08化妆品的微生物学检查

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1、Click to edit Master title style,,Click to edit Master text styles,,Second level,,Third level,,Fourth level,,Fifth level,,*,,*,,,,,,,,单击此处编辑母版标题样式,,单击此处编辑母版文本样式,,第二级,,第三级,,第四级,,第五级,,*,单击此处编辑母版标题样式,,单击此处编辑母版文本样式,,第二级,,第三级,,第四级,,第五级,,*,第八章,化妆品的微生物学检查,1,,化妆品的卫生标准,,化妆品微生物学检查基础知识,,化妆品中微生物总数检查,,化妆品中控制菌检查,

2、2,一、,2007,版“化妆品卫生规范”,,粘膜用、婴儿及儿童用化妆品,,,眼部及口唇等,,细菌菌落总数,不得大于,500CFU/mL,或,500CFU/g,。,,其他化妆品,,细菌菌落总数,不得大于,1000CFU/mL,或,1000CFU/g,3,所有化妆品,,霉菌和酵母菌总数,不得大于,100CFU,／,mL,或,100CFU,／,g,,,每克或每毫升产品中不得检出,粪大肠菌群,、,铜绿假单胞菌,和,金黄色葡萄球菌,。,,4,二、检查的必备知识,1.,采样,,采样应具有代表性。从两个包装单位以上的样品中共取,10g,或,10mL,作为检验量。,,样品应严格保持原有的包装状态。容器不应有破

3、裂，在检验前不得打开，防止样品被污染。,,接到样品后，应立即登记，编写检验序号，并按检验要求尽快检验。及时检验的样品应放在室温阴凉干燥处，不要冷藏或冷冻。,5,二、检查的必备知识,1.,采样,,若样品需同时做多种分析，如细菌、毒理、化学等，则宜先取出部分样品做细菌检验，再将剩余样品做其它分析。,,在检验过程中，从打开包装到全部检验操作结束，均须防止微生物的再污染和扩散，所用器皿及材料均应事先灭菌，全部操作应在无菌室内进行，或在相应条件下，按无菌操作规定进行。,6,二、检查的必备知识,1.,采样,,如检出粪大肠菌群或其它致病菌，自报告发出之日起该菌种及被检样品应保存一个月。,7,二、检查的必备知

4、识,2.,供检样品（供试品）的制备,,水溶性液体样品,样品,,10mL,90mL,生理盐水,,1:10,供试液,8,二、检查的必备知识,2.,供检样品（供试品）的制备,,油性液体样品,②,5mL,灭菌液体石蜡,1:10,供试液,均质器,,,③,10mL,灭菌吐温,80,40~44℃,①,10mL,样品,混匀,,,10min,,,④,75mL 40~44℃,灭菌生理盐水,,,40~44℃,乳化,9,二、检查的必备知识,2.,供检样品（供试品）的制备,,亲水性半固体（膏、霜、乳剂）样品,振荡,②,90mL,生理盐水,上清液作为,1:10,供试液,,,,,,,①,10g,样品,15min,,,,,,

5、,膏、霜剂若用均质器，混合均质,1~2min,即可。,10,二、检查的必备知识,2.,供检样品（供试品）的制备,,疏水性半固体样品,②,10mL,灭菌液体石蜡,1:10,供试液,均质器,,,③,10mL,灭菌吐温,80,40~44℃,①,10g,样品,混匀,,,10min,,,④,70mL 40~44℃,灭菌生理盐水,,,40~44℃,乳化,膏、霜剂若用均质器，混合均质,3~5min,即可。,11,二、检查的必备知识,2.,供检样品（供试品）的制备,,固体样品,振荡,②,90mL,生理盐水,上清液作为,1:10,供试液,,,,,,,①,10g,样品,15min,,,,,,,12,三、细菌、真菌

