分子生物学改造

《分子生物学改造》由会员分享，可在线阅读，更多相关《分子生物学改造（102页珍藏版）》请在装配图网上搜索。

1、单击此处编辑母版标题样式,,单击此处编辑母版文本样式,,第二级,,第三级,,第四级,,第五级,,,,*,蛋白质分子的生物学改造,蛋白质在生命现象中具有重要作用，在医药、轻工等行业也具有重要作用，如胰岛素、枯草杆菌蛋白酶等；,,天然生物材料中蛋白质含量较少；,,基因克隆技术克隆基因，在宿主细胞中可表达特定蛋白质（重组蛋白）；,,多数天然蛋白质的理化特性不能适应于工业用途;,,利用现代,分子生物学技术,，改变克隆基因中的特定基因，即可表达出适合于商业用途的蛋白质。,,,在体外，通过碱基取代、插入或缺失的方法，使基因DNA序列中的某个特定碱基发生改变，从而改变蛋白质的结构，称为,蛋白质工程。,,通过

2、蛋白质工程，人们可以随心所欲地改变蛋白质的结构及其理化性质和生物学功能。例如，我们可以利用蛋白质工程改变酶的Km、Vmax，酶促反应的最适温度、最适pH值、酶促反应的特异性以及酶蛋白的稳定性等。,,蛋白质工程的主要技术之一是,定点突变技术.,,,一、定点突变,利用分子生物学技术，在体外通过,碱基取代、插入或缺失,可以使基因DNA序列中任何一个,特定的碱基发生改变,。这种体外特异性改变某个碱基的技术，称谓,定点突变（site directed mutagenesis）。,,定点突变,具有简单易行、重复性高等优点，现已发展成为基因操作的一种技术。这种技术不仅适用于基因结构与功能的研究，还可通过改变

3、基因的密码子来改造天然蛋白质。,,,,,,二、基因定点突变的意义,用于研究基因的结构与功能；,,通过改变基因的密码子来改造天然蛋白质，使其更符合人们的需要。如酶蛋白的改造以及新型疫苗或药物的开发。,,,,,,如枯草杆菌蛋白酶之所以易被氧化失活，是由于催化部位的,丝氨酸,(Ser221)邻近的,甲硫氨酸(Met222),易被氧化成硫氢化物，若以其他氨基酸取代Met222，则可提高酶的氧化稳定性而又不影响其催化活性。这是结构分析和定点突变改造蛋白质的成功范例。,,,枯草杆菌蛋白酶可作为洗涤剂的添加剂，但由于其只能水解,苯丙氨酸(Phe)羧基,所形成的肽键，底物作用范围过窄而限制了洗涤剂的高效性，若

4、用带正电荷的,赖氨酸,(Lys)取代位于活性中心166位的,甘氨酸,(Gly)，所获得的突变酶不仅能水解苯丙氨酸(Phe)羧基所形成的肽键，而且可以水解酸性氨基酸,谷氨酸(Glu),所形成的肽键，使其底物作用范围拓宽，因而可能成为最高效的洗涤剂添加酶，这是定点突变改变蛋白质生物学活性的成功例子。,,,,加入二硫键增加蛋白质的稳定性,蛋白质分子中两个半胱氨酸残基上的巯基（－SH）之间氧化脱氢即形成二硫键（－Ｓ－Ｓ－）。二硫键的数量与蛋白质的稳定性有关，增加蛋白质分子中的二硫键，可提高蛋白质分子的热稳定性、有机溶剂稳定性和酸碱稳定性。,,在一项研究中，通过寡核苷酸定点突变构建了T4溶菌酶的六种变异

5、体,比较了它们的活性.,,,,T4溶菌酶和6种设计的变体特性,,,酶 氨基酸的位置 二硫键的数目 相对活性 Tm,,,3 9 21 54 97 142 164 (%) (℃),,wtα Ile Ile Thr Cys Cys Thr Leu 0 100 41.9,,pwt Ile Ile Thr Thr Ala Thr Leu 0 100

6、 41.9,,A Cys Ile Thr Thr Cys Thr Leu 1 96 46.7,,B Ile Cys Thr Thr Ala Thr Cys 1 106 48.3,,C Ile Ile Cys Thr Ala Cys Leu 1 0 52.9,,D Cys Cys Thr Thr Cys Thr Cys 2 95 5

