第四章-病毒的遗传变异-病毒学课件

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4、ifth level,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,第四章,病毒的遗传变异,2,病毒的遗传能保持物种的相对稳定，维系生物界的平衡；而病毒的变异可导致新品种出现，孕育生物界的进化。病毒是一类极为简单的分子生物，,核酸是遗传的物质基础，核酸复制的忠实性使病毒具有稳定的遗传表现。但由于病毒没有细胞结构，其遗传物质极易受外界环境及细胞内分子环境的影响而发生改变

5、，,病毒与其它生物相比，其遗传具有更大的变异性。,3,第一节 病毒的突变,第二节 病毒基因重组,第三节 病毒基因组研究,4,第一节 病毒的突变,病毒的突变发生在其基因组的碱基序列改变，可以是单一的核苷酸改变，也可以数个核苷酸增加或减少的改变。所有的病毒都能够产生突变。突变的产物称为突变体,(mutant),或称为变异体,(variant),。突变是可以遗传的。,6,1.,变量试验,（,fluctuation test）,又称,波动试验,或,彷徨试验,。1943年，,S.E.Luria,和,M.Delbrck,根据统计学的原理，设计实验。,Salvador Luria,Max Delbruck,

6、The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1969,7,8,2.,平板影印培养试验,（,replica plating）,1952年，,J.Lederberg,夫妇发表了一篇著名的平板影印培养法和细菌突变株的间接选择论文，它更好地证明了微生物的抗药性是在未接触药物前自发地产生的，这一突变与相应的药物环境毫不相干,。,10,（,2,）,稀有性和随机性,自发突变虽可随时发生，但其突变率却是极低的，,DNA,病毒自发突变率仅,10,8,10,11,。,RNA,病毒的自然突变率高，每个掺入核苷酸的自发突变率高达,10,3,10,6,。主要原因是,RNA,聚合酶

7、缺少校正阅读活性，从而使,RNA,病毒基因组复制忠实度低。,突变率,每一细胞在每一世代中发生某一性状突变的几率。,突变率是病毒核酸复制一次每个基因的自然突变的几率。,11,基因突变是随机的、独立的，,某基因的突变率不受其它基因突变率的影响；,两个不同突变同时发生的几率是两者各自发生几率的乘积。,（,3,）,独立性,野生型菌株某一性状可发生正向突变（,forward mutation），,也可发生相反的回复突变（,reverse mutation）。,（,4,）,可逆性,13,碱基类似物,2-,氨基嘌呤和,5-,溴嘧啶,嵌入诱变 吖啶类染料,改变,DNA,结构的诱变 羟胺、亚硝酸、各种烷化剂,(

8、,亚硝基胍、氮芥,),等。,1.,化学诱变,为了获得诱发突变，可将病毒悬液,(,或它们的感染性核酸,),置于适当的化学诱变剂中，或将药物添加于支持病毒复制的培养细胞中。处理的结果使病毒感染性下降或产量减少的突变型。,15,2.,物理诱变,紫外线 紫外线是非电离辐射，尤其是中波紫外线,(290320nm),能使核酸上的胸腺嘧啶形成二聚体，引起病毒变异或死亡。,电离辐射 电离辐射包括,X,射线、,射线、,射线、,射线等。其共同特点是波长短、能量大，可打断大分子的共价键，或使被照射的物质分子发生电离作用，形成游离基，游离基与大分子结合可使之变性失活。,16,二、病毒突变体的种类,(,一,),条件致死

9、突变体,只能在特定的宿主内增殖，不能在非特定的宿主内增殖，而它的亲代则在特定的或非特定的两种宿主内都能增殖的病毒突变体，称为条件致死突变体，又称为宿主限制突变体。,突变株与原先的野生型病毒特性不同，主要表现为无效突变体、病毒毒力突变体、温度敏感突变体、蚀斑突变体、宿主范围突变体、抗药性突变体、抗原突变体、回复突变体等。,18,产生,Ts,突变的原因,基因组核酸序列中的核苷酸发生突变改变了病毒蛋白质的一级结构，减弱了,蛋白质内部的结合力以及蛋白质的结构及有效作用,，只要遇到温度稍许升高就会发生根本性的改变。因此这种突变体所编码的多肽链只能在低温时才能呈现有功能的高级结构；而在高温时，呈现出无功能

10、的变性结构。,大多数,ts,株同时又是减毒株。从许多动物病毒中分离出,ts,株，选择遗传稳定性良好的品系用于制备减毒活疫苗，如流感病毒及脊髓灰质炎病毒疫苗、麻疹病毒疫苗、风疹病毒疫苗,ts,株疫苗。,19,有的在高温条件下不能开始噬菌体,DNA,的复制,由于,参与噬菌体,DNA,复制的早期蛋白,在,42C,失去功能活性。,有的虽然能开始,DNA,复制，但可能由于,晚期蛋白,在高温时失去活性而复制受阻。,有的突变可能发生在,噬菌体壳体蛋白,基因，所以不能组装成完整的噬菌体子代。,有的突变可能 发生在,编码溶菌酶,的基因,在细胞内有完整的子代噬菌体产生，但在,42C,不能裂解宿主，子代噬菌体不能释

