实验3质粒的提取和鉴定

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1、单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,碱变性法小量提取质粒,DNA,的限制性酶切,厦门大学医学院,分子生物学实验教学组,目的,掌握碱裂解法提取质粒,DNA,的方法,:,最常用的提取基因工程中运载基因的载体,掌握质粒酶切鉴定原理,学会根据目的基因和实验目的选择合适载体与限制性内切酶，设计构建体外重组分子,质粒,(plasmid),是染色体外能够进行自主复制的遗传单位，包括真核生物的细胞器和细菌细胞中染色体以外的,DNA,分子，在基因工程中质粒常被用做基因的载体。,质粒,DNA,的提取方法,方法：,碱裂解法,；煮沸裂解；羟基磷灰石柱层析法，质粒,D

2、NA,释放法；酸酚法等。,概括起来主要是用非离子型或离子型,去污剂,、,有机溶剂或碱,进行处理及用,加热,处理,所有分离质粒,DNA,的方法都包括,3,个基本步骤：培养细菌使,质粒扩增,；收集和裂解细菌；,分离,质粒,DNA(,有时还要求,纯化,质粒,DNA,，根据实验所需,),选择哪一种方法主要取决于以下几个因素：质粒的大小、大肠杆菌菌株、裂解后用于纯化的技术和实验要求,碱裂解法,基本原理：,1.,当菌体在,NaOH,和,SDS,溶液中裂解时，蛋白质与,DNA,发生变性，当加入中和液后，质粒,DNA,分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体,DNA,不复性而呈絮状，离心

3、时可沉淀下来,2.,在一定电场强度下，,DNA,分子的迁移取决于分子筛效应，即,DNA,分子本身的,大小,和,构型,(,相对分子质量不同的,DNA,片段泳动速度不一样,),，且,DNA,分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。因此，,凝胶电泳,不仅可分离,不同相对分子质量,的,DNA,，也可以,分离相对分子质量相同，但构型不同的,DNA,分子,：其中超螺旋结构泳动最快，其次为线性结构，最慢的可能是,复制中间体,（没有复制完的两个质粒连在一起），,而不是,开环结构,（用,Eco,RI,来线性化质粒后再进行琼脂糖电泳，就会看到线性质粒,DNA,的位置与这三条带的位置不一样）,3.,溴化乙锭

4、是一种荧光染料,(3,8-,二氨基,-5-,乙基,-6,苯基菲啶溴盐,),，其分子可以嵌入到核酸的碱基对之间，在紫外线的激发下，发出橙色荧光,原理示意图,限制性核酸内切酶,:,一类能识别双链,DNA,中特定碱基顺序的核酸水解酶。,限制性切酶以内切的方式水解核酸链中的磷酸二酯键，产生的,DNA,片段,5,端带磷酸基团，,3,端为,-OH,。,限制性核酸内切酶分类,识别切割特性,催化条件,是否具有修饰酶活性,至,2005,年,1,月，共发现限制酶,3681,种,型,59,种,型,3612,种,型,10,种,商业化的限制酶有,588,种，在,型限制酶中共有,221,种特异性。,型限制与修饰系统,占,

5、90%,以上，即通常指的,DNA,限制性内切酶，它们能识别双链,DNA,的特异顺序，并在这个顺序内进行切割，产生特异的,DNA,片段；,型酶分子量较小，仅需,Mg,2+,作为催化反应的辅助因子，识别顺序一般为,4-6,个碱基对的反转重复顺序；,型内切酶切割双链,DNA,产生,3,种不同的切口：,5,端突出，,3,端突出和平末端。,酶切反应中应注意以下几个问题：,1.,内切酶：,不应混有其他杂蛋白特别是其他内切酶或外切酶的污染；注意内切酶的识别位点和形成的粘性末端；,2.,内切酶的用量：,根据内切酶的单位和,DNA,用量而定。使用中一般以,1 g DNA,用,2-3U,酶进行酶切为宜；,3.,内