7、7.6,,E Ile Cys Cys Thr Ala Cys Cys 2 0 58.9,,F Cys Cys Cys Thr Cys Cys Cys 3 0 65.9,,,,wtα：野生型T4溶菌酶；pwt:假野生型酶；A－F：六种设计的半胱氨酸变体；Tm:熔点温度,,,将Asn和Gln转换成其他氨基酸,当蛋白质暴露于高温时:,,天冬酰胺（Asn） 天冬氨酸(Asp) + NH,3,,谷氨酰胺(Gln) 谷氨

8、酸(Glu) + NH,3,,导致肽链折叠的局部的改变,可能影响其活性。,,如酵母的,丙糖磷酸异构酶,是由两个相同的亚基组成的二聚体，每个亚基都含有两个Asn残基，均位于两个亚基相互接触的表面上，可能与该酶的热稳定性有关。,,若将两个Asn全部换成Asp，则变体酶即使在常温下也不稳定，而且酶活性也大为降低；,,而将2个Asn分别换为,苏氨酸,(Thr)和,异亮氨酸,(Ile)，其半衰期则延长。,,,酵母菌磷酸丙糖异构酶及其变体的热稳定性,,氨基酸位点,,酶 14 78 半衰期（min）,,野生型 A

9、sn Asn 13,,变体A Asn Thr 17,,变体B Asn Ile 16,,变体C Thr Ile 25,,变体D Asp Asn 11,,酶的稳定性以在100℃时半衰期或者失活率来表示。半衰期越长酶越稳定,,,减少游离Cys残基的数目,,在

10、利用DNA重组技术表达外源基因时，常常会遇到这种情况：外源蛋白的表达量很大，但其生物活性却很低，即外源蛋白的,比活性,很低。,,利用蛋白质工程技术减少游离的半胱氨酸（Cys）残基数目，以减少蛋白错误折叠的可能性，从而可以提高蛋白质的生物活性。,,,,例如：,当人β-干扰素基因（β-IFN）在大肠杆菌中表达时，尽管其表达量很高，但其比活性只及天然蛋白质的10%。,,DNA序列分析显示， β-IFN所编码的蛋白质有三个,Cys,残基，其中2个形成分子内,二硫键，,而另一个游离的Cys可能涉及到β-IFN分子间,二硫键,的形成，导致二聚体的产生，使单聚体含量减少，活性降底。,,将β-IFN分子中的游

11、离Cys残基用Ser来取代，因为Cys与Ser分子结构相似，前者有一个S原子，而后者是一个O原子，减少了二聚体的形成，提高了活性蛋白质的得率。,,,增加酶的活性,用定点突变技术不仅可以提高蛋白质的稳定性，还可以提高酶的活性。要改变酶的活性，需要一个详细描述了酶的活性位点的图谱。有了这样的资料，研究者们即可推测酶与底物的亲和程度，并利用定点突变技术对蛋白质进行改造，提高酶的活性。,,,,天然和突变酪氨酰-tRNA合成酶活性,,,,酶 K,cat,(s-1) Km(mmol/L) K,cat,/Km(s-1mol-1),,Thr-51

12、4.7 2.5 1.860,,Ala-51 4.0 1.2 3.200,,Pro-51 1.8 0.019 95.800,,,改变酶的特异性,突变葡萄球菌核酸酶与含-SH寡核苷酸结合示意图,,,,三、定点突变原理,,,,,,,,（一）M13DNA寡核苷酸突变,基因工程中,,噬菌体,是一种常用的基因载体,其中又以,M13,,和,λ,为最常用。,,M13噬菌体是一种环形DNA

13、，基因组大小为6.4kb，在颗粒中包装的仅是,正链的DNA,，有时也称为,感染型单链DNA(single stranded DNA, ssDNA),。,,当感染型单链M13噬菌体感染大肠杆菌后，在菌体内借助宿主的酶系统先把ssDNA复制为双链（dsDNA），称为,复制型（replication form,RF）M13（RF- M13）,。,,广泛用于DNA序列分析和噬菌体表面展示系统（phage display)和单链核酸的制备,。,四、定点突变的常用方法,,,,1.,基本原理,再使用化学合成的,含有突变碱基,的寡核苷酸短片段作引物，启动M13单链DNA分子进行复制，随后这段寡核苷酸引物便成为

