第二章荧光磷光分析课件

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1、单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,,,*,Modern Instrument Analytical Method,《仪器分析》课程,武汉工业学院分析测试中心,仪器分析,,第二章,Chapter 2,分子荧光:,Fluorescence,分子磷光:,Phosphorescence,分子发光-----荧光、磷光,,,《仪器分析》课程武汉工业学院分析测试中心第二章Chapter,1,§2.1 分子发光的基本原理,第一次记录荧光现象的是16世纪西班牙的内科医生和植物学家N.Monardes，1575年他提到在含有一种称为“Lignum Nephriticum”的木头切片的水溶

2、液中，呈现了极为可爱的天蓝色。,直到1852年，Stokes在考察奎宁和叶绿素的荧光时，用分光光度计观察到其荧光的波长比入射光的波长稍微长些，才判断这种现象是这些物质在吸收光能后重新发射不同波长的光，而不是由光的漫射作用所引起的，从而导入了荧光是光发射的概念，他还由发荧光的矿石“萤石”推演而提出“荧光”这一术语。,1867年，Goppelsroder进行了历史上首次的荧光分析工作，应用铝—桑色素配合物的荧光进行铝的测定。,19世纪以前，荧光的观察是靠肉眼进行的，直到1928年，才由Jette和West提出了第一台荧光计。,,,§2.1 分子发光的基本原理第一次记录荧光现象的是16世纪西,2,荧

3、光是如何产生的？,,,激发态,光辐射,基态分子,荧光,磷光,非辐射,跃迁,,,荧光是如何产生的？激发态光辐射基态分子荧光非辐射,3,一. 分子荧光与磷光的产生,1. 单重态与三重态,2. 分子的活化与去活化,3.分子发光的类型,按激发的模式分类：,按分子激发态的类型分类：,光致发光,化学发光/生物发光,热致发光,场致发光,摩擦发光,,分子发光,,分子发光,荧光,磷光,瞬时荧光：,分析中有意义,迟滞荧光：,刚性、粘稠,介质中,,按光子能量分类：,斯托克斯荧光(Stokes)：,（溶液中）,λ,ex,<,λ,em,反斯托克斯荧光 (Antistokes)：,（高温稀薄气体中）,λ,ex,>,λ,e

4、m,共振荧光(Resonance)：,（,气体、晶体中,）,λ,ex,=,λ,em,荧光,,,,一. 分子荧光与磷光的产生1. 单重态与三重态2. 分子的活,4,电子自旋状态的多重性,大多数分子含有偶数电子，基态分子每一个轨道中两个电子自旋方向总是相反的,,，处于基态单重态。用 “S,0,” 表示,；当物质受光照射时，基态分子吸收光能产生电子能级跃迁，,由基态跃迁至更高的单重态，电子自旋方向没有改变，,净自旋 = 0,.这种跃迁是符合光谱选律的,,基态单重态,S,0,第一激发单重态,S,1,S,0,, S,1,, S,2,, S,3,分别代表基态, 第一, 二, 三激发单重态,单重态分子

5、具有抗磁性，激发态的平均寿命约为10,-8,,,电子自旋状态的多重性大多数分子含有偶数电子，基态分子每一个轨,5,,若分子中电子跃迁过程中伴随着自旋方向的改变，由基态单重态→激发三重态，净自旋, 0。这种跃迁为禁阻跃迁,,,,T,1,、T,2,、T,3,分别表示第一、二、三激发三重态,,基态单重态,S,0,第一激发三重态,T,1,自旋平行,三重态分子具有顺磁性，激发态的平均寿命约为10,-4,~1S,,,基态单重态 S0第一激发三重态 T1自旋平行三重态分子具有顺,6,分子的活化与去活化,S,0,S,1,T,1,S,2,紫外可见吸收,光谱,,,外转移,紫外可见共振荧光,光谱,,内转移,,荧光