11、放出来,在25下可感染其,E.coli,宿主,在37,-42,却不能感染,某些,T4,噬菌体突变株,20,蚀斑的大小,-,决定于病毒的弥散和吸附率以及病毒复制、成熟、释放的速度和在细胞内外的死亡率。,蚀斑的色泽,-,蚀斑是透明的还是混浊的，是有色的，还是无色的。,蚀斑的形状,-,蚀斑是圆的还是不规则的？蚀斑边缘是清晰，还是弥撒。,(,二,),蚀斑突变体,病毒在侵染敏感细胞死亡时产生的大小或外形不同于野生型蚀斑的突变体，叫做,蚀斑突变体,病毒,“,培养性状,”,突变，主要是指其在培养细胞上形成蚀斑的形态和性质，实际上是病毒所引起的细胞病变的特征。,21,(,三,),抗原突变体,病毒的抗原性由病毒

12、表面蛋白质的抗原决定簇所决定。,如流感病毒的变异，具体表现为表面抗原,(,血凝素和神经氨酸酶,),的变异，它存在两种变化形式：抗原漂移和抗原转移。,抗原漂移,-,是指病毒在自然宿主内频繁传代后，所出现的抗原性微小变化。一般认为这是在免疫反应的压力下，突变体选择的结果。,抗原转移,-,是指病毒抗原性突发的巨大变化。一般推测这是基因重组的结果；也有认为这是由于量变的积累而导致质变的发生。,22,病毒由于突变而,表现出的多方面特性同时变化,的突变体，叫做共变体。这种变化反映了病毒的一种蛋白质与病毒的几种性质有联系，如脊髓灰质炎病毒的,胱氨酸依赖突变体,和结构蛋白突变体是共变体，又如流感病毒衣壳中一种

13、蛋白发生了变化，就对糖蛋白抑制物的作用、抗原性以及在某些宿主内生长的能力发生影响。,(,四,),共变体,24,三、病毒突变的分子机制,（,1,）点突变：在单一核酸的碱基中发生了改变,。,25,（,2,）缺失突变：在核苷酸中有一段序列被丢失。,（,3,）插入突变：在病毒基因组中插入一段核苷酸序列。,（,4,）回复突变：突变的核苷酸有可能发生突变逆转，重新具有与起始毒株相同的表型。,26,第二节 病毒基因重组,两种不同的病毒或同一种病毒的两个不同的毒株同时感染同一细胞时，在核酸复制过程中，病毒之间交换核酸片段，从而可发生基因重组。结果产生不同于亲代的可遗传的子代，称为基因重组（,Genetic r

14、ecombination,）。,28,（,2,）重配：在两株基因组分节段的,RNA,病毒同时感染同一细胞时，二者基因组发生互换，产生稳定或不稳定的重配毒株。,呼肠孤病毒：,10,12,节段,沙粒病毒、双,RNA,病毒：,2,节段,布尼病毒：,3,节段,正粘病毒：,6,8,节段。,29,（,3,）复活,交叉复活,(Cross reactivation),：,有传染性的病毒与灭活的相关病毒或该病毒的,DNA,片段共同培养，产生具有灭活病毒特性的重组子代病毒。,例如将能在鸡胚中生长良好的甲型流感病毒（,A0,或,A1,亚型）疫苗株经紫外线灭活后，再加亚洲甲型（,A2,亚型）活流感病毒一同培养，产生出

15、具有前者特点的,A2,亚型流感病毒，可供制作疫苗,多重复活（,Multiplicity reactivation,）：例如用紫外线,灭活的两株同种病毒，若一同培养后，常可使灭活的病毒复活，产生出感染性病毒体,。这是因为两种病毒核酸上受损害的基因部位不同，由于重组合相互弥补而得到复活。因此现今不用紫外线灭活病毒制造疫苗，以防病毒复活的危险。,31,一、病毒基因图构建方法,(,一,),物理作图,DNA,病毒在提取病毒核酸以后，可以利用两种以上的限制性核酸内切酶分别及共同消化病毒核酸，获得不同的,DNA,片断，凝胶电泳分离计算出片断大小，并拼接出病毒基因组限制位点位置的物理图谱。,RNA,病毒，采用

16、逆转录后的,cDNA,作相应的限制酶图谱，即物理图谱。,32,(,二,),核酸序列分析,利用分子生物学技术，对已测序的的病毒的基因组序列，利用生物软件如,DNASIS,、,GCK,、,Bioedit,等可以对序列进行分析，获得以下信息：,由,DNA,序列可预测病毒的开放阅读框,(ORF),，预测病毒可能编码的蛋白质；,当预测的蛋白质序列与已知功能的蛋白质序列相似时，可以预测病毒蛋白质的功能；,据,DNA,序列可以确定作为基因表达信号的短序列元件。,33,二、病毒功能基因研究法,(,一,),寻找,DNA,序列中的基因,获得,DNA,序列后，无论是单克隆片段还是整个染色体，都可以用许多方法来确定其中的基因，包括用人工或计算机进行序列筛查以寻找基因的特殊序列特征，以及对,DNA,序列进行实验分析。,34,寻找基因组中的基因,通过序列筛查,(BLAST),定位基因、预测基因的功能,通过研究,DNA,片段转录的,RNA,分子来定位基因,Northern,杂交可以检测某一片段是否含有表达序列,cDNA,测序有助于对,DNA,片段进行基因作图,准确定位转录物末端的方法,5 RACE,，,3RACE,