6、总数检查,1.,意义,,测定总数主要是作为判定化妆品被细菌、霉菌及酵母菌污染程度的标记，也可以观察化妆品中细菌、霉菌及酵母菌的性质和在化妆品中的繁殖动态，以便对样品进行卫生学评价时提供科学依据。,,13,三、细菌、真菌总数检查,2.,培养基、培养温度和时间,检查菌,培养基名称,培养温度,培养时间,细菌,卵磷脂、吐温,80-,,营养肉汤琼脂,36,℃,±,1,℃,48h,±,2h,真菌,虎红琼脂,28,℃,±,2,℃,72h,±,2h,14,三、细菌、真菌总数检查,,3.,方法－平皿法,数据,处理,混合平板的制备,细菌、真菌的培养,检查结果、观察与计数,供试液,的制备,书写检验,记录单,15,,

7、,,细菌、霉菌和酵母菌计数的操作过程,10,-1,10,-2,10,-2,,,10,-1,10,-1,10,-2,10,-2,,,10,-1,对照,对照,对照,对照,1.0ml,倒置培养,48h±1h,36℃,±,1℃,卵磷脂、吐温,80-,营养肉汤琼脂,,,28℃,±,2℃,,虎红琼脂,倒置培养,72h±2h,9.0ml,,,,,,,,,,,稀释液,10g/ml,供试品,,,,9.0ml,10,-2,,,,,,,,10,-1,,,1.0ml,16,三、细菌、真菌总数检查,,4.,操作注意事项,,1.,尽量使菌细胞分散开，使每个菌细胞生成一个菌落，否则将会导致重大的技术误差。,,,2.,为防止

8、细菌增殖及产生菌苔，制成供试液后，应尽快稀释，注皿。一般稀释后应在,1,小时内操作完毕。,17,三、细菌、真菌总数检查,,4.,操作注意事项,,3.,使用吸量管时，应小心沿管壁加入，不用触及管内溶液，以防吸管尖端外侧黏附的溶液混入其中。,,,4.,注意抑菌现象。由于防腐剂未被中和，往往使平板计数结果受影响，如低稀释时菌落少。而高释释度时菌落数反而增大。遇此情况应重复检验，以确定是防腐剂影响还是操作技术误差。,18,三、细菌、真菌总数检查,,4.,操作注意事项,,5.,为检查和控制灭菌效果，应做空白对照，以检验所使用的物品是否彻底灭菌及检验过程是否无菌操作。,,,6.,为便于区别化妆品中的颗粒与

9、菌落，可在每,100mL,卵磷脂吐温,80,营养琼脂中加入,1mL0.5,％的,TTC,溶液，如有细菌存在，培养后菌落呈红色，而化妆品的颗粒颜色无变化。,19,三、细菌、真菌总数检查,,5.,菌落计数及报告方法,,宜选取细菌、酵母菌平均菌落数,30~300,之间、霉菌平均菌落数,5~50,之间的稀释级，作为菌数报告（取两位有效数字）的依据。,,（,1,）,当只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，即以该平皿菌落数乘其稀释倍数,;,,（,2,）若有两个稀释度，其平均菌落数均在,30,个～,300,个之间，则应求出两菌落总数之比值来决定，若其比值小于或等于,2,，应报告其平均数，若大于,2,则报告

10、其中稀释度较低的平皿的菌落数,20,三、细菌、真菌总数检查,,5.,菌落计数及报告方法,（,3,）,若所有稀释度的平均菌落数均大于300 个，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之,;,,（,4,）若所有稀释度的平均菌落数均小于,30,个，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之,;,,,（,5,）若所有稀释度的平均菌落数均不在,30,～,300,个之间，其中一个稀释度大于,300,个，而相邻的另一稀释度小于,30,个时，则以接近,30,或,300,的平均菌落数乘以稀释倍数报告之；,,（,6,）若所有的稀释度均无菌生长，报告数为每,g,或每,mL,小于,10CFU;,21,例次,

11、不同稀释度平均菌落数,,,两稀释度,,菌数之比,菌落总数,,(CFU/mL,或,CFU/g),报告方式,,(CFU/mL,或,CFU/g,),,10,-1,10,-2,10,-3,,,,1,1365,164,20,-,16400,16000,或,1.6*10,4,2,2760,295,46,1.6,38000,38000,或,3.8*10,4,3,2890,271,60,2.2,27100,27100,或,2.7*10,4,4,不可计,4650,513,-,513000,513000,或,5.1*10,5,5,27,11,5,-,270,270,或,2.7*10,2,6,不可计,305,12,