14、新合成的DNA子链的一个组成部分。,,因此所产生的新链便具有已发生突变的碱基序列,将其转入细胞后,经过不断复制,即可获得突变的DNA分子,再经表达即可获得改造后蛋白质.,,为了使目的基因的特定位点发生突变，所设计的寡核苷酸引物的序列除了所需的突变碱基外，其余的则与目的基因编码链的特定区段完全互补。,,,2.突变过程,1)合成含有目的,,基因的正链DNA；,,2)合成含有特殊,,突变碱基的引物；,,3）制备异源双链,,DNA；,,4）富集和转化双,,链DNA分子；,,5）筛选突变体并鉴定,,,（二）Kunkel定点突变法,体外DNA合成往往是不完全的，所以部分合成的DNA分子必须通过蔗糖密度梯度

15、离心除去,获得纯化的突变DNA。,,理论上来说，DNA是半保留复制的，应用寡核苷酸定点突变时，所形成的噬菌体中携带突变基因的应为一半。但实际上，由于技术上的原因通常只有1-5%的噬菌斑含有突变基因的噬菌体。,,,具体步骤：,将待突变的基因克隆入,M13 DNA,载体上，导入具有,dUTP,酶（,dut,）和,N-,尿嘧啶脱糖苷酶（,ung,）双缺陷的大肠杆菌（,dut,-,，,ung,-,）菌株,中。,,Dut,缺陷,导致细胞内,dUTP,水平上升,，并在,DNA,复制时，部分取代,dTTP,进入,DNA,新生链中。又由于,ung,缺陷,使掺入,DNA,的,dUTP,残基不能除去,。由这种大肠

16、杆菌菌株产生的,M13,单链,DNA,大约有,1%,的,T,被,U,所取代,，然后进行,DNA,定点突变。,,双链,DNA,导入正常的大肠杆菌中，其尿嘧啶,N-,糖基化酶除去,DNA,链上的尿嘧啶碱基。,,结果原来的,M13,模板链被降解，只有突变链因不含,U,，被保留下来。这种方法产生的,M13,噬菌体中含有突变,DNA,的比例大大增加。,,,（三）,PCR定点突变,,Polymerase Chain Reaction,（,PCR）是一种体外酶促合成特定DNA片断的技术，是根据人类的需要对复杂生命过程的一种简单化的模拟。PCR技术的原理是DNA半保留复制。Kari.B.Mullis首创。,,

17、,,PCR进行寡核苷酸,,定点突变的示意图,,,,1、重叠延伸PCR （OE-PCR）,首先设计两个PCR反应以产生两个含突变位点的DNA片段，随后将上述两个PCR产物混合，二者通过,末端互补区结合,并在适宜的温度下,互为引物延伸,得到完整的含突变的基因，对第一次PCR产物进行纯化处理可显著提高突变效率,,,,,2、大引物PCR法,（megaprimer PCR ),先设置一个PCR反应产生一个含突变的DNA片段，然后再以此DNA片段作为引物与原模板退火进行PCR扩增得到含突变的完整的基因。因为作为引物使用的DNA片段较通常的引物要大许多甚至有上百碱基，所以命名为大引物PCR法。,,,,,大引

18、物PCR 定点突变技术路线,（圆点指突变位点）,,,3、环状突变 PCR 法,定义：以整个带有目的基因的质粒为模板，用突变剂进行扩增，最后产生环状的带有目的突变的质粒。,,方法：,,①,两个引物反向、紧邻但没有重叠区，扩增产物是平末端的线性DNA，需用T4连接酶环化处理。,,②,以Stratagene公司开发的定点突变试剂盒为代表，两个引物也是反向的并且其5’端有l5个碱基以上的重叠区，扩增产物为带黏性末端的线性DNA，可自行环化。,,,环状突变 PCR 法,,,环状突变 PCR 法,,,,,,,,,通过特殊氨基酸的改变提高蛋白的稳定性,例：,葡萄糖异构酶,（,Glucose isomeras