6、切酶体积：,不能超过反应体系的,10%,，因内切酶中含,50%,甘油，体系中甘油超过,5%,会抑制内切酶的活力；,4.,操作条件：,应在低温下进行（冰上）；使用时防止操作中对内切酶的污染。,5.DNA,：,作为内切酶的底物，,DNA,应该具备一定的纯度，其溶液中不能含酚、氯仿、乙醚、,SDS,和酒精等，这些因素的存在均在不同程度影响限制性内切酶的活性。,反应缓冲液：,1.,反应缓冲液,:,主要由,Tris-HCl,、,NaCl,、,Mg,2+,组成，其中,Mg,2+,为内切酶的辅基；,A.Tris-HCl,维持反应体系的,PH,值在,7.27.6,之间；,B.NaCl,浓度：,低盐,(10mM

7、 NaCl),中盐,(50mM NaCl),高盐,(100mM NaCl),2.,酶解的温度,：,大多数限制酶的反应时间为,37,，如,EcoR,、,Hind,、,BamH,、,Pst,等，也有如,Bcl,需在,50,下进行反应。,3.,酶解反应时间,：,根据酶的单位与,DNA,用量之比来定，原则是酶,/DNA,23,，,12,小时即可充分酶解。,4.,酶单位定义,：在每种内切酶理想的反应条件下，,0.05mL,反应混合物中,1,小时消化,1g,底物,DNA,的酶量为,1,单位,(1U),。,三 质粒提取实验材料与试剂,（,一）实验材料：,过夜培养大肠杆菌,DH-5a,（二）实验试剂：,LB,

8、培养基,0.1M NaCL,、,10mM Tris.CL,（,pH8.0,）、,1mM EDTA,、,Amp 50mg/ml,、酚、氯仿、,Rnase,、琼脂糖,TE,：,10mM Tris.CL,（,pH8.0,），,1mM EDTA,溶菌酶,10mg/ml,（用,10mM Tris.CL,，,pH8.0,，新鲜配制）,溶液,溶菌液：,50mM,葡萄糖，,25mM Tris.Cl,（,pH8.0,），,10mM EDTA,，,2mg/ml,溶菌酶。,溶液,NaOH-SDS,液：,0.2N NaOH,，,1%SDS,。,溶液,3mol/L NaAc,（,pH4.8,）溶液：,5M KAC 10

9、ml,，冰醋酸,11.5ml,，水,28.5ml,。,四步骤,(,一,),细菌培养与质粒扩增,1.,挑单克隆,E.coli,菌株接种到,4ml LB,培养液中（含,Amp 50g/ml,），,37 225rpm,振荡,培养过夜。,（活化菌种）,2.,从中取,2ml,种子菌液于含,Amp,培养基,500ml,中，,37,振荡培养,3-4,小时（,OD,600,1.0,）,3.,取,4ml,培养液至,Eppendorf,管中，,12000 rpm,，,4,离心,30,秒，弃上清，用,1ml STE,悬浮菌体，再离心回收菌体，并重复一次，弃上清，取沉淀。,步骤二 质粒提取,取,4ml,培养物至,Ep

10、pendorf,管中，,12000rpm,，,4,，离心,30sec,，弃上清。,用,1ml STE,悬浮菌体，再离心回收菌体，并重复一次，弃上清取沉淀，使细胞沉淀尽可能干燥。,将细菌沉淀悬浮于,100l,预冷的溶液,I,中，加入,10 l,溶菌酶（,10mg/ml,），,剧烈振荡,均匀，冰上放置,1,分钟。,加,200L,溶液,II,（,新鲜配制,），盖紧,Eppendorf,管，快速轻柔颠倒,5,次，混匀内容物，将,Eppendorf,管放在冰上,3,分钟。,5.,加入,150L,溶液,III,（冰上预冷），盖紧管口，颠倒数次使混匀，冰上放置,5min,。,6.12000r/min,，,4

11、,离心,5min,，将上清夜转至另一,1.5ml,Eppendorf,管中。,7.,加入等体积酚,/,氯仿（,1,：,1,），振荡混匀，,室温放置,5-10min,，,12000 rpm,，,4,下离心,2,分钟，,倒去上清，把,Eppendorf,管倒扣在吸水纸上，吸干液体。,8.,加入,2,倍体积冰预冷无水乙醇，振荡混匀，,12000 rpm,4,离心,5,分钟。,9.,倒去上清，加入,1ml,冰预冷,70%,乙醇振荡漂洗,DNA,沉淀。,12000 rpm,，,4,离心,2,分钟。,10,弃上清并尽量吸除液体，打开管盖，室温放置,5min,。室温放置,15min,干燥。,11,50L T