12、-,30500,31000,或,3.1*10,4,7,0,0,0,-,<1*10,,22,四、控制菌检查,－检查项目,（,1,）,阴性对照,试验：应无菌生长。,,（,2,）,阳性对照,试验：供试品,+,阳性对照菌，应检出相应的阳性对照菌。,,（,3,）,供试品,控制菌检查：依相应的检查方法进行。,23,四、控制菌检查,－检查流程,供试品,增菌培养,分离培养,纯培养,染色镜检,生化反应试验,报告结果,24,四、控制菌检查,－检查流程,1.,增菌培养目的,,使被检药物中的被检菌增殖，避免出现漏检。,25,四、控制菌检查,－检查流程,2.,分离培养目的,,经增殖培养后,,,被检菌大量繁殖，同时其他一

13、些杂菌也出现增殖。因此分离培养能使目的菌从混合菌中分离出来。,26,四、控制菌检查,－检查流程,3.,纯培养目的,,只是大量增殖被检菌，用于后面的进一步检验。,27,四、控制菌检查,－检查流程,4.,染色镜检目的,,初步鉴定，观察细菌的形态大小。,28,四、控制菌检查,－检查流程,5.,生化试验目的,,最终的鉴定依据，结合染色镜检得出实验结果，填写检验报告。,29,四、控制菌检查,－,粪大肠菌群检查,★,粪大肠菌群,,粪大肠菌群系一群需氧及兼性厌氧,革兰氏阴性,无芽胞杆菌，在,44.5℃±0.5℃,培养,24h,～,48h,能发酵乳糖,产酸并产气,。,30,四、控制菌检查,－,粪大肠菌群检查,

14、★,粪大肠菌群检查意义,,粪大肠菌群主要存在于温血动物粪便中，随粪便排出体外后可直接污染化妆品，若产品中检出该菌群，表明该产品受到粪便污染，可能存在肠道致病菌并引起疾病，是评价化妆品卫生质量的重要指标之一。,31,四、控制菌检查,－粪大肠菌群检查,,产酸：黄色,产气：气泡,产酸产气,书写检验,记录单,不产酸不产气,增菌培养,供试液的制备,配培养基和稀释液,检查结果判断,44 ±0.5℃,24~28h,分离培养,蛋白胨水培养,最终结果判断,44 ±0.5℃,24,±,2h,靛基质,,特征菌落,36±1 ℃,18~24h,,双倍胆盐乳糖,M,,EMB,琼脂,,液面玫瑰红色,,紫黑色,★,粪大肠菌群

15、检查流程图,32,双倍乳糖胆盐培养基,EMB,琼脂培养基,靛基质试验,气泡，培养基呈黄色,紫黑色金属光泽,玫瑰红色液面,33,四、控制菌检查,－,粪大肠菌群检查,★,粪大肠菌群检查结果报告,,,根据发酵乳糖产酸产气，平板上有典型菌落，并经证实为革兰氏阴性短杆菌，靛基质试验阳性，则可报告被检样品中检出粪大肠菌群。,34,四、控制菌检查,－铜绿假单胞菌检查,★,铜绿假单胞菌,,铜绿假单胞菌属于假单胞菌属，为,革兰氏阴性,杆菌，,氧化酶阳性,，能产生,绿脓菌素,。此外还能,液化明胶,，,还原硝酸盐,为亚硝酸盐，在,42℃±1℃,条件下能生长。,35,四、控制菌检查,－铜绿假单胞菌检查,★,铜绿假单胞

16、菌检查意义,,铜绿假单胞菌在特殊情况下可引起皮肤化脓感染、泌尿道感染、中耳炎等。外伤及烧伤患者感染后最易引起化脓，并引起败血症。为保证消费者安全，化妆品中不得检出铜绿假单胞菌。,36,四、控制菌检查,－铜绿假单胞菌检查,最终结果判断,增菌培养,供试液的制备,书写检验,记录单,分离纯化,无菌落或无特征菌落,配培养基和稀释液,革兰染色、镜检→,氧化酶试验,绿脓菌素试验,生化试验 硝酸盐还原试验,,42℃,生长试验,明胶液化试验,,★,铜绿假单胞菌检查流程图,,SCDLP,培养基,,十六烷三甲基溴化铵琼脂,36±1℃,18~24h,36±1℃,18~24h,,特征菌落,,灰白色、扁平、周围有水溶性