19、e,）,,用双引物法对葡萄糖异构酶基因进行了体外定点诱变，以,Pro138,替代,Gly138,，在酶比活相近的情况下，突变型葡萄糖异构酶的,热半衰期比野生型长一倍,，,最适反应温度提高,10~12,,C,。,,,据分析，可能由于,Pro138,替代,Gly138,引入的一个吡咯环刚好能够填充,Gly138,附近的空洞，使突变蛋白的空间结构更具刚性，从而提高了酶的热稳定性。,,,,通过引入,二硫键,提高蛋白的稳定性,蛋白质分子中两个半胱氨酸的巯基之间氧化脱氢即形成二硫键。二硫键的数量与蛋白质的稳定性有关，增加蛋白质分子中的二硫键，可以提高蛋白质分子的热稳定性、有机溶剂稳定性和酸碱稳定性。,,

20、,,通过改变活性中心附近的氨基酸提高酶的催化活性,应用举例：大肠杆菌碱性磷酸酶,,,E.coli,Alkaline phosphatase:,Mutation of D101S,,Wild Type D101S,Asp101,Ser101,,,二、编码基因,随机,突变和重组,,易错,PCR,（,Error prone PCR,）,,,DNA,改组（,DNA shuffling,）,,,,易错 PCR（error-prone PCR）,是指通过改变PCR反应条件来调整PCR反应中,突变的频率,,降低聚合酶固有的突

21、变序列倾向性,提高突变谱的多样性,使得错误碱基随机地以一定的频率掺入到扩增的基因中,从而得到随机突变的DNA群体,最后用合适的载体克隆突变基因。,,连续易错PCR (,sequential error prone PCR)策略。即将一次PCR扩增得到的有用突变基因作为下一次PCR扩增的模板，连续反复地进行随机诱变。,,,方法：,,增加,MgCl,2,浓度到,7mM,,稳定非互补的碱基配对,,增加聚合酶量到,5U,,促使在错配碱基处继续延伸反应,,降低一种,dNTP,的量,（降至,1,％,-10,％）,.,在缺乏正确核苷酸时,,,聚合酶经短暂停留后,,,会插入另外,3,种可用核苷酸的一种,,加入

22、次黄嘌呤,dITP,来代替被减少的,dNTP,,,能与,C,、,T,、,A,配对,,缓冲液中另加,0.5mmol/L MnCl,2,,,Mn,2+,能降低聚合酶对模板的特异性,,增加,dCTP,和,dTTP,的浓度到,1mM,，促进错误掺入,,使用,突变,DNA,聚合酶,如,Mutazyme,GC,→,AT,,,易错PCR(epPCR),,,,DNA改组,（,DNA Shuffling）,又称DNA“洗牌”,或DNA体外随机拼接技术,它依赖PCR,又不完全等同于传统的PCR技术,所以,DNA体外随机拼接又称为,有性PCR。,,指DNA分子的体外重组，是基因在分子水平上进行,有性重组,(Sexu

23、al Rebination)。通过改变单个基因(或基因家族，gene family)原有的核苷酸序列，创造,新基因,，并赋予表达产物以,新功能,。,,,DNA shuffling体外基因突变一般过程如下,,(1),获得目的基因:,选择一组分别具有一系列所需性状的基因序列作为重组的亲本,亲本之间有序列同源性(＞60%).亲本可以是经随机诱变得到的一组有益突变体,或天然存在的基因家族.常用的有两种方法。,,为了增加突变率采用,PCR,扩增目的基因回收,,为了增强保真性，可以采取抽提含有目的基因的质粒，通过酶切回收。,,,(2),基因酶切回收:,采用DNase I消化基因DNA得到10-50 bps

24、或100-300 bps的片段，酶切过程中用Mn,2+,能提高保真性3倍左右。,,(3),无引物PCR:,切割的DNA片段通过相互间的同源随机互补并互为引物,经PCR扩增,获得大量随机组合的新DNA突变体.为确保得到高保真性的片段，应在较高的温度下复性。,,同标准PCR,先对dsDNA进行热变性,退火时单链片段与足够长度互补序列的其它单链配对,形成3’或5’突出端,聚合酶延伸3’凹端.反复循环，随着循环数增加,片段的平均长度也增加,最后达到DNA亲本序列的原始长度.,,,(4),有引物PCR,:将无引物PCR产物作适当稀释，作为模板进行PCR，加入特定两侧引物进行最后的PCR扩增,便可获得全长

