毛细管电泳-非接触式电导分离检测食品中天然甜味剂

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1、单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,毛细管电泳-非接触式电导分离检测,食品中天然甜味剂的研究,Separation and Determination of Natural Sweeter in Foods,by High Performance Capillary Electrophoresis with Contectless Conductivity Detection,报告人：李慧晶,指导老师：谢天尧副教授,内容概要,实验部分,2,实验总结,4,机理探讨,3,前言,1,人工合成甜味剂,天然甜味剂,甜味剂,蔗糖、葡萄糖、果糖、,麦芽糖、

2、蜂蜜、甜菊苷等,阿斯巴甜、糖精、甜蜜素、,帕拉金糖、安赛蜜、纽甜等,据一报道称，,2003,年,9,月下旬，我国出口到日本的速冻类、酱菜类、罐头类等食品皆因甜蜜素问题受阻。有专家则认为，甜蜜素是一种,无营养,甜味剂，,有致癌、致畸、损害肾功能等副作用,，,有的发达国家已全面禁止在食品中使用甜蜜素。,我国对糖精钠、甜蜜素、安赛蜜的使用量有限制，且在婴幼儿产品中禁止,使用糖精钠！,课题背景,“零度”,(ZERO),可口可乐,用,阿斯巴甜,代糖取代天然甜味剂，使其虽然无糖却有甜味。,近日，这种可乐受到广泛的争议。,每,100mL“,零度,”,可乐含只含,0.3kCal,的热量，而普通可乐,45kCa

3、l/mL,。,“零度”可口可乐真的不含有天然甜味剂吗？,课题背景,仁果类,(,苹果、梨,),以果糖为主，蔗糖、葡萄糖次之,核果类,(,桃、杏,),以蔗糖为主，葡萄糖、果糖次之,浆果类,(,葡萄、草莓、猕猴桃,),葡萄糖和果糖,柑桔以蔗糖多,各种水果中所含糖的种类是不一样的,对糖尿病人更适宜,比葡萄糖易于吸收、利用,果糖,由于,口腔的细菌将,食物中的,蔗糖成份转换,成酸,，从而,侵蚀牙齿的珐琅质,蔗糖,导致蛀牙,课题背景,糖的检测难度大，是分析化学界公认的难题：,（4）,化学结构非常相似，异构体很多,分离困难,（1）,熄灭系数很低,很难直接荧光检测,（3）,不易挥发,很难用气相色谱(GC)直接分

4、析,（2）,极性极强，亲水,很难用传统的反相HPLC或SFC(超临界流体色谱)直接分析，而必须借助于衍生,课题背景,目前检测糖的方法存在的问题：,很难直接荧光,检测,缺乏发色基团，,必须借助于衍生,结构相似，,分离困难,亲水性强，,不易挥发,很难用传统的,反相HPLC,直接分析,糖类分析,存在的困难,课题背景,课题研究的内容,为此，本课题提出采用高效毛细管电泳-非接触式电导法，建立快速、灵敏和低成本的食品中天然甜味剂的分离分析新方法。,分离分析原理,毛细管电泳是指离子或带电粒子,以,毛细管为分离通道,以,高压直流电场,为驱动力,依据样品中各组分之间的,淌度和分配,行为上产差异而实现分离的分析技

5、术。是近十几年发展起来的液相分离分析新方法。,非接触式电导检测原理,电容耦合非接触式电导检测（,C,4,D,）是,近年来发展起来一种新型的电导检测方法。,由于非接触式中电导电极与溶液隔离，避免了因电极与溶液接触而造成的诸多问题，彻底地消除了电极吸附（中毒）的问题，电极寿命长，抗干扰能力强。同时，,C,4,D,检测池结构简单，电极容易固定，对毛细管直径没有限制，可使用内径为,5m,的毛细管。正是因为,C,4,D,检测具有通用、灵敏、适用性强、重现性好等优点，,研制更优性能的C,4,D检测器及其应用研究成为了当前CE研究中的一个热点。,非接触式电导检测原理,非接触式电导检测原理,非接触式电导检测仪