17、蓝绿色素,37,十六烷三甲基溴化铵平板,SCDLP,培养基,黄绿色菌膜,灰白色湿润,氧化酶试验,粉红,/,紫红色,38,绿脓菌素试验,盐酸层呈粉紫色氯仿层呈蓝绿色,硝酸盐还原产气试验,N,2,明胶液化试验,明胶培养基（高层）,明胶液化,39,四、控制菌检查,－铜绿假单胞菌检查,★,铜绿假单胞菌检查结果报告,,,被检样品经增菌分离培养后，经证实为革兰氏阴性杆菌，氧化酶及绿脓菌素试验皆为阳性者，即可报告被检样品中检出铜绿假单胞菌；如绿脓菌素试验阴性而液化明胶、硝酸盐还原产气和,42℃,生长试验三者皆为阳性时，仍可报告被检样品中检出铜绿假单胞菌。,40,四、控制菌检查,－,金黄色葡萄球菌检查,★,金

18、黄色葡萄球菌,,金黄色葡萄球菌为,革兰氏阳性球菌,，呈葡萄状排列，无芽胞，无荚膜，能,分解甘露醇,，,血浆凝固酶阳性,。,41,四、控制菌检查,－金黄色葡萄球菌检查,★,金黄色葡萄球菌检查意义,,,金黄色葡萄球菌在外界分布较广，抵抗力也较强，能引起人体局部化脏性病灶，严重时可导致败血症，因此化妆品中检验金黄色葡萄球菌有重要意义。,42,四、控制菌检查,－金黄色葡萄球菌检查,革兰染色、镜检→,生化试验,:,血浆凝固酶试验,甘露醇发酵试验,最终结果判断,增菌培养,供试品的处理,书写检验,记录单,分离纯化,无菌落或无特征菌落,配培养基和稀释液,36±1℃,36±1℃,,SCDLP,培养基或,7.5%

19、NaCl,肉汤,24,±2,h,,Baird Parker’s,或血琼脂,24~48h,,特征菌落,,灰黑色、边缘有浑浊带、周围有透明带,★,金黄色葡萄球菌检查流程图,43,Baird Parker’s,平板,灰,/,黑色,甘露醇发酵试验,血浆凝固酶试验,血浆凝块,液态血浆,44,四、控制菌检查,－金黄色葡萄球菌检查,★,金黄色葡萄球菌检查结果报告,,凡在上述选择平板上有可疑菌落生长，经染色镜检，证明为革兰氏阳性葡萄球菌，并能发酵甘露醇产酸，血浆凝固酶试验阳性者，可报告被检样品检出金黄色葡萄球菌。,45,,谢谢观看,/,欢迎下载,BY FAITH I MEAN A VISION OF GOOD

20、 ONE CHERISHES AND THE ENTHUSIASM THAT PUSHES ONE TO SEEK ITS FULFILLMENT REGARDLESS OF OBSTACLES. BY FAITH I BY FAITH,内容总结,第八章化妆品的微生物学检查。细菌菌落总数不得大于1000CFU/mL 或1000CFU/g。亲水性半固体（膏、霜、乳剂）样品。三、细菌、真菌总数检查。36℃±1℃。28℃±2℃。1.尽量使菌细胞分散开，使每个菌细胞生成一个菌落，否则将会导致重大的技术误差。由于防腐剂未被中和，往往使平板计数结果受影响，如低稀释时菌落少。（1）当只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，即以该平皿菌落数乘其稀释倍数。（6）若所有的稀释度均无菌生长，报告数为每g 或每mL 小于10CFU。(CFU/mL或CFU/g)。(CFU/mL 或CFU/g)。（2）阳性对照试验：供试品+阳性对照菌，应检出相应的阳性对照菌。（3）供试品控制菌检查：依相应的检查方法进行。四、控制菌检查－检查流程。使被检药物中的被检菌增殖，避免出现漏检。经增殖培养后,被检菌大量繁殖，同时其他一些杂菌也出现增殖。因此分离培养能使目的菌从混合菌中分离出来。生化试验:血浆凝固酶试验,