,,七、植物细胞培养的产物,类型,植物细胞大规模培养的产物有种苗、细胞、初级代谢物、次级代谢物和生物大分子等。,,,,植物细胞工业规模的培养首先是细胞生物量的增长，细胞即为重要的产品之一。如人参细胞制成人参细胞粉，既是保健食品原料，也可作为药材，其中除含人参皂苷（人参皂苷含量,7%,，超过了原植物,）外，还,含有天然人参所不具有的酶类及其活性成分，其保健作用优于天然人参。,,日本曾用烟草细胞培养收集烟草细胞作为烟草原料。,,1、植物细胞：,,,目前来自植物细胞培养的有用物质有400种左右，包括色素、固醇、生物碱、维生素、激素、多糖

40、、植物杀虫剂及生长激素等数十个类别。,,2、初级及次级代谢物的生产,,化合物,,细胞来源,,作用,,紫草素,,紫草细胞,,抗炎剂，食用色素,,辣椒素,,朝天椒细胞,,食品，化妆品色素,,甘草精,,甘草细胞,,甜味剂,,香豆素,,薰衣草细胞,,香料,,薄荷醇,,薄荷细胞,,香料,,黄连素,,黄连细胞,,止泻药,,类胰岛素,,苦瓜细胞,,治疗糖尿病,,毛地黄毒素,,毛地黄细胞,,强心药,,利血平,,罗夫杉细胞,,降血压药,,奎宁碱,,金鸡纳树,,抗疟疾,,长春花碱,,长春花,,治疗白血病,,可卡因,,古柯植物,,抗阿米巴病,,尼古丁,,烟草,,杀虫药,,吗啡,,罂粟,,止痛药,,,利用植物培养细胞

41、为酶源，使某种前体化合物生成相应产物的技术称为,生物转化,，也叫植物细胞转化。,,,3、生物转化,,植物细胞内含有催化酯化、氧化、还原、皂化、羧基化、异构化、甲基化、羟基化、环氧化、去甲基化等反应的酶类，可使相应的原料生成有用化合物。,,,,植物细胞转化作用是个普遍存在的现象，如在三角叶薯芋细胞培养物中添加胆固醇，则薯芋皂苷元产率增加1倍，在雷公藤细胞培养物中添加法尼醇（100,μg,/ml），,使雷公藤羟内酯产量增加3倍以上，在紫草细胞培养物中添加,L‑,phe,，,使紫草素产量增加3倍。,,,,1,、可以不受环境因素，能在任何地方与任何时候进行生产，培养物能达到在田中生产的材料中从未见到的

42、那种整齐一致的程度；,,,,八、植物细胞培养的优越性,,,2,、任何新发现的植物种类都能立即着手培养，并能缩短繁殖和引种栽培的时间；,植物细胞培养的优越性：,,3,、人工控制有毒药物的扩散和滥用；,,植物细胞培养的优越性：,,4,、植物组织培养实现工业化生产无需占用耕地，培养物生长迅速，周期短，能够在人工控制的条件下，采用科学方法提高产量和质量。,,,九、植物细胞培养的几个技术难题,,,植物细胞生产周期一般为25,～35,d,，,,由于生产效率低，设备周转慢，能源、劳力,,消耗多，因而成本高。,,,,,1、缩短生产周期、降低生产成本,,,筛选有效成分高的细胞株进行培养。,,2、提高培养细胞中的

43、有效成分含量,,3、防止细胞集聚成块,,成块后使细胞生长速度变慢，细胞的性质有差异，有效成分的含量不一样，影响产品的质量的产量，另外造成管路堵塞等麻烦。,,选用松散易分散的起始材料，培养过程中随时除去细胞团块，提高生长素的浓度向培养基中加入,EDTA-Na,螯合剂和果胶酶等。,,,4、防止细胞株的种性退化和变异,作为原种的植物细胞株的保存，是依靠定期继代培养的方法实现的，这不仅操作麻烦，且易产生突变，引起种性退化。,,十、药用植物细胞培养的研究,1.,药用植物次生代谢产物,药用植物次生代谢产物是指药用植物体内的一大类化合物，它们是细胞生命活动或植物生长发育正常运行的非必需的小分子化合物，其产生

