发酵工艺控制

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1、单击此处编辑母版标题样式,,单击此处编辑母版文本样式,,第二级,,第三级,,第四级,,第五级,,,*,第九章,,发 酵 工 艺 控 制,,第一节,,温度对发酵的影响及其控制,,一、 发酵热,------,发酵过程中释放出的净热量。,[ J / m,3,· h ],,,或,,,------,单位体积的发酵液在单位时间内释放出来的净热量。,,,,Q,发酵,= Q,生物,,+ Q,搅拌,,- Q,蒸发,,- Q,显,,– Q,辐射,,,1,、生物热 （,Q,生物,）,◇,产生菌在生长繁殖过程中本身会产生大量的热，此为生物热。,◇,,这种热的主要来源是培养基中的碳水化合物、脂肪和蛋白质等的分解。,◇,

2、,释放出的能量部分用来合成高能化合物,(ATP),,部分用来合成产物，其余的则以热的形式散发出来,,影响生物热的因素：,,,菌株特性 培养基成分和浓度 发酵时期,◇,菌株对营养物质利用的速率越大，培养基成分越丰富，生物热也就越大。,,◇,发酵旺盛期的生物热大于其它时间的生物热 （四环素,20-50,小时； 苏云金杆菌,10-18,小时）,,2,、搅拌热 （,Q,搅拌,）,,搅拌带动发酵液作机械运动，造成液体之间、液体和设备之间的摩擦，产生数量可观的热。,,搅拌热与搅拌轴功率有关，可用下式计算：,,,,Q = P ×860 ×4186.8 (J / h),,,P ---,搅拌轴功率

3、，,kW,,860×4186.8 ---,机械能转变为热能的热功当量，,J /kW.h,影响因素：,,搅拌器的类型及搅拌速度,,3,、蒸发热 （,Q,蒸发,),空气进入发酵罐后，就和发酵液广泛接触进行热交换，同时必然会引起水分的蒸发，蒸发所需的热量即为蒸发热。,4,、显热 （,Q,显,）,排出气体所带的热,,5,、辐射热 （,Q,辐射,）,◇,因,罐,内外的温度不同，发酵液中有部分热通过罐体向外辐射。,,,◇,辐射热的大小决定于罐内外的温差,,1,）菌种特性,,2,）培养基 （成分及配比）,,3,）发酵阶段,,4,）搅拌类型及搅拌速度,,5,）通气速度 （影响,Q,蒸发和,Q,显）,,6,）

4、罐内外的温差,影响发酵温度的因素：,,由于,Q,生物、,Q,蒸发、,Q,显在发酵过程中随时间而变化，因此发酵热在整个发酵过程中也随时间变化。为了使发酵在一定温度下进行，必须采取措施加以控制。,,二、发酵热的测定,方法一：,,,通过测定一定时间内冷却水的流量和冷却水的进出口温度，由下式求得这段时间内的发酵热：,,,,Q,发酵,= GC (t,2,- t,1,) / V (J / m,3,· h),,G ---,冷却水流量，,kg/h,,C ---,水的,比热，,J/kg · ℃,,t,1,、,t,2,---,进、出口的冷却水温度，℃,,,V ----,发酵液体积 ，,m,3,,方法二：

5、,,,通过罐温的自动控制，先使罐温达到恒定，再关闭自动控制装置测得温度随时间上升的速率,S,,按下式可求得发酵热 ：,,,,Q,发酵,,= K · S,S ---,温度随时间上升的速率，,℃,/h,,K ---,总参数，代表系统的热容量，,J/L·℃,,K,值可由下式,求得：,,,,K = (,MCp,),发酵液,,+ (,MCp,),容器,,+ (,MCp,),附件,M —,以每升发酵液计的发酵液、容器、附件的重量,,Cp —,代表各自的比热,一般微生物发酵过程中的最大发酵热约为,,,4.186× (3000,～,8000) kJ / m,3,· h,,三、温度与发酵的关系,1

6、,、温度对微生物生长的影响,,◇,嗜,冷菌在,温度低于,20℃,下生长速率最大,,嗜中温菌在,30-35℃,左右生长速率最大,,嗜热菌在,50℃,以上生长速率最大,◇,曲线形状相似；当温度增加,10℃,，生长速率大致增长一倍。,,,◇,当温度超过最适生长温度，生长速率随温度增加而迅速下降,,,微生物产物的生成与微生物的生长一样受温度的影响，但适于生长和适于产物合成的温度不一定相同；必须分别考察，在考虑培养温度时需要采用折中的办法。,,温度也会影响微生物培养的其它重要方面，如细胞得率系数等。,当温度超过一定数值，细胞得率降低。主要原因是生命活动维持方面的需求增加,,2,、温度对发酵的影响,●,,