6、,非接触式/接触式双通道电导检测器的实物图,（谢天尧老师课题组研制）,二、实验部分,仪器试剂,条件确定,样品测定,实验仪器,CES2008型毛细管电泳仪,（谢天尧老师课题组研制）,毛细管电泳数据工作站（软件）,试剂,氢氧化钠（广州化学试剂厂）,无水磷酸氢二钠（广州化学试剂厂）,十六烷基三甲基溴化铵（上海伯奥生物科技有限公司）,水为超纯水,石英毛细管（,25,微米内径，,365,微米外径，有效长度为,40,厘米）为河北永年色谱器件有限公司生产。,Na,2,HPO,4,Na,2,HPO,4,+硼砂,NaOH,Na,2,HPO,4,+硼砂+CTAB,Na,2,HPO,4,NaOH,NaOH,Na,2

7、,HPO,4,CTAB,NaOH,Na,2,HPO,4,CTAB,体系,基线平稳，信噪比高，分离度和灵敏度最佳。,电泳运行液的选择,NaOH浓度的影响,结论：10mmol/L NaOH分离效果好，出峰快。,浓度太小，糖被络合得不完全,迁移时间提前，峰形宽钝,浓度太大时，峰形变得尖锐,但基线不稳，分离度也下降,考察了NaOH浓度分别为,6mmol/L,8mmol/L,10mmol/L,12mmol/L,14mmol/L,16mmol/L,对三种糖的分离情况,Na,2,HPO,4,的影响,浓度过低时，糖被络合得不够完全，体系的离子强度太小,反映在电导上，就会导致信号强度过小，难以检出,浓度过高时，

8、过量的负离子会干扰络合离子，,体系离子强度过大，会导致基线不稳，同样不利于分离。,考察了Na2HPO4浓度分别为,1.5mmol/L-检不出果糖,3.5mmol/L-基线平稳，分离效果较好,5.5mmol/L-基线不平稳，峰形较宽，分离度不好,电渗流改进剂（CTAB)的影响,CTAB是电渗流改向剂。,添加CTAB，可以减少电渗流，,能在阳极端有效地检测被测组分离子。,CTAB的加入量200,mol/L为最佳。,12kV,结论：电压较低，分离度增大，灵敏度高，但分离时间较长；加大分离电压，可缩短迁移时间，峰形尖锐，但灵敏度降低。,因此，,本实验选定分离电压为：-12kV。,分离电压的确定,进样时

9、间的确定,进样时间影响进样量的大小，也是影响分离效果的重要因素。,3S,5S,7S,9S,11S,考察了进样时间的影响，结果如下：,进样太少，达不到检测灵敏度，出峰不明显,进样量太大，出现拖峰现象，峰形重叠,分离度最好,分离电压的确定,考察了分离电压的影响，结果如下：,-6KV,-12KV,-16KV,峰形宽钝，且出峰时间延长,出峰较快；,体系不稳定，迁移时间提前,最佳实验条件的确定,NaOH,10mmol/L,Na,2,HPO,4,3.5mmol/L,CTAB 0.,2,mmol/L,分离电压,-12.0kV,进样电压,-10.0kV,进样时间,7s,糖的种类,回归方程,相关系数,线性范围,

10、（,mmol/L,）,检测限,（,mmol/L,）,果糖,葡萄糖,蔗糖,y=5.8+802.6x,y=13.3+877.6x,y=6.9+126.5x,0.9997,0.9991,0.9998,0.1 50.0,0.08 30.0,1.3 90.0,0.03,0.02,0.3,线性范围与检测限,葡萄糖,果糖,蔗糖,表2 果糖、葡萄糖、蔗糖的重现性测定,重现性测定,序号,1,2,3,4,5,6,RSD/%,果糖峰高面积,果糖迁移时间（min）,葡萄糖峰面积,葡萄糖迁移时间（min）,蔗糖峰面积,蔗糖迁移时间（min）,412,8.3,307,8.5,331,9.0,410,8.3,307,8.6