44、和分布通常有种属、器官、组织以及生长发育时期的特异性。,,不同药用植物的次生代谢产物的合成和积累经常在不同的部位，且药用植物次生代谢物种类繁多，结构迥异。,,2.,药用植物细胞培养技术,在次生代谢产物的生产中，药用植物细胞培养技术是通过给予体外生长的植物细胞一定的营养条件，使其生长，并根据植物或植物不同组织的细胞调节生长条件来获取所需的次生代谢产物的生物技术。,,由于植物体内的任何一个细胞都包含有整体植物全部的遗传信息，在一定条件下具有发育成一个完整植株的能力，所以通过细胞培养技术可得到药用植物的次生代谢产物。,,3.,药用植物细胞培养的研究进展,从,1939,年,P.R.White,和,R.

45、J.Gautheret,建立了植物细胞和器官培养技术以来，经科学家们半个世纪的努力，目前药用植物细胞培养技术在选材消毒、接种培养、诱导筛选、继代保存、成分分离鉴定和工业化生产方面已发展成一门精细的实验科学，并已建立了一套操作程序。,,20,世纪,60,年代愈伤组织、细胞悬浮和细胞发酵培养,20,世纪,70,年代植物细胞培养技术的规模已达到了中试水平,20,世纪,80,年代是药用植物细胞工程研究获得重大突破的黄金时代,到了,90,年代，国内的药用植物细胞培养技术取得了很大的进展,,第四节 杂交瘤技术与单克隆抗体,,,包括特异性免疫(,Specific immunity),和非特异性免疫。,,,

46、,,,一、免疫系统,,个体对抗原性异物的抵抗力，有些是天生的，即在发育进化过程中形成的，经遗传获得的，称为先天性免疫。因其并非针对某一特定的病原微生物，故又称为非特异性免疫。,非特异性免疫,,,个体在生活过程中，因受到某些病原微生物感染或接种疫苗而获得的免疫称为获得性免疫。因这种免疫一般针对所感染的病原微生物或疫苗所能预防的疾病，故又称为特异性免疫。,特异性免疫：,,当机体受到抗原刺激后，一类小淋巴细胞,-,依赖胸腺的,T,细胞发生增生、分化，直接攻击靶细胞或间接地释放一些淋巴因子，从而使机体达到免疫的过程。,,,细胞免疫：,,当机体受到抗原刺激后，来源于骨髓的小淋巴细胞,-B,细胞进行增生和

47、分化为浆细胞，浆细胞产生抗体，抗体进入体液而形成的特异性免疫。,,体液免疫：,体液免疫的发生分为：,,感应、反应和效应三个阶段。,,,,单克隆抗体：单一的特异性抗体即为单一,B,细胞克隆抗体，,B,型淋巴细胞的增生过程是一个无性繁殖过程，即由一个,B,细胞分裂而形成的细胞群，称为一个克隆。单克隆抗体,(,Monoclonal,antibody,McAb,),也称为单抗。,,,多克隆抗体,(,Polyclonal antibody),：,多种,B,型淋巴细胞产生的多种抗体的混合物。,,,,,（一）、单克隆抗体,二、杂交瘤技术与单克隆抗体,,,单克隆抗体特点,1,、高度特异性,5,、过于单一性,2

48、,、高度稳定性,3,、高抗体活性,4,、不可知性,,（二）杂交瘤技术,,,通过杂交瘤技术获得的杂交瘤细胞具备两种亲本细胞的特性。,,,,杂交瘤技术包括免疫动物、细胞融合、筛选杂交瘤细胞、克隆化培养、单克隆抗体的制备与鉴定等步骤，其关键技术是细胞融合技术。,,利用杂交瘤技术生产单克隆抗体经历了一个漫长的发展阶段。,,1975年，英国,Milstein,和,Kohlor,将经绵羊细胞免疫的小鼠脾,B,淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞在仙台病毒的诱导下进行融合，利用,HAT,选择性培养基筛选出融合后形成的杂交细胞，这种细胞既有小鼠骨髓瘤细胞在体外培养条件下大量繁殖的本领，又有,B,淋巴细胞分泌特异性抗体的能