7、温度对发酵的影响是各种因素综合表现的结果,,从酶动力学来看，温度升高，反应速率加大，代谢加快，生产期提前；但因酶本身很易因热而失去活性，温度越高，酶的失活也越快，表现在菌体易于衰老，发酵周期缩短，影响产物的最终产量。,1,）,温度影响产物合成的速率及产量,●,,温度除了直接影响发酵过程中各种反应速率外，还通过改变发酵液的物理性质，间接影响菌的生物合成。,,2,）温度可能会影响终产物的质量,,,例如：,,苏云金杆菌的发酵，一般在,30-31℃,进行，这样形成的晶体毒力强。若发酵温度提高到,37℃,以上，虽然菌体生长繁殖较快，最终含菌数也较高，但生物毒力较低，直接影响产品的质量。,3,）温度还可能

8、影响生物合成的方向,,,例如：,,四环素发酵中金色链霉菌同时能产生金霉素。在低于,30℃,下，该菌合成金霉素能力较强；温度提高，合成四环素的比例提高；在温度达到,35℃,时，则只产生四环素，金霉素的合成停止,,四、最适温度的选择,◇,,最,适,温度是指在该温度下最适于菌的生长或产物的形成。,◇,,在发酵的整个周期内仅选一个温度不一定好。,,因为最适合菌生长的温度不一定适合产物的合成。,,例如：,,,青霉素产生菌的最适生长温度是,30℃,，而最适于青霉素合成的温度是,20℃,。,,,发酵过程中，在生长初期抗生素还未开始合成，菌丝还未长浓，这时的温度应适于微生物的生长；到抗生素分泌期，菌丝已长到一

9、定浓度，积累抗生素是重点考虑，此时应满足生物合成的最适温度。,,温度的选择还要参考其它发酵条件灵活掌握,,●,,通气条件,,,在通气条件差的情况下，最适的发酵温度应比在正常良好通气条件下低一些；这是由于在较低的温度下，氧溶解度相应大些，菌的生长速率相应小些，从而弥补可能因通气不足而造成的代谢异常。,,●,,培养基成分和浓度,,,在使用较稀薄或较易利用的培养基时，提高培养温度则养料往往过早耗竭，导致菌丝过早自溶，使抗生素产量降低。,,利用计算机模拟确定最佳发酵条件，正逐步得到推广应用。,,,●,根据模拟计算机对发酵温度最佳点的计算，得到青霉素发酵的最适温度是：,,起初,5h,维持在,30℃,；,

10、随后降到,25℃,，,培养,35h,；,再降到,20℃,培养,85h,；,最后回升到,25℃,培养,40h,放,罐。,,●,,采用这种变温培养，比在,25℃,恒温培养青霉素产量提高,15%,。,,五、温度的控制,方法：,,,罐壁调温,,夹层调温,,罐内调温,,,,第二节,,pH,对发酵的影响及其控制,,一、,pH,对菌体生长和产物合成的影响,1,）,pH,影响酶的活性,,,,当,pH,抑制菌体中某些酶的活性时，使菌体的新陈代谢受阻,2,）,pH,影响微生物细胞膜所带电荷的状态，从而改变细胞膜的渗透性，影响微生物对营养物质的吸收及代谢产物的排泄，因此影响代谢的正常进行。,,4,）,pH,不同，往

11、往引起菌体代谢过程的不同，使代谢产物的质量和比例发生改变。,3,）影响培养基某些组分和中间产物的离解，从而影响微生物对这些物质的利用。,●,例如：黑曲霉在,pH2-3,时，发酵产生柠檬酸，在,pH,接近中性时，则产生草酸。,,●,又如：丙酮丁醇发酵中，发酵后期,pH,为,4.3-5.3,时积累丙酮丁醇，,pH,升高则丙酮丁醇产量减少，而丁酸、乙酸含量增加。,,二、发酵过程中,pH,的变化及影响,pH,变化的因素,1,、发酵过程中,pH,的变化,1,）生长阶段,,,,,pH,有,上升或下降趋势（相对于接种后起始,pH,而言）,,,如：,利福霉素,B,发酵起始,pH,为,中性，但生长初期由于菌体产