25、基因的PCR产物。,,(5),目的突变基因的获得:,回收目的片段克隆到载体上，转化选择所需的突变了的目的基因。如筛选抗性基因、高酶活基因等,,,DNaseⅠ处理,无引物PCR 片段重装配,3’,3’,5’,5’,3’,5’,5’,3’,5’,5’,3’,3’,5’,5’,3’,3’,反复循环,,,有引物PCR,克隆\筛选,,,DNA Shuffling技术能模拟生物的基因在数百万年间发生的分子进化过程，并能在短期的,,实验循环中定向筛选出特定基因编码的酶蛋白活性提高成千上万倍的功能性突变基因。,项目,进化速度,进化对象,进化,,周期,影响对象,突变效率,常规定向进化,缓慢进化,整个基因组,多年

26、,完整基因组,高,DNA,,Shuffling,快速进化,特定基因/,,操纵子/病毒,几天,部分基因组,低,DNA Shuffling与常规定向进化的比较,,,实例:,,1994,年，美国的,Stemmer,采用单个基因的,DNA Shuffling,和回交技术，在大肠杆菌中使编码,β,-,内酰胺酶的,TEM-I,基因的抗生素抑制活性,(,MIC,),从,0. 02ug/mL,提高到,640ug/mL,,即提高了,32, 000,倍。次后，他们又相继选取了绿色荧光蛋白基因,(,gfp,),和,β,-,半乳糖昔酶基因,(,lac,) (1997),用,DNA Shuffling,技术模拟并加速

27、了分子进化过程。筛选获得了酶活性大幅度提高的突变株,,1996,年，,Moore,等亦采用该技术对降解污水中有机污染物的对硝基苄基酯酶基因进行了定向模拟分子进化研究。,,1998,,Crameri,等采用,4,个不同来源的先锋霉素基因混合进行异源基因组的,DNA Shuffling,，使单一循环的,MIC,活性提高了,270-540,倍。而同时只用单一基因进行的实验仅提高了,8,倍。,,,交错延伸重组（staggered extension process，StEP）,将DNA Shuffling技术进一步改进的DNA体外重组技术,,核心技术:有性PCR,在一个反应体系中以2个以上有一定序列同

28、源性的DNA片段为模板进行PCR反应,通过,变换模板,机制实现DNA序列的重新组装,,,交错延伸重组的一般过程如下,,(1),获得目的基因:,选择两个以上有一定序列同源性的分别具有优良性状的亲本基因作为PCR模板,,省去用,DNase,Ⅰ,将,DNA,切割成片段及片段纯化步骤,,,简化了程序,,(2),短暂,PCR,反应,在每轮循环中,,,退火和延伸反应控制在短暂的时间,(5s),,引物先在一个模板链上延伸,,,只能合成出很短的新生链,.,经变性的新生链再作为引物与体系内同时存在的不同模板退火后继续进行短暂的延伸,,,此过程反复进行,,,直到产生全长的基因,,,得到间隔地含不同模板序列的杂交,

29、DNA,分子,.,,,(3),两端引物PCR,:加入两端引物作标准PCR反应,扩增全长的杂交DNA链。,,(4),目的突变基因的获得:,回收目的片段克隆到载体上，从得到的DNA文库中选择或筛选得到性状优化的基因,,,,,随机引发重组,,（ random-priming rebination，RPR,,）,原理:,用一套随机引物与模板配对延伸,产生互补于模板不同位点的短DNA片段混合物,由于碱基的错配和错误引发,这些短的DNA片段中也会有少量点突变,在随后的PCR反应中,这些短的DNA片段互为引物重新组装产生全长的基因,,模板:,一条DNA单链或cDNA,,,随机引发重组的一般过程如下,,(1)

30、,随机引发合成短DNA片段混合物:,以变性DNA为模板,加入随机引物,用大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片段进行延伸反应,得到长短不一的新生DNA片段(50-500bp),,(2),过滤、纯化DNA片段混合物,去除模板、长的新生DNA片段、小的新生DNA片段（＜30bp），蛋白质和引物.,,(3),无引物PCR,.新生DNA片段互为引物,重新组装产生全长的杂交DNA链,,(4)标准PCR 加入特异的两端引物,,,,,三、基因融合和基因剪接,1．利用基因融合技术表达外源基因的缘由,,2．基因融合的策略与蛋白质分子嵌合体,,3．蛋白质内含子介导的蛋白质分子间的连接,,,利用基因融合技术表达外源基因