49、力，使得单克隆抗体在体外生产成为可能。,,,利用杂交瘤技术,,生产单克隆抗体的必备条件：,1,、一个亲本是能产生抗体的细胞,2,、另一亲本是能够无限生长繁殖,,的细胞。,,杂交瘤技术,免疫动物,细胞融合,筛选杂交瘤细胞,克隆化培养,单克隆抗体的制备与鉴定,单克隆抗体的纯化,,（三）单克隆抗体的应用：,1 、新型诊断试剂：,,,,,在医学临床诊断方面，用于体外测定病人的血、尿或分泌物中各种特殊的蛋白质的含量，如寄生虫、细菌、病毒、癌细胞分泌的蛋白质以及由于代谢病或遗传病造成的特殊蛋白质等，进而判断身体是否有病，也可用来检测治疗过程中病变的情况。,,,,,,,,,红细胞表面的糖蛋白：,A,、,B,

50、型,,AB,型：两种都带,,O,型：两种血型物质都不带,,法国输血中心还研制出了可分辩,A,型、,,B,型、,AB,型血型的单克隆抗体诊断盒。,,,单克隆抗体可用在体内定位诊断上，不同的癌症或肿瘤在体内所表现出的癌抗原或瘤抗原不同，可以获得各种特异的单克隆抗体，再采用合适的同位素标记表使特异的单克隆抗体上带有放射性标记。,,,,,,单克隆抗体在肿瘤治疗方面目前正显示着巨大的优势，其中治疗效果较好的有白血病、淋巴瘤、肾癌、肉瘤、黑色素瘤、肝癌以及胃肠道肿瘤等。,,,,2、临床治疗：,,利用抗体和抗原高度亲和的特点，单克隆抗体可以广泛应用于亲和层析，分离纯化蛋白质物质。,,3、蛋白质提纯：,,,以

51、抗体为载体的导向治疗药物的研究已有近,20,年的历史，已制备出百余种单克隆抗体，鉴定出数十种与肿瘤相关的抗原，但治疗试剂还没有达到商品化。,,（四）抗体治疗药物,,1,、放射性核素标记的抗体治疗药物,,抗体作为放射性核素的导向载体，操作简单、用量小，且能观察到药物在体内的分布和药物动力学，放射性标记的抗体有较大的杀伤范围，有利于克服肿瘤表面抗原的异质性，对肿瘤细胞的杀伤也不依赖抗原抗体结合后的吸收作用，由于分子量小，容易穿透到达肿瘤部位。,,,,2,、抗癌药物偶联的抗体药物,,（,1,）,、常用抗癌药,,氨甲喋呤、阿霉素、丝裂霉素、环磷酰胺等，以人血清白蛋白为中间载体，可明显提高每分子抗体所携

52、带的氨甲喋呤量，使体外细胞毒性提高倍。,,（,2,）,、抗体类药物的逆转耐药性,,肿瘤细胞对抗原药物可产生多药耐药性。,,,毒素偶联的抗体药物,,1,、免疫毒素及其换代制品,,,,毒素和抗体的交联物称为,免疫毒素,。,,第一代免疫毒素是包含有,A,、,B,链的完整的毒素和抗体的交联物，应用有限，,,第二代免疫毒素利用抗体或抗体片段与毒素作用，在体内有一定的抗肿瘤作用；,,第三代免疫毒素,—,重组免疫毒素，特异性好，稳定性强，渗透性好，免疫原性低，可大量制备。,,,2,、免疫毒素的制备,,来源,:,主要是细菌毒素和植物毒素。,,载体种类：小分子抗体,FV,和,SCFV,；,细胞生长因子可与细胞膜