6、,系间窜跃,,磷光,,反系间窜跃,迟滞荧光,振动弛豫,２. 无辐射跃迁的类型,振动弛豫:,V,r,10,-12,sec,外 转 移:,无辐射跃迁回到基态,内 转 移:,S,2,~S,1,能级之间有重叠,系间窜跃:,,S,2,~T,1,能级之间有重叠,反系间窜跃:,由外部获取能量后 T,1,~,,S,2,１. 辐射跃迁的类型,共振荧光：,10,-12,sec,荧 光：,10,-8,sec,磷 光：,1~10,-4,sec,迟滞荧光:,10,2,~10,-4,sec,,,分子的活化与去活化S0S1T1S2紫外可见吸收外转移紫外可见,7,荧光及磷光的产生,分子具有一

7、系列严格分立的能级—电子能级,每个电子能级中又含有一系列振动能层和转动能层,,分子中电子能级、,振动能级和转动能级示意图,电,子,能,级,,转,动,能,级,,振,动,能,级,,,,荧光及磷光的产生分子中电子能级、电转振,8,单重态：,如果分子中全部轨道里的电子都是自旋配对的，即s=0, 分子的多重度=1, 该分子体系处于单重态,基态(S0): 室温下，分子处于基态的振动能级。,此时所有电子皆遵从能量最低原理、Pauli不相容原理和洪特规则。,激发态: 被激发后, 能量变高, 属非稳状态。,单重态（S）,三重态（T）,基态,S,0,第一电子激发态S,1,第二电子激发态S,2,三重态,T,1,T

8、,2,三重态,：如果电子在跃迁过程中还伴随着自旋方向的改变，这时分子具有两个自旋不配对的电子,洪特规则,：,处于分立轨道上的非成对电子，平行自旋要比成对自旋更稳定。,Pauli不相容原理,：分子中同一轨道所占据的两个电子必须具有相反的自旋方向，即自旋配对。,,,单重态：如果分子中全部轨道里的电子都是自旋配对的，即s=0,,9,去活过程：从激发单重态（S1、S2）或激发三重态（T1）回到基态（ S0 ）,非辐射过程＋发射光子的过程,,分 子 发 光,：,处于基态的分子吸收能量（电、热、化学和光能等）被激发至激发态，然后从不稳定的激发态返回至基态并发射出光子，此种现象称为分子发光。,,荧光和磷光,

9、:,当紫外光照射某些物质时，由于这些物质结构的特殊性，会发出比吸收波长更长的光，当紫外光停止照射时, 随之消失的光叫做,荧光,，不立即消失的光叫,磷光,。,,,去活过程：从激发单重态,10,VR,VR,VR,v=,0,v=,0,v=,0,1,v=,0,2,3,1,2,1,2,1,2,S,2,S,1,S,0,T,1,分子内的光物理过程,VR-振动驰豫,，是指在同一电子能级中，分子由较高振动能级向该电子态的最低振动能级的非辐射跃迁。,VR-,振动驰豫,,,VRVRVRv=0v=0v=01v=023121212S2S,11,振动弛豫（Vibrational Relaxation, VR）,,在液相或

10、压力足够高的气相中，处于激发态的分子因碰撞将能量以热的形式传递给周围的分子，从而从S,n,高,振动,能层,失活至该电子能级,最低,振动,能层,的过程，称为振动弛豫。,,高振动能级 → 低振动能级,发生振动弛豫的时间：10,-12,s,,,,振动弛豫（Vibrational Relaxation, V,12,ic,ic,v=,0,v=,0,v=,0,1,v=,0,2,3,1,2,1,2,1,2,S,2,S,1,S,0,T,1,,,,,分子内的光物理过程,ic-内转化 ，是相同多重态的两个相邻电子态之间的非辐射跃迁。,ic-,内转化,,,icicv=0v=0v=01v=023121212S2S

11、1S,13,内转换（Internal Conversion，IC）,,当两个,电子能级,非常靠近,以致其振动能级有重叠时，发生电子由高能级以无辐射跃迁方式转移至低能级，,,相同多重态的两个电子态间的非辐射跃迁,【,例,】,:,高电子能能级→→低电子能级,S,2,→→,,S,1,T,2,→→,T,1,发生内转换的时间：,10,-13,,～,10,-11,s,,,,内转换（Internal Conversion，IC）,14,isc,v=,0,v=,0,v=,0,1,v=,0,2,3,1,2,1,2,1,2,isc,S,2,S,1,S,0,T,1,,,,分子内的光物理过程,isc-体系间窜跃,，是