31、的缘由,外源蛋白通常易被宿主的蛋白水解酶,降解,,通过与特异蛋白质或特异的结构域形成,融合蛋白,，利于快速回收、纯化,,融合蛋白可以体外切割去除融合部分，可以获得天然蛋白,,通过与特定的蛋白质形成融合蛋白，可以避免外源蛋白在细胞内形成,包涵体,,基因融合是对基因进行改造的手段，广泛用于蛋白质结构功能的研究,,,基因融合的策略,将重组基因直接剪接于适当的,信号肽,之后,,将外源基因本身按,阅读框架,自我融合。对一些小肽的稳定表达、表达产物的活性非常重要,,目标蛋白在与其融合的蛋白伙伴序列的,C,端或,N,端融合,,,为蛋白质的表达和纯化提供方便,,,研究蛋白质的定位及移动,,控制蛋白质固定的空间

32、取向,,构建具有双催化活性的融合蛋白或融合酶,,防止外源蛋白被宿主的蛋白水解酶降解,,改变胞内溶解性：硫氧还蛋白，GST,,蛋白表达的空间定位：信号肽,,,,接头（linker）的设计,,长度：过长对蛋白裂解敏感，免疫原性增加；过短影响蛋白折叠,,常用非极性的疏水氨基酸：构象广泛，有利于运动；体积小有利于堆积,,,单链抗体（scFv）,,,生化反应常常需要多酶顺序催化来进行，称为顺序酶反应（,Sequence enzyme reaction,）。大量的研究表明，通过基因融合构建具有,双酶活力的融合蛋白,，可有效提高顺序酶反应的总转化效率。,,,,N-terminal,C-terminal,FA

33、D,黑曲霉葡萄糖氧化酶(Glucose oxidase,GOD),N-terminal,C-terminal,曲霉糖化酶(Glucoamylase,GA),,,,,,,,,,GOD subunit,GOD subunit,GA,GA,GLG fusion enzyme,Linker,,peptide,,Schematic process of the fusion enzyme formation,Translated fusion peptide chains Expressed fusion enzyme,(Ser-Gly),,,融合蛋白

34、技术的应用可以使蛋白质的表达与纯化方便地进行。一般来说，将目标蛋白编码基因与一段被称为“亲和尾”（,Affinity tail,）的编码序列相连接，这段“亲和尾”可以与亲和层析柱上的配基特异地结合，,使目标蛋白可以用亲和层析的方法快速而简便地纯化出来。,,融合蛋白标签,,,,,含配体溶液,收集目的蛋白,洗下未结合的蛋白,混合蛋白样品,平衡液,带有配体的树脂珠（或胶粒）,,,融合标签的功能,,,蛋白,纯化,,蛋白质的,检测,和定向固定,,体内生物事件的,可视化,,提高重组蛋白质的,产量,,增强重组蛋白质的可溶性及稳定性,,,融合蛋白,报告分子,,将易于检测的蛋白质与目的分子融合表达，可显示目标分

35、子的存在和定位，广泛应用于启动子分析、监控转基因及其表达、细胞的信号转导与药物的,筛选,,,,,绿色荧光蛋白,（,Green fluorescent protein, GFP,),是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。其内源发光基团在受到紫外或蓝光激发时，可高效发射绿光，且无需底物和辅因子。,GFP,可作为一种“荧光标签”被用来研究目标蛋白的定位及移动情况。,,,,GFP的不同颜色,Green-GFP,,blue-BFP,,Cyan-CFP,,Red-RFP,,Yellow-YFP,,,各色荧光蛋白对细菌的标记,,The diversity of genetic mut

36、ations is illustrated by this San Diego beach scene drawn with living bacteria expressing 8 different colors of fluorescent proteins.,,2008年，科学家将多种色彩的荧光蛋白质植入细菌的DNA分子结构中。在细菌体内植入荧光蛋白可以观测这些细菌的生命机理是如何运行的。,,,,脑内连接,,,这张图片出自杰夫·利希曼(Jeff Lichtman)之手，展现了大脑内的连接，图片中美丽的“彩虹”就是神经系统网络。《连线》杂志网站曾于2007年刊登这张图片。,,,神经干细胞

