生物制药技术2-基因构建

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1、单击此处编辑母版标题样式,,单击此处编辑母版文本样式,,第二级,,第三级,,第四级,,第五级,,,,*,单击此处编辑母版标题样式,,单击此处编辑母版文本样式,,第二级,,第三级,,第四级,,第五级,,,,*,生物制药技术,朱俊铭,,201,6,-3-,7,1,《,生物制药技术（含实验）,》,课程教学大纲,2,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,生物制药研发的基本流程,3,,,,基因构建,发酵培养,分离纯化,制剂研究,质量研究,中 试,,放 大,稳定性,,研 究,药效学,,研 究,安全药理研 究,,临床申报,药学

2、(实验室),药学(中试),药理学,临床试验,2.,1 基因与工程细胞构建,,2.,2,工程细胞的发酵培养与蛋白表达,,2.,3 重组蛋白的分离纯化,,2.,4 生物制药的制剂研究,,2.,5 生物制药的质量研究与分析技术,,2.,6 生物制药的中试研究,,2.,7 生物制药的稳定性研究,第二章 重组蛋白药物的药学概论,,原核细胞,,真核细胞,4,2.1,.1 基本概念,,2.1,.2,质粒、载体,,2.1,.3 工程细胞与细胞库,,2.1,.4 表达方式选择,,2.1,.5 基因构建与诱导表达,,2.1.6,实例,2.1,基因与,工程细胞构建,5,第二章 重组蛋白药物的药学

3、概论,2.1,,基因与工程细胞构建,基因重组,——分子水平、提取、连接、转染、复制、表达,,别称——基因工程、DNA重组、遗传工程、基因操作、克隆,工程细胞的三要素,,基因,,载体,,宿主细胞,6,2.1.1,基本概念,基因,——一段具有蛋白结构编码的核酸序列,,载体,——质粒、噬菌体、病毒,,限制性内切酶、连接酶,,抗生素抗性基因——Kan、Neo、Tet、Amp、Str,,宿主细胞,——细菌、酵母、哺乳动物细胞、昆虫细胞,2.1,,基因与工程细胞构建,7,2.1.1,基本概念,组建表达载体条件,,强启动子,,两侧的调控序列,,选择标记,,正确的读码框架,,合适的核糖体结合位点（SD序列）,

4、,SD序列与起始密码子ATG之间合适的距离,,被翻译的蛋白性质与稳定性,,合适的宿主细胞,2.1,,基因与工程细胞构建,SD,序列（,Shine-Dalgarno sequence,）：,mRNA,中用于结合原核生物核糖体的序列。,SD,序列在细菌,mRNA,起始密码子,AUG,上游,7-12,个核苷酸处，有一段富含嘌呤的碱基序列，能与细菌,16S rRNA3’,端识别，帮助从起始,AUG,处开始翻译,,8,2.1.1,基本概念,2.1.2 质粒、载体,2.1,,基因与工程细胞构建,9,2.1,,基因与工程细胞构建,10,2.1,,基因与工程细胞构建,11,克 隆,鉴 定,宿主细胞,细胞筛

5、选,细胞库,合成、分离、RT-PCR,,,优化、测序,,,抗性基因、限制性内切酶位点,,,宿主与产品的相关性,,,表达水平、产品鉴定,,,三级细胞库、遗传稳定性,载 体,2.1,,基因与工程细胞构建,12,2.1.3,工程细胞与细胞库,原始种子库,主种子库,工作种子库,2.1,,基因与工程细胞构建,,,,,,,,,,,,,,,,13,调控,调控,生物遗传中心法则,DNA RNA Protein,2.1,,基因与工程细胞构建,14,蛋白质结构,Primary Structure ——,The sequence of amino aci

6、ds on the polypeptide chain,,,Secondary Structure,—— Conformation of the polypeptide chain (3D structure),,,Tertiary Structure,—— Three Dimensional Structure (Folding) of the protein,,,Quaternary Structure ——,Complexation with other proteins (Similar or dissimilar structures),2.,1,基因与工程细胞构建,15,2.1.4

7、,表达方式选择,依赖于制备过程的蛋白质结构,Prokaryotic cells,,,Easier to make,,Cheaper to produce,,Improper folding of protein,,No glycosylation,,No Secretion,,Eukaryotic cells,,,Can properly fold the protein,,Glycosylate-(maybe differently),,Harder to clone,,Harder to maintain in cell culture,,May harbor viruses,,,Lowe

8、r yields,,Higher expense,2.,1,基因与工程细胞构建,16,2.1.4,表达方式选择,,,,,,,,,,2.1.5 基因构建与诱导表达,2.,1,基因与工程细胞构建,17,2.,1,基因与工程细胞构建,18,2.1.5 基因构建与诱导表达,,,,,,,,,,Soluble,Inclusion Body,Secreting,2.,1,,基因与工程细胞构建,原核细胞表达系统,19,2.1.5 基因构建与诱导表达,优点突出,,正确指导蛋白质正确折叠,,提供糖基化等多种翻译后加工,,在新基因发现、蛋白质结构功能研究中起极为重要的作用,,生产阶段系统表达水平达到7g/L,,生物