53、上的受体结合；激素，可识别细胞表面的受体；,CD4,可识别,HIV,表达的糖蛋白。,,先克隆出细胞基因，再利用基因重组技术去除毒素中非特异性结合部位基因，经过改造的毒素基因再与载体基因的互补,DNA,重组，转入受体菌中表达，形成融合蛋白，再经纯化可得到重组的免疫毒素。,,,3,、免疫毒素的临床应用,,可用于治疗肿瘤、自身免疫病、并能克服组织移植排斥反应，可单独给药也可包裹在脂质体及其他微粒中给药，在胞浆物质代谢中发挥作用，相对分子量小，渗透力强、效果好。,,,,抗,HBsAg,的单克隆抗体生产工艺,,,,抗乙型肝炎表面抗原,(,HBsAg,),单克隆抗体是专一性识别,HBsAg,的单一抗体，能

54、与,HBsAg,产生免疫反应。,,临床上用于检测乙型肝炎病毒的感染并用于生产预防乙肝的免疫制剂，目前生产抗,HBsAg,的单克隆抗体技术有基因工程与细胞工程。,（五）单克隆抗体生产工艺实例,,免疫大鼠脾淋巴细胞与大鼠骨髓瘤的,IR983F,细胞融合技术制造抗,HBsAg,单克隆抗体的工艺。,,,(1),工艺流程,大鼠骨髓瘤细胞,+,免疫大鼠脾淋巴细胞,,融合混合物,,杂种细胞混合物,,杂交瘤克隆系,,细胞种质,,培养液,,粗制,McAb,,,层析液,,浓缩液,McAb,精品,,,(2),工艺过程,,,,①培养基：,,大鼠骨髓瘤,IR983 F,细胞系的培养基为,改良的,,(DMEM),培养基。

55、,,使,Eagle,培养基中,15,种氨基酸浓度增加,1,倍，,,,8,种维生素浓度增加,3,倍而成，用于细胞培养，提高了细胞生长效果。,,其中尚需,10%,灭活小牛血清，,1%,非必需氨基酸，,0.1,mol,／,L,丙酮酸钠，,1%,谷氨酰胺及,50,mg,／,mI,庆大霉素；杂交瘤细胞筛选系统用含,HAT,的,DMEM,培养基。,,,②饲养细胞制备：,,在细胞融合前,2,～,3,天，取健康大鼠处死，向腹腔内注入,10,mlDMEM,培养液．,,轻压腹腔使细胞悬浮，打开腹壁皮肤，暴露腹膜，提起腹膜中心，插入注射针头，吸出全部细胞悬液；,,,500,g,离心,5,min,，用,pH7.4,，

56、,0.1mol,／,L,磷酸缓冲液洗涤,2-3,次；,,收集细胞，用含,10,％小牛血清、,100,U,／,ml,青霉素和链霉素及,HAT,的,DMEM,培养液制成,106,细胞／,ml,悬浮液；,,使用,24,孔板时，每孔加,0.1,ml,，,当使用,96,孔板时，则制成,2,x105,细胞／,ml,的悬浮液，每孔加,0.1,ml,，,,然后置,37℃,的,CO2,培养箱中温育，备用。,,,,③亲本细胞准备：,,,取对,8—,氮鸟嘌呤抗性的,Lou,／,c,大鼠,非分泌型浆细胞瘤,IR983F,细胞,，用常规方法制成细胞悬浮液，按,1.5,x105,细胞／,ml,接种量,接种,于,DMEM,

57、培养液中，于,37℃,CO2,培养箱中培养至对数生长期，经常规消化分散法用,DMEM,培养液制成细胞悬浮液，即为待融合用,骨髓瘤细胞,亲本，备用。,,另取,HBsAg,用,pH7.4,，,0.1mol,／,L,磷酸缓冲液溶解并稀释成,20,μg,／,ml,的溶液，加等体积福氏完全佐剂充分乳化后，取,2ml,注入,Lou,／,c,大鼠腹腔，,2,周后进行第,2,次,免疫,，,3,个月后于融合前,3—4,天进行,加强免疫,，,3,次免疫的剂量和注射途径均相同，唯第,3,次免疫时不加福氏佐剂，,,,,于细胞融合前处死大鼠，用碘酒棉球及酒精棉球先后对右上腹部消毒，剖开腹部，用无菌剪刀与镊子取出,脾脏,