11、,333,9.0,405,8.1,296,8.4,347,8.9,412,8.3,295,8.5,350,8.7,402,8.2,286,8.4,336,8.6,420,8.1,303,8.5,343,9.0,1.5,1.1,2.7,0.9,2.4,1.8,2.3.1 “零度”可口可乐样品,实际样品测定,样品名,果糖（g/100mL）,葡萄糖（g/100mL）,蔗糖（g/100mL）,零度可口可乐,未检出,未检出,未检出,图8 “零度可口可乐”饮料的毛细管电泳谱图,2.3.2 可口可乐样品,样品名,果糖（g/100mL）,葡萄糖（g/100mL）,蔗糖（g/100mL）,可口可乐,1.19,1

12、.07,0.75,图6 “可口可乐”饮料的毛细管电泳谱图,1：果糖 2：葡萄糖 3：蔗糖,2.3.2 王老吉样品,样品名,果糖（g/100mL）,葡萄糖（g/100mL）,蔗糖（g/100mL）,王老吉,未检出,未检出,1.94,图7“王老吉”饮料的毛细管电泳谱图,1：蔗糖,2.3.2 雪碧样品,样品名,果糖,（g/100mL）,葡萄糖（g/100mL）,蔗糖（g/100mL）,雪碧,1.35,1.35,1.26,图9 “雪碧”饮料的毛细管电泳谱图,1：果糖；2：葡萄糖；3：蔗糖,2.3.3 荔枝样品,样品名,果糖,g/100g,葡萄糖,g/100g,蔗糖,g/100g,荔枝,未检出,11.6

13、,7.31,图11.荔枝样品的毛细管电泳谱图,1：果糖；2：葡萄糖,2.3.4 葡萄样品,样品名,果糖,（g/100g）,葡萄糖,（g/100g）,蔗糖,（g/100g）,葡萄,2.21,6.61,未检出,图12 葡萄样品的毛细管电泳谱图,1：果糖；2：葡萄糖,2.3.5 红苹果样品,样品名,果糖,（g/100g）,葡萄糖,（g/100g）,蔗糖,（g/100g）,红苹果,8.31,3.50,未检出,图13 苹果样品的毛细管电泳谱图,1：果糖峰 2：葡萄糖,样品名,果糖,（g/100g）,葡萄糖,（g/100g）,蔗糖,（g/100g）,橙子,1.12,2.67,6.49,橙子样品,图14.橙

14、子样品的毛细管电泳谱图,1：果糖；2：葡萄糖；3：蔗糖,蔗糖：,C,12,H,22,O,11,，非还原性双糖,葡萄糖：,C,6,H,12,O,6,，多羟基醛类糖,机理探讨,果糖：,C,6,H,12,O,6,，多羟基酮类糖,蔗糖、葡萄糖和果糖是中性分子，但在,强碱性和络合剂存在的条件,下,可以通过与运行液中存在的络合剂作用，以,络阴离子形式,存在，并采用高效毛细管电泳实现分离分析。,果糖,机理探讨,葡萄糖,蔗糖,机理探讨,果糖二磷酸钠,葡萄糖磷酸钠,糖在碱性条件下络合带电的机理,（1）,PO,4,2-,参与络合，以果糖为例，其反应如下：,+2Na,2,H,PO,4,2.,PO,4,2-,参与络合

15、，以葡萄糖为例，其反应如下：,+Na,2,H,PO,4,不同种类糖上羟基的取向与数量的差异,在强碱性条件下，糖与磷酸根离子结合,糖所带电荷量不相等,有效淌度存在差异,这种差异足以被毛细管电泳分辨开,本文采用高效毛细管电泳,-,非接触式电导法建立了食品中天然甜味剂（果糖、葡萄糖和蔗糖）的分离检测新方法，具有如下优点：,（1）,采用含磷酸盐的强碱性电泳运行液，使中,性糖分子成为络阴离子而带上负电荷，产生,有效淌度差异，这种差异足以被毛细管电泳,分辨开。样品无需复杂的前处理步骤。,（2）,电导检测是一种通用型检测器，对不含有,光学基团的糖，可以直接进行检测，无需衍生,化处理，具有灵敏度高、操作简便等优点。,结论,感谢学院给予我们一个锻炼的机会！,感谢谢天尧老师一直以来的细心指导，他严谨的治学态度和丰富的专业引导我们走上这个讲台，走进科研的殿堂！,感谢现代化学实验室老师们的支持！,特别感谢实验室的师兄师姐！,致谢,谢 谢！,