12、指不同多重态的两个电子态间的非辐射跃迁。,isc-体系间窜跃,,,iscv=0v=0v=01v=023121212iscS2S,15,体系间窜跃,（Intersystem Conversion，ISC）,两个不同多重态之间的无辐射跃迁，如从,S,1,到T,1,，该跃迁是禁阻的。,但当不同多重态的两个电子能层有较大重叠时，处于这两个能层上的受激电子的自旋方向发生变化，即可通过自旋-轨道耦合而产生无辐射跃迁，该过程称为系间跨跃。,,不同多重态,的两个,电子能态间,的非辐射跃迁,外转换（External Conversion，EC）,受激分子与溶剂或其它分子相互作用发生能量转换,而使荧光或磷光强度减

13、弱甚至消失的过程，也称“,熄灭,”或“,猝灭,”,,,体系间窜跃（Intersystem Conversion，I,16,v=,0,v=,0,v=,0,1,v=,0,2,3,1,2,1,2,1,2,F,P,S,2,S,1,S,0,T,1,,,,,分子内的光物理过程,分子荧光，,处于第一电子激发单重态最低振动能级的分子，以辐射跃迁的形式返回基态各振动能级时产生的辐射跃迁。,分子荧光,,,v=0v=0v=01v=023121212FPS2S1S0T,17,荧光发射,荧光：分子中电子从单重激发态的最低振动能级在很短时间（10,-9,-10,-6,s）跃迁到基态各振动能层时所产生的光子辐射称为荧光。,

14、荧光发射：产生荧光的过程,S,1,→→ S,0,,,,荧光发射,18,v=,0,v=,0,v=,0,1,v=,0,2,3,1,2,1,2,1,2,F,P,S,2,S,1,S,0,T,1,,,,分子内的光物理过程,分子 ，,处于亚稳态的电子激发三重态最低振动能级的分子，以辐射跃迁的形式返回基态各振动能级时产生的辐射跃迁。,磷光,,,v=0v=0v=01v=023121212FPS2S1S0T,19,磷光发射,,从单重态,（S）,到三重态,（T）,分子间发生系间跨越跃迁后，再经振动弛豫回到三重态最低振动能层，最后，在10,-4,-10s内跃迁到基态的各振动能层所产生的辐射。,,,,磷光发射,20

15、,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,S,2,S,1,S,0,T,1,吸,收,发,射,荧,光,发,射,磷,光,系间跨越,,,内转换,,,振动弛豫,,,,,能,量,,,,,l,2,l,1,l,,3,,外转换,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,l,,,2,,,,,,,,,,,,,,T,2,,,,,,,,,,,,,内转换,,,,,振动弛豫,分子内的光物理过程,,,S2S1S0T1吸发发系间跨越内转换振动弛豫能l 2l 1l,21,去活化过程（Deactivation）,过程,：激发态分子→辐射或非辐射跃迁等→

16、基态,处于激发态的电子，通常以,辐射跃迁方式,或,无辐射跃迁方式等,再回到基态。,,去活化,发射光子,非辐射跃迁,化学反应,荧光,磷光,振动驰豫,内转换,外转换,系间跨越,,,去活化过程（Deactivation） 去活化发射光子非辐射,22,,分子被激发时的散射问题,,,,激发,光的能量,太低、不足以外层电子跃迁到 S,1,,但仍可将电子激发至基态的,高振动能级,上,,受激后能量无损失，,瞬间(10,ˉ¹,²s,) 返回原能级,受激发后有能量改,变,返回原来稍高,或稍低能级上,在不同方向上发射与原激,发光相同波长,λ1,的辐射,,瑞利散射,不同方向伴随的波长,发射为,λ1±Δλ,拉曼散射,

17、散射光波长＝激发光波长 　　　 拉曼带波长随激发光波长而变,,举例：在0.1mol/L硫酸中，硫酸奎宁荧光光谱的变化,,,分子被激发时的散射问题 激发光的能量太低、不足以外,23,二. 分子荧光(磷光)光谱,1. 荧光(磷光)激发光谱与发射光谱,荧光(磷光)均为光致发光，在光辐射的作用下，荧光物质发射出不同波长的荧光。,A. 激发光谱,,固定,,em,=620nm(MAX),,ex,=290nm,(MAX),固定发射波长,扫描激发波长,荧光激发光谱与紫外-可见吸收光谱类似,,,二. 分子荧光(磷光)光谱1. 荧光(磷光)激发光谱与发射光,24,,,ex,=290nm,(MAX