9、医药产业发达国家新药研发中均选择哺乳动物细胞表达系统,2.,1,基因与工程细胞构建,哺乳动物细胞表达系统,20,2.1.5 基因构建与诱导表达,正常细胞生长特性,,锚地依赖性,,血清依赖性,,接触抑制性,,形态依赖性,,,体外培养正常细胞改变某些特征，越过生理临界点，继续无限制分裂,——,细胞系形成,2.,1,基因与工程细胞构建,哺乳动物细胞表达系统,21,2.1.5 基因构建与诱导表达,哺乳动物细胞表达系统,受体细胞条件,,细胞系特征——丧失细胞接触抑制和锚地依赖性,,遗传稳定性——外源基因多次传代不丢失,,合适的标记——便于筛选与维持,,生长快且齐——分裂周期短，生长均一,,安全性——不合

10、成、分泌致病物质，不致癌,,,以高效表达外源基因为目标的高等哺乳动物受体细胞必须条件,2.,1,基因与工程细胞构建,22,2.1.5 基因构建与诱导表达,遗传标记,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,哺乳动物细胞表达系统,2.,1,,基因与工程细胞构建,23,2.1.5 基因构建与诱导表达,常用宿主细胞,商业化,,CHO——,中国仓鼠卵巢细胞系,,BHK——,小仓鼠肾细胞系,,COS——,非洲绿猴肾成纤维细胞系,,NSO——,小鼠骨髓瘤细胞系,,SP2/0——,小鼠骨髓瘤细胞系,,HEK293——,人胚肾细胞系,,NIH313——,鼠成纤维细胞系,,因稳定性与糖基化不同，根

11、据表达目的蛋白选择适当细胞系,哺乳动物细胞表达系统,2.,1,,基因与工程细胞构建,24,2.1.5 基因构建与诱导表达,真核表达载体必要原件,,高活性启动子、转录终止序列、有效mRNA翻译信号,,复制子、抗生素抗性基因、限制性酶切位点,,标志基因,,内含子,,内部核糖体进入位点（IRES）,哺乳动物细胞表达系统,2.,1,,基因与工程细胞构建,,一般真核mRNA的翻译都需要5,',帽子来介导核糖体结合，但真核生物和病毒中还存在一些例外情况，例如一些基因5'端具有一段较短的RNA序列（约150-250,bp,），这类RNA序列能折叠成类似于起始tRNA的结构，从而介导核糖体与RNA结合，起始蛋

12、白质翻译，这段非翻译RNA被称为内部核糖体进入位点序列（Internal ribosome entry site, IRES）,25,2.1.5 基因构建与诱导表达,诱导的方式,,IPTG/乳糖,,低温,,pH,,低磷,表达检测方式,,表达标志物,,电泳,,GFP,遗传稳定性,,基因稳定性——琼脂糖电泳、指纹图谱、PCR、测序,,表达稳定性——表达标志物、活性,,四环素,,蜕皮激素,,他可莫斯/雷帕霉素,,RU486,2.,1,,基因与工程细胞构建,26,2.1.5 基因构建与诱导表达,高效表达外源蛋白的基本原理,,通过强化基因扩增高效表达外源基因,,DHFR-MTX高效表达系统,哺乳动物细胞

13、表达系统,2.,1,,基因与工程细胞构建,27,2.1.5 基因构建与诱导表达,组织纤溶酶原激活剂,第一个重组哺乳动物细胞规模化生产的溶栓药物——人组织纤溶酶原激活剂(tPA),目前市场上销售的阿替普酶(tPA)采用DHFR-MTX系统表达，受体细胞为CHO系统,,人tPA也可由大肠杆菌生产，但蛋白折叠效率低,2.,1,,基因与工程细胞构建,28,2.1.6,实例,组织纤溶酶原激活剂,2.,1,基因与工程细胞构建,29,2.1.6,实例,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,组织纤溶酶原激活剂,2.,1,基因与工程细胞构建,30,2.1.6,实例,,,,,,,,,,tPA,rPA,,,,,5

14、27,个氨基酸,分子量,65kD,缺失突变,,,,355,个氨基酸,,分子量,39kD,,KringleⅡ,、,,丝氨酸蛋白酶区,,Finger,区、,KringleⅠ,、,KringleⅡ,、,EGF,区、,,丝氨酸蛋白酶区,2.,1,,基因与工程细胞构建,组织纤溶酶原激活剂,31,2.1.6,实例,2.,1,基因与工程细胞构建,组织纤溶酶原激活剂,32,2.1.6,实例,载体：,pET-44a,,宿主菌：,BL21,酶切位点：,PshA,Ⅰ/,Hind,Ⅲ,2.,1,,基因与工程细胞构建,组织纤溶酶原激活剂,33,2.1.6,实例,思考题,基因重组的三要素是什么？每个要素的关键是什么？,,宿主细胞主要有哪几类？其特点是什么？,,原核细胞表达方式有几种，选择方式的主要依据有哪些？,,细胞系的形成及其意义是什么？,34,35,知之者不如好之者,,好之者不如乐之者,