12、E,缓冲液（含无,DNase,的,RNase 20 g/ml,），使,DNA,完全溶解（,-20,保存）,12,取样品,10 l,加,2ul 6 Loading buffer,于,1%,琼脂糖电泳，电泳凝胶在凝胶成像系统上成像。,双酶切实验材料,限制性内切酶：,EcoR,、,Xba,和,Hind,DNA,：,DNA,和质粒,pCDNA-p38,10buffer H,（,37,PH7.5,）,90mM TrisCl,50mM NaCl,10M MgCl,2,10buffer M,（,37,PH7.5,）,6mM TrisCl,100mM NaCl,6M MgCl,2,1mM DTT,10BSA,

13、：,1mg/ml,无菌水,方法和步骤,1.,反应体系配制：,质粒,pCDNA3,p38 10 l,（,1g,）,10buffer M 2 l,10BSA 2 l,EcoR 1 l,Xba 1 l,H,2,O 4 l,总体积,20 l,2.,将反应体系充分混匀，并于台式离心机上短暂离心收集液体。,3.Eppendorf,管于,37,水浴中反应,23,小时。,4.,反应结束后,70,灭活,15min,或者加入,EDTA,至终浓度,10mM,终止反应。,5.,取,20l,反应液加入,6loading buffer,混匀于,1.2,琼脂糖凝胶胶上,150,伏电泳，约,30min,加入,5l,未酶切对照

14、。,6.,凝胶成像体系观察记录结果。,7.,当,DNA,条带充分分开后，在紫外灯下细心切取所要的,DNA,条带。尽量去除多余的凝胶。紫外灯照射,DNA,片段不要超过,30,秒。注意保护眼睛免受紫外线伤害,。,五 实验结果,双链,DNA,样品浓度,(g/l)=OD260,核酸稀释倍数,50/1000,。,RNA,样品浓度,(g/l)=OD260,核酸稀释倍数,40/1000,。,（在波长,260nm,紫外光下，,1 OD,值的吸光度相当于双链,DNA,浓度为,50g/ml,；单链,DNA,为,37 g/ml,；,RNA,为,40 g/ml,。）,凝胶成像结果,1.2%Agarose Gel,1

15、2 3 4,1.1000bp DNA ladder,2.CDNA3-p38/EcoRI+XbaI,3.ppCDNA3-p38,4.100bp DNA ladder,六,注意事项,为提高质粒产量，要注意下面步骤：,加入溶液,I,后，涡旋振荡应充分打散菌体使之均匀悬浮；,加溶液,II,裂解要完全,(,快速轻柔颠倒,5-10,次,),，使蛋白质和核酸变性；,加溶液,III,后,PH,要达到中性,(,轻柔振荡,5-10,次,),，使质粒,DNA,复性，这样才能使质粒,DNA,与染色体,DNA,完全分开，否则，难分开，所以裂解和复性这两步要从严掌握。,加入乙醇沉淀,DNA,时，要把离心管盖上盖子倒翻摇动

16、几次，注意观察水相和乙醇之间没有分层现象之后，才可以放到冰箱中去沉淀,DNA,。,七思考题,1.,要得到高质量质粒样品，用碱变性法小量提取质粒时要注意什么事项？,2.,溶液,I,、溶液,II,和溶液,III,的作用是什么？在实验中分别加入上述溶液后反应体系出现的现象及其成因是什么？,3.,酚氯仿抽提时,DNA,溶液体系出现什么现象？为什么？,4.,沉淀,DNA,时为什么要用无水乙醇及在高盐、低温条件下进行？,5.,在整个酶切反应过程中应注意哪些问题？,6.,如何选择,DNA,和限制性内切酶的用量？,7.,反应体系中为何内切酶用量不能超过整个反应体系的,10%,？,注意,EB,是诱变剂，配制和使用,EB,染色液时，应带乳胶手套或一次性手套，并且不要将该染色液洒在桌面或地面上，凡是沾污,EB,的器皿或物品，必须进行清洗或弃去,