18、),固定,,em,=620nm(MAX),,固定,,ex,=290nm,(MAX),,em,=,620nm,(MAX),B. 发射光谱(荧光光谱),固定激发波长 扫描发射波长,C. 激发光谱与发射光谱的镜像关系,S,0,4,3,2,1,S,1,4,3,2,1,发射光谱的形状与激发波长无关：,分子的激发光谱可能含有几个激发带，但发射光谱只含一个发射带；即使分子被激发到高于S,1,的电子态，由于经过极快的内转换和振动弛豫降到S,1,电子态的最低振动、转动能级，然后以辐射形式释放能量回到基态。,1,→,,4,1,→,,3,1,→,,2,1,→,1,1,,→,4,1,,→,4,1,,→

19、,2,1,,→,1,,,ex =290nm (MAX)固定em=620nm(MA,25,D.磷光光谱,,,,与发射光谱相同条件下的磷光光谱,激发光谱,发射光谱,,,D.磷光光谱与发射光谱相同条件下的磷光光谱激发光谱发射光谱,26,2. 三维荧光光谱,I,F,,∝,f,(,λ,ex,、,λ,em,),蒽的激发光谱,固定发射波长、扫描激发波长,,,2. 三维荧光光谱I F ∝f (λex 、λem)蒽的激发,27,I,F,,∝,f,(,λ,ex,、,λ,em,),蒽的发射光谱,固定激发波长、扫描发射波长,,,I F ∝f (λex 、λem)蒽的发射光谱固定激发波长、,28,蒽的三维等高线光谱

20、图,,,蒽的三维等高线光谱图,29,蒽的三维等荧光强度光谱,,,蒽的三维等荧光强度光谱,30,VB,1,和VB,2,的三维荧光光谱,,,VB1和VB2的三维荧光光谱,31,三. 分子荧光(磷光)强度与荧光物质浓度的关系,1. 荧光强度(磷光)与浓度的关系,光吸收定律,（,Lambert – Beer Law,）,相应的吸光分数为：,荧光强度（,I,F,）与相应的吸光分数成正比：,按照级数展开式：,,,三. 分子荧光(磷光)强度与荧光物质浓度的关系1. 荧光强度,32,对于稀溶液，当, bc,<0.,05,（,磷光, bc,<0.,01,）时：,I,F,----荧光强度,,F,-----

21、荧光量子产率,k,--与仪器灵敏度有关的参数,I,0,--入射光强度。,I,P,----磷光强度,,P,-----,磷光,量子产率,b--吸收光程,,--摩尔吸光系数,C--荧光物质浓度,2. 讨论,,¤,I,0,变化对荧光强度的影响,¤,比UV-Vis的灵敏度高得多（2-4个数量级）,为什么？,,,对于稀溶液，当 bc<0.05（磷光 bc<0.01）时,33,3. 荧光(磷光)的量子产率,荧光量子产率的定义：,k,F、,k,p,主要取决与荧光物质的分子结构；,,st,系间窜跃效率。,,k,i,主要取决化学环境，同时也与荧光物质的分子结构有关。,大多数的荧光物质的量子产率在0.1

22、~1之间；,例如：0.05mol/L的硫酸喹啉，,,F,=0.55,；,,荧光素,,F,=,1,化合物,,,,,,,F,0.11,0.29,0.46,0.60,0.52,,,3. 荧光(磷光)的量子产率荧光量子产率的定义：kF、 kp,34,1. 跃迁的类型,二. 荧光与有机化合物的结构,对于有机荧光物质:,π,*,,→,π,n,→,π,*,ε,max,＜,100,平均寿命10,-5,~10,-7,sec,π,→,π,*,,ε,max,≥10,4,平均寿命10,-7,~10,-9,sec,k,S,→,T,小,π,*,→,n,π,*,→,π,是有机化合物产生荧光的主要跃迁类型。,强荧光的有