58、，用,pH7.4,，,0.1mol,／,L,磷酸缓冲液洗去血液，在无菌烧杯或培养皿中切成,1,mm3,小块，再用磷酸缓冲液洗涤,3,～,4,次，直至澄清，倾去洗涤液，,,加入组织块,5,～,6,倍体积,(,质量／体积,),的,0.25%,胰蛋白酶溶液,(,pH7.6—7.8),于,37,度,保温，消化,20,一,40,min,，,每,10,min,轻摇消化瓶,1,次，直至组织块松软为止，倾去胰蛋白酶溶液，再用上述磷酸缓冲液洗涤,3,～,5,次，然后加入少量磷酸缓冲液用,10,ml,吸管吹打分散，至大部分组织块分散为细胞，,,用两层无菌,纱布过滤,，未分散的组织块再加少量磷酸缓冲液吹打和分散，合

59、并细胞滤液，离心收集细胞并用磷酸缓冲液洗涤,2—3,次，然后用无血清的,DMEM,培养液稀释制成细胞悬浮液，即为免疫大鼠脾淋巴细胞亲本，备用。,,④固定化抗大鼠,K,轻链单抗的制备：,,本法所用载体也为,Sepharose,4B,，,其活化方法与制备固定化,t-PA,相同．,,取,30,g,活化的,Sepharose,4B,悬浮于,100,ml,，,pH10.2,，,0.025mol/L,硼酸缓冲液中，另取,1,g,抗大鼠,K,轻链的,McAb,(MARK-1),溶于,25,ml,硼酸缓冲液，,,然后加至上述已活化的,Sepharose,4B,悬浮物中，于,10,度搅拌反应,16,～,20,h

60、,，,将其装柱,(,直径,2,cm*50cm),并用,10,倍柱床体积,(,体积／体积,),的上述硼酸缓冲液以,5—6,ml,／,min,流速洗涤柱床，收集流出液，,,测,A280,并根据流出液计算偶联效率．然后依次用,5,倍柱床体积,(,体积／体积,),的,pH10,，,0.1mol/L,乙醇胺溶液及,pH8.0,，,0.1mol,／,L,硼酸缓冲液充分洗涤．,,最后用,pH7.4,，,0.1mo/L,磷酸缓冲液洗至流出液,A280,小于,0.01,，即得抗,HBsAg McAb,的亲和吸附剂，将其转移至含,0.01,NNaN3,的,pH7.4,，,0.1mol,磷酸缓冲液中，于,4℃,贮存

61、，备用。,,,,⑤细胞融合：,,取,107,个,IR983 F,细胞与,108,个免疫大鼠脾淋巴细胞于,50,mi,离心管中，混匀，在,4,度下，,1500,r,／,min,离心,8—10,min,，,用巴斯德吸管小心吸去上清液，轻弹管底，使沉淀的细胞松动，,,于,37,度水浴中保温，并于,lmin,内轻轻滴加,0.8,ml 50%PEG4000,，,同时用吸管尖轻轻搅动,60,～,90,s,，,然后于,2,min,内缓慢滴加,20,mlDMEM,培养液，,1500,r,／,min,离心,8,～,10,min,，,吸去上清液，然后再用含,20%,小牛血清的,DMEM,培养液稀释至,50,ml,

62、，,制成细胞悬浮液，,,得细胞融合混合物,.,取,25,ml,融合混合物加至两块含饲养细胞的,24,孔微量培养板中，每孔加,0.5,ml,；,,,,余下,25,ml,细胞融合混合物再用含,20%,小牛血清的,DMEM,培养液稀释至,50,m1,，,依上法再接种两块,24,孔培养板．,,依此类推，每次融合混合物可按种,8—10,块,24,孔培养板，按,IR983 F,计，每孔接种细胞数约为,105,个，剩余融合物弃去．,,若用,96,孔板，则每孔接种细胞数约为,104,个．然后于,37,度，,C02,培养箱中培养至,2,～,4,天，每天从各孔中吸去,lml,原培养液，替换含,20%,小牛血清及,