37、,,这张不太拥挤的图像表明,干细胞是如何在空间排列自己的,。神经干细胞的,细胞核,被染为了,绿色,，另一种细胞――,星细胞,则表现为,红色。,,,荧光鱼,,在约克镇科技公司将荧光鱼引入市场后不久，荧光蛋白便迅速在商业上得到应用。在美国，读者可以在加利福尼亚以外的任何一个州购买到荧光鱼。(来源：新浪科技/孝文),,,GFP在肿瘤发病机制研究中的应用,,GFP,,是一个分子量较小的蛋白,易与其他一些目的基因形成融合蛋白且不影响目的基因产物的空间构象和功能。GFP 与目的基因融合,将目的基因标记为绿色,即可定量分析目的基因的表达水平,显示其在肿瘤细胞内的表达位置和量的变化,为探讨该基因在肿瘤发生、发

38、展中的作用及其分子机制提供便利条件。,,,荧光绒毛,,2008年绿色荧光蛋白成为诺贝奖的大赢家。这张图片就是用诺贝尔奖技术炮制的小肠绒毛图片，小肠绒毛是凸出于小肠的细小手状结构，具有吸收食物营养的功能。,科学家将红色荧光蛋白标记导入小肠绒毛细胞中，展现出带有荧光标记的小肠绒毛,。,,,真皮成纤维细胞,,,成纤维细胞,制造胶原蛋白，在体内充当脚手架的作用，支持其它细胞呆在适当的位置，同时让其它化学物质“沐浴”这些细胞。,,图像中的这些细胞来自,人体皮肤,，被用于研究病毒是如何透过皮肤入侵人体的。,,,为帮助了解这些病毒壳在做什么，科学家让它和绿色荧光蛋白结合，从而使它呈现为,绿色,。,成纤维细胞

39、的肌动蛋白被染为了,红色,，DNA则为,蓝色,。,,,应用举例二：,,有机磷水解酶（,Organophosphorus hydrolase, OPH,）能够降解许多种有机磷农药。将,GFP,基因与,OPH,基因的,5,’端融合，构建,GFP-OPH,融合基因,，并将其在大肠杆菌中表达。经,IPTG,诱导后，绿色荧光直接可见，融合蛋白同时保持了,OPH,和,GFP,的生物活性。此外，由于,GFP,的荧光强度与,OPH,活力成正比，还可通过荧光强度的检测对,OPH,进行定量分析。,,,,●,控制某一代谢途径的相关基因,,,紧密连锁地排列在一起.,Lac operon I p

40、 o Z Y A,operon,I:,调控基因,,P:,启动子,,O:,操纵基因,,,,,乳糖代谢的条件,E. coli,:,“This is my favorite!”,乳糖,半乳糖,葡萄糖,,,,如何利用乳糖,E. coli,: “I need,,lactose permease,,,,β-galactosidase,,and,,transacetylase,.”,,,,,,何时利用乳糖,E. coli,:,,“I will use lactose only when,there is no glucose,and,there is lactose,.”,,,,,,,

41、,,,,,,,,Glucose + Lactose +,Glucose,–,Lactose –,Glucose,–,,Lactose +,,,,,,乳糖操纵子的结构,The,lac,operon,,,大肠杆菌乳糖操纵子,乳糖操纵子控制模型的主要内容：,,⑴Z、Y、A基因的产物由同一条多顺反子的mRNA分子所编码；,,⑵启动区P位于阻遏基因I与操纵区O之间；,,⑶操纵区是DNA上的一小段序列，是阻遏物结合的位点；,,⑷当阻遏物与操纵区结合时，lac mRNA的转录起始受到抑制；,,⑸诱导物通过与阻遏物结合，改变其三维构象，使之不能与操纵区结合，使lac mRNA能够合成。,,,,,,,,,,,

42、,,,,乳糖操纵子乳糖存在但是葡萄糖不存在的情况,Repressor,Promoter,LacY,LacA,LacZ,Operator,CAP,Binding,Repressor,Repressor,,mRNA,,Hey man, I,’,m,,constitutive,CAP,cAMP,Lac,Repressor,Repressor,X,This lactose has,,bent me,,out of shape,CAP,cAMP,CAP,cAMP,Bind to me,,Polymerase,,RNA,,Pol.,RNA,,Pol.,Yipee,…,!,,,蛋白质剪接,原理,：由蛋白质