23、机化合物具备下特征:,①具有大的共轭,π,键结构；,②具有刚性的平面结构；,③具有最低的单重电子激发态为,S,1,为,π,*,,→,π,型；,④取代基团为给电子取代基。,§2.2 分子荧光与磷光强度的影响因素,一.荧光的量子产率,,,1. 跃迁的类型二. 荧光与有机化合物的结构对于有机荧光物质,35,2. 共轭效应,产生荧光的有机物质，都含有共轭双键体系，共轭体系越大，离域大,π,键的电子越容易激发，荧光与磷光越容易产生。,化合物,,,,,,苯,萘,蒽,丁 省,戊 省,λ,ex,max,(nm),205,286,365,390,580,λ,em,max,,(nm),278,32

24、1,400,480,640,,F,0.11,0.29,0.46,0.60,0.52,荧光物质的刚性和平面性增加，有利于荧光发射。,3. 刚性平面结构,芴,联苯,,F,=1,,F,=0.2,,,2. 共轭效应 产生荧光的有机物质，都含有共轭双键体系，共轭,36,不产生荧光,产生荧光,产生荧光,不产生荧光,,F,=0.92,萘,V,A,,F,(,萘),=,5,,F,(,V,A,),,,,,,荧光黄,酚酞,偶氮菲,偶氮苯,,,不产生荧光产生荧光产生荧光不产生荧光F=0.92萘VAF,37,1）给电子取代剂加强荧光,4. 取代基效应,—HN,2,， — NHR ， —NR,2,， —

25、OH， — OR ， — CN,产生,p,→,π,共轭,二苯甲酮：弱荧光、强磷光,S,1,→,T,1,的,系间窜跃产率接近1,化合物,苯,苯酚,苯胺,苯基氰,苯甲醚,λ,em,max,(nm),278~310,285~365,310~405,280~390,285~345,相对荧光强度,10,18,20,20,20,2）得电子取代基减弱荧光、加强磷光,—C=0， — COOH ， —NO,2,不产生,p,→,π,共轭,硝基苯：不产生荧光、弱磷光,,,1）给电子取代剂加强荧光4. 取代基效应—HN2， — NH,38,空间位阻对荧光发射的影响,3）取代基的位置,反式二苯乙烯,强荧光物质,,F,

26、=,0.75,,F,=,0.03,立体异构体对荧光发射的影响,顺式二苯乙烯,非荧光物质,电离效应对荧光发射的影响,OH,-,H,+,OH,-,H,+,pH=1, 有荧光,pH=13, 无荧光,无荧光,有荧光,,,空间位阻对荧光发射的影响3）取代基的位置反式二苯乙烯F=0,39,含有重原子的溶剂，由于重原子效应荧光减弱、磷光增强。,5.重原子取代基效应,—Cl， — Br ， —I,S,1,→,T,1,的系间窜跃由于重原子的存在增强,化合物,萘,1-甲基萘,1-氟萘,1-氯萘,1-溴萘,1-碘萘,λ,F,max,(nm),315,318,316,319,320,~,λ,P,max,(nm),

27、470,476,473,483,484,488,,P,/,,F,0.093,0.053,0.068,5.2,6.4,>1000,τ,,p,(s),2.6,2.5,1.4,0.23,0.014,0.0023,6.溶剂效应,蓝移:,△,,E,n →π*,,＜,△,,E,n →π*,红移:,△,,E,π→π*,,＞ △,,E,π→π*,在极性溶剂中：,无溶剂化作用,有溶剂化作用,,,含有重原子的溶剂，由于重原子效应荧光减弱、磷光增强。5.重原,40,三. 金属螯合物的荧光,1. 螯合物中配位体的发光,2. 螯合物中金属离子的发光,8-羟基喹啉,弱荧光,8-羟基喹啉-Zn螯合物,黄绿色强荧光

28、,2,2`-二羟基偶氮苯,无荧光,2,2`-二羟基偶氮苯-Al螯合物,强荧光,T,1,系间窜跃,,S,0,S,1,d,*,、,f,*,d,*,→,,d,f,*,→,,f,荧光,分子内能量转移,,,,三. 金属螯合物的荧光1. 螯合物中配位体的发光2. 螯合物,41,四. 荧光的熄灭,1. 碰撞熄灭,荧 光 熄 灭,：荧光分子与溶剂分子或其它溶质分子相互作用引起荧光强度降低或消失的现象。,荧光熄灭剂,：这些溶剂分子或其它溶质分子称为荧光熄灭剂。,相对速率,1,K,1,[M,*,],K,2,[M,*,] [Q],与分子的直径、粘度、温度等因素有关。,2. 能量转移熄灭,再吸收过程：,共振能量转移：