63、HAT,的,DMEM,培养液，继续培养至第,5—6,天可见小克隆，至,9,～,10,天可见大克隆，中途不换,HT,培养液。,,若培养液出现淡黄色，可取出一部分培养液进行抗体检测。培养,10,天后改换含,HT,的培养液，继续培养两周后改用常规,DMEM,培养液培养。,,⑥杂交瘤细胞筛选：,,筛选产生抗,HBsAg,单抗的杂交瘤细胞的方法是用,AUSAB,酶免疫试剂盒,测定表达抗体的细胞，,,即将包被了人,HBsAg,的聚苯乙烯珠与待测杂交瘤培养上清培育，然后用磷酸缓冲液洗涤,3—4,次，加入用生物素偶联的,HBsAg,培育后洗涤，再加过氧化物酶标记的亲和素培育，最后用邻苯二胺,(,OPD),显色

64、，经酶标仪定量测定，以确定产生抗,HBsAg,单抗的阳性孔。,,,经检测确定为产生抗,HBsAg,单抗的阳性孔细胞需进行克隆和再克隆，井经全面鉴定与分析，最后才能获得产生抗,HBsAg,单抗的杂交瘤克隆系。,其过程如下：,,,将阳性孔中的培养细胞经常规消化分散法制成细胞悬浮液，计数，用含,20%,小牛血清的,DMEM,培养液依次稀释成,5,X104,细胞／,ml,，,5X103,细胞／,ml,、,5X102,细胞／,m1,及,5,X10,细胞／,ml,细胞悬液，,,然后在已有饲养细胞的,96,孔培养板的第,1,一,3,行中，每孔接种,5,x10,细胞／,ml,细胞悬液,0.1,ml,，,每孔细

65、胞数平均为,5,个；,,余下细胞悬液再稀释成,10,细胞／,ml,，,在第,4—6,行孔中每孔接种,0.1,ml,，,平均每孔细胞数为,1,个；,,余下细胞悬液再稀释成,2,细胞／,ml,，,在,7,～,8,行孔中每孔接种,0.1,ml,，,平均每孔,0.2,个细胞,.,,,,然后于,37,度，,CO2,培养箱中通入含,5,％,CO2,的无茵空气培养至第,5,一,6,天，镜检，记下单克隆孔，补加,0.1,ml,培养液。,,在生长良好的情况下，第,1,～,3,行难有单克隆，第,4—6,行偶有单克隆，第,7—8,行多为单克隆．,,培养至,9,～,10,天后有部分孔中培养液上清液变,淡黄色,，可能已

66、有抗体产生。然后将阳性孔内细胞分散接种至另外的,24,孔板中培养，并在原版的各孔中替换另,—,批培养液，以防污染及细胞死亡。,,当新的,24,孔板中细胞生长良好时，即进行消化分散转移至小方瓶中扩大培养，同时将种质进行保存。所获的阳性培养物需按上述方法反复再克隆和全面鉴定，直至确证为阳性单克隆为止。,,⑦抗,HBsAg,单克隆抗体的生产：,,抗,HBsAg,的单克隆抗体可采用人工生物反应器培养杂交瘤细胞进行生产，也可采用动物体作为生物反应器进行生产，后者又可通过诱发实体瘤及腹水瘤进行生产，本文叙述腹水瘤生产技术，其过程如下：,,向健康的,Lou,／,c,大鼠腹腔注射,1,ml,降植烷,(,Pristane,),，,饲养,1—9,周后，向大鼠腹腔接种,5,x106,个杂交瘤细胞，,,饲养,9,～,11,天后即可明显产生腹水，待腹水量达到最大限度而大鼠又濒于死亡之前时，处死动物，用毛细管抽取腹水，一般可得,50,ml,左右。,,同时也可取其血清分离抗体，此外也可不处死动物，而是每,1,～,3,天抽取,1,次腹水，通常每一动物可抽取,10,次以上，从而获得更多单克隆抗体。,,,⑧抗,HBsAg