12、生的蛋白酶水解蛋白胨而生成铵离子，使,pH,上升至碱性；接着，随着铵离子的利用及葡萄糖利用过程中产生的有机酸使,pH,下降到酸性范围。,,2,）生产阶段,,在生产阶段，,pH,趋于稳定，维持在最适,,产物合成的范围,3,）自溶阶段,,,,菌丝自溶阶段，随着基质的耗尽，菌体蛋白酶的活,,跃，培养液中氨基氮增加，致使,pH,上升，此时菌,,丝趋于自溶而代谢活动终止。,,2,、引起发酵液中,pH,变化的因素,◇,发酵过程中,pH,的,变化取决于微生物的种类、培养基的组成和发酵条件。,,,◇,在菌体代谢过程中，菌体本身有建成其生长最适,pH,的,能力，但外界条件发生较大变化时，,pH,将会不断波动。,

13、,引起,pH,下降的因素：,,,（凡是导致酸性物质生成或释放及碱性物质消耗的发酵，其,pH,都会下降）,1,）培养基中碳氮比例不当，碳源过多，特别是葡萄糖过量，或者中间补糖过多加之溶解氧不足，致使有机酸大量积累而,pH,下降。,2,）消泡油加得过多,3,）生理酸性物质的存在，氨被利用，,pH,下降,,引起,pH,上升的因素：,,,（凡是导致碱性物质生成或释放及酸性物质消耗的发酵，其,pH,都会下降）,1,）培养基中碳氮比例不当，氮源过多，氨基氮释放，使,pH,上升。,2,）生理碱性物质存在,3,）中间补料中氨水或尿素等碱性物质的加入过多使,pH,上升。,,三、最适,pH,的选择,1,、微生物生

14、长和产物合成的最适,pH,,●,大多数细菌生长的最适,pH6.3,～,7.5,,●,霉菌最适生长,pH3,～,6,●,放线菌生长最适,,,pH7,～,8,,,,,微生物生长阶段和产物合成阶段的最适,pH,往往不同，这不仅与菌种特性有关，也取决于产物的化学性质。,例如：,,一般产生碱性抗生素的，如灰色链霉菌生产链霉素、红色链霉菌产生红霉素，其合成产物的最适,pH,为,6.8-7.3,，中性偏碱；而产生两性抗生素的，如金色链霉菌生产金霉素，其合成产物的最适,pH,为,5.9-6.3,,弱酸性。,,2,、最适,pH,的选择,◇,,,选择合适,pH,值的准则是有利于菌的生长和产物的合成，以获得较高的产

15、量,◇,,生长期和生产期的,pH,不一定相同,,例如利福霉素,B,发酵的最佳,pH,方案,是：生长期,pH,保持在,6.5,，生产期,pH,为,7.0,。,,四、,pH,的控制,1,、在基础培养基配方中考虑到维持,pH,的需要,,,例如加入,CaCO,3,，,使用缓冲液等,2,、通过补加酸、碱来调节控制,3,、通过中间补料来控制,,,例如可以根据生产菌的代谢需要用改变加糖速率来控制,pH,,也可通过中间补加尿素或硫酸铵等调节,,第三节,,基质浓度对发酵的影响及其控制,,一、基质浓度对发酵的影响,1,、,,对生长的影响,,可用,Monod,方程来描述基质浓度与生长速率的关系,, = ,max

16、,S,,Ks + S,,---,比生长速率,,,max,---,最大比生长速率,,S ---,基质浓度,,K,s,---,饱和常数,,（,= 0.5,max,时的基质浓度）,,●,,S,＞＞,Ks,，,,趋向于,max,,,●,,然而，由于代谢产物或基质浓度过浓可能会导,,致抑制作用，出现比生长速率下降,,,●,当浓度超过某值，还可能导致细胞脱水,,2,、 对产物形成的影响,●,基,质,浓度对产物形成的影响类似于生长,,●,在一定范围内，基质浓度大，通常产物产量高,,●,过浓，使菌体生长过于旺盛，发酵液非常粘稠，,,传质状况差，对产物的合成不利,例如：,,,以乙醇为碳源发酵谷氨

17、酸，当乙醇浓度达,35g/L,，,可延长谷氨酸生产时间，提高产量；但在更高浓度下，菌体生长受到抑制，产量降低,,二、 基,质,浓度的控制,——,补料控制,,为解除基质过浓的抑制、产物的反馈抑制和葡萄糖效应，以及避免在分批发酵中因一次性投糖（料）过多造成细胞大量生长，耗氧过多而供氧不足的状况，通常采用中间补料工艺。,,补料的,方式：,,,,1,）于预定时间一次性补料或间歇补料,,,2,）连续恒速补料,,,3,）变速补料（指数流加,）,,,为有效地进行中间补料，须选择恰当的反馈控制参数；掌握这些参数与微生物生长、基质利用和产物形成之间的关系。,,反馈控制操作分,