29、,分子内能量转移：,hv,激发,发射,熄灭,,,四. 荧光的熄灭1. 碰撞熄灭荧 光 熄 灭：荧光分子与溶剂,42,3. 氧的熄灭作用,氧分子是荧光、磷光的熄灭剂，,4. 自熄灭与自吸收,当荧光物质的浓度大于1g/L时，常发生荧光的自熄灭(浓度熄灭),自吸收：,没有除氧，溶液中难以观察到磷光,由于,,F,< 1，使荧光强度减弱或消失.,形成二聚体：,由于二聚体不发荧光，或发射荧光的能量有改变，造成自熄灭现象。,,,3. 氧的熄灭作用氧分子是荧光、磷光的熄灭剂，4. 自熄灭与,43,§2.3 荧光(磷光)分光光度计,一. 主要组成及部件的功能,荧光分光光度计工作原理基及仪器结构框图,,,光源,

30、氙灯,激发单色器,,,,,样品池,光电倍增管,数据处理,仪器控制,,,,,,,,,光源,样品池,激发,单色器,检测器,数据处理,仪器控制,发射,单色器,发射单色器,问题：,荧光分光光度计与紫外-可见分光光度计有何异同点？,,,§2.3 荧光(磷光)分光光度计一. 主要组成及部件的功能荧,44,,,第二章荧光磷光分析课件,45,二. 光源,1. 光源的要求：,发射强度足够且稳定的连续光谱,光辐射强度随波长的变化小,有足够长的使用寿命,2.氙灯光源,常用气体放电灯类型：,,氙灯光源 高压汞光源,波长范围：,200~1000nm,工作压力：,5~20 atm,启动电压：,20~40KV,使用

31、寿命：,1000~2000h,最广泛应用的连续光源：,发射波长范围宽 发射光强度大,,,二. 光源1. 光源的要求：发射强度足够且稳定的连续光谱2.,46,3. 高压汞灯光源,应用广泛的,线光源,：,253.7,296.5 302.2 312.6,313.2,365.0,365.5 366.3,404.7 435.8,546.1 557.0,579.0,(nm ),光源,样品池,激发,滤光片,检测器,数据处理,仪器控制,发射,单色器,光源,样品池,激发,滤光片,检测器,数据处理,仪器控制,发射,滤光片,,,3. 高压汞灯光源应用广泛的线光源：光源样品池激发检测

32、器数据,47,玻璃滤光片,的透射率,,,干涉滤光片,的透射率,截止涉滤光片,的透射率,,,玻璃滤光片的透射率干涉滤光片的透射率截止涉滤光片的透射率,48,三. 单色器,平面衍射光栅,线色散率,聚光本领,分辨率,四. 检测器,光电倍增管,放大倍数：2,n,~,5,n,;n=10,10,3,~,10,7,， 最大10,8,~,10,9,五.样品池：液池、荧光池,1.样品池的材料：与紫外-可见分光光度计的吸收池一样,2. 吸收池的形状：紫外-可见分光光度计的吸收池两面透光,荧光分光光度计的样品池四面透光,波长范围,3. 使用注意事项,容易破碎,问题：,紫外-可见分光光度计的吸收池与荧光分光光度计的

33、样品池有什么区别？,沾污问题,闪跃特性,,,三. 单色器平面衍射光栅线色散率聚光本领分辨率四. 检测器,49,,,六. 磷光分光光度计,1. 光学系统与荧光分光光度计的区别,光源,样品池,激发,单色器,检测器,数据处理,仪器控制,发射,单色器,,,切光器（斩波器）,,共振荧光：,10,-12,sec,荧 光：,10,-8,sec,磷 光：,1~10,-4,sec,迟滞荧光：,100~10,-4,sec,2. 样品池与荧光分光光度计的区别,通常情况下，样品池需要放在盛,液氮的石英杜瓦瓶,内，来测定,低温磷光,。,,,六. 磷光分光光度计1. 光学系统与荧光分光光度计的区