43、内含肽所介导。是一个蛋白质翻译后的加工过程，它由一系列分子内的剪切---连接反应组成。,,,蛋白质内含肽,是一个蛋白质前体中的多肽序列，可以催化自身从蛋白质前体中断裂，使两侧的蛋白质外显子连接成成熟的蛋白质。,,,利用内含肽载体致力生物合成,C-S,酯键肽链或,N-,半胱氨酸肽链,,内含肽介导的异源蛋白质体外连接,,用反式剪切技术实现蛋白质体内、体外连接,,双内含肽介导的蛋白质自身环化及蛋白多聚体的生成,内含肽的应用,intein,,,,胰岛素的研发史,自18世纪至今，在诸多研究者不断进取的努力下，胰岛素的研究经历了五个阶段：,,,发现胰岛素,,,得到胰岛素,,,了解胰岛素,,,合成胰

44、岛素,,,改造胰岛素,,,与胰岛素研究相关的诺贝尔奖项,,,1923-- F.G.,Banting,,医学奖,,,,生理学奖,,,1958-- Frederick Sanger,化学奖,,,1977--,Rosalyn Yalow,,,生理学或医学奖,The Nobel Prize,,,95,,,,,胰岛素的研究发展史,——,改造胰岛素,胰岛素的蛋白质空间结构对维持其生物活性有很重要的意义，人工合成的胰岛素制剂受此影响在皮下注射后需有一定的解离时间才能发挥效力，故治疗时需提前,20-30,分钟注射胰岛素。,,糖尿病人需要更接近生理状态、使用方便的胰岛素制剂。,,利用基因重组技术，修饰胰岛素

45、的氨基酸组合：,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,A,1,,,B,1,21,30,,,28 27,27 28,lispro,基因合成的人胰岛素类似物,优泌乐,,赖脯胰岛素,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,A,1,,,B,1,21,30,,,,,天门冬氨酸,赖氨酸,glulisine,,,,,,谷氨酸,赖氨酸,谷赖胰岛素,基因重组的速效人胰岛素类似物，直接以单体胰岛素的形式入血，能够在注射后被迅速吸收，注射,10,分钟后即可起效。,,与长

46、效胰岛素联合应用，模拟基础、餐时胰岛素治疗，血糖更易控制，低血糖发生率低,。,,,,人胰岛素类似物,,基因重组的速效人胰岛素类似物的预混制剂，具有餐时注射起效快，灵活方便的特性。,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,A,1,,,B,1,21,30,,,,,天门冬氨酸,脯氨酸,aspart,诺和锐,,门冬胰岛素,诺和锐30特充,速效胰岛素,,,几十年来,胰岛素注射器已经有了很大的改进。许多品牌厂商制造胰岛素专用注射器,针头经过特殊处理,因而注射时不感到疼痛,而且针眼很小。注射器针筒上直接标有胰岛素单位(IU)，注射几个单位胰岛

47、素只要按标记抽取,不需换算。,一次性注射器,,,一种利用高压将胰岛素“喷”入皮下的装置，无需针头，加之其经久耐用，常给惧怕针头的儿童使用。但此装置价格较贵，拆洗安装过程较繁琐，喷射时局部压力较大，尚未广泛推广使用。目前高压注射器多用于人群计划免疫和多人集中注射的情况。,高压无针注射仪,,,胰岛素笔是一种形如钢笔的专用注射装置,将胰岛素液储存于笔中,使用前调好剂量旋钮,患者自己注射方便易行。,,胰岛素笔配有专用笔盒,可随身携带,更方便于旅行出差时使用。,,笔上配有触感式剂量调整旋纽 ，也能适用于眼睛不方便的患者。,胰岛素笔,,,,胰岛素泵是目前最方便、最现代化的注射方式，可以自动定时定量地注射胰岛素，能较好模拟生理性胰岛素分泌，可以准确控制胰岛素的输入剂量，并能经导管连续不断按需要将胰岛素输入患者皮下。随着技术的发展，胰岛素泵越发小巧，功能亦不断完善，目前的胰岛素泵仅重约100克,如一台寻呼机大小，携带方便。,,胰岛素泵,,,