34、别光源,50,§12.４ 荧光分析法的应用,一. 工作曲线法,荧光分析的灵敏度比紫外－可见分光光度法高10,3,～10,4,.,荧光熄灭工作曲线法,F,x,F,C,s,,,,,,C,x,直接荧光标准曲线法,,,,F,C,s,,,F,x,C,x,二. 荧光分析法的灵敏度,,,§12.４ 荧光分析法的应用一. 工作曲线法荧光分析的灵敏度,51,在紫外光照射下会发生荧光的无机化合物很少，主要依赖于有机试剂形成的螯合物。,三. 荧光分析的应用,1. 无机化合物,直接荧光测定法,其中，较常测定的元素有：Be、Al、B、Ga、Se、Mg、Zn、Cd与某些稀土元素；测定的灵敏度有些可以达到10,-10,;,

35、某些元素虽然不与有机试剂形成发荧光的配合物，但是它会与发荧光的配合物争夺配位体，组成不发荧光的配合，使其产生荧光熄灭，由荧光熄灭的强度此该元素的含量。,较常测定的元素有：F、S、Fe、Ag、Co、Ni、Cu、Mo、W,荧光熄灭测定法,自从1867年Goppelsroder进行了历史上首次的荧光分析工作，应用铝—桑色素配合物的荧光进行铝的测定以来，采用有机试剂可以测定70多种元素。,,,在紫外光照射下会发生荧光的无机化合物很少，主要依赖于有机试剂,52,催化荧光测定法,较常测定的元素有：Cr、Nb、U、Te、Pb,某些元素虽然与有机试剂形成发荧光的配合物，但是反应速度慢，在某些微量元素的催化下，

36、反应速度会加快，在特定的时间内可用来测定微量元素。,低温荧光测定法,常测定的元素有：Cu、Be、Fe、Co、Os、Ag、Au、Zn、Al、Ti、V、Mn、Er、H,2,O,2,、CN,某些微量元素存在，会催化发荧光的配合物产生荧光熄灭，在特定的时间内可用来测定微量元素。,溶液温度的降低，显著增强溶液的荧光强度。液氮 －196,0,C,较常测定的元素有：Ce、Sm、Tb 等稀土元素,Sb、V、Pb、Bi、Nb、Mn,固体荧光测定法,固体荧光发在荧光分析中也经常用到。,固体荧光发在荧光分析中也经常用到。,,,催化荧光测定法较常测定的元素有：Cr、Nb、U、Te、Pb某,53,芳香族化合物存在共轭的

37、不饱和体系，是有机化合物荧光测定的主要类型。,２. 有机化合物,待测物,试剂,λ,ex,max,λ,em,max,测定范围 ppm,丙三醇,苯胺,紫外,蓝色,0.1~2,糠　醛,蒽酮,465,505,1.5~15,氨基酸,邻苯二甲醛,338,425,0.01~50,维生素A,无水乙醇,345,490,0~20,蛋白质,曙红丫,紫外,540,0.06~6,肾上腺素,乙二胺,420,525,0.001~0.02,青霉素,α-甲氧基-６-氯-９-(β-氨乙基)-氨基氮杂蒽,420,500,0.0625~0.625,玻璃酸梅,3-乙酰氧基吲哚,395,470,0.001~0.033,胍基丁胺,邻苯

38、二醛,365,470,0.05~5,四氧嘧啶,苯二胺,365,485,10,-4,3. 生命与生物物质,,,芳香族化合物存在共轭的不饱和体系，是有机化合物荧光测定的主要,54,紫外-可见分光光度计:,光源,样品池,单色器,检测器,数据处理,仪器控制,荧光(磷光)分光光度计:,光源,样品池,激发,单色器,检测器,数据处理,仪器控制,发射,单色器,,,紫外-可见分光光度计:光源样品池单色器检测器数据处理荧光(磷,55,,,,,,,,,,,紫外-可见分光光度计,测量池(吸收池),荧光分光光度计,样品池,I,0,I,t,I,0,I,t,I,F,p,四面光比色皿,,,紫外-可见分光光度计测量池(吸收池)荧光分光光度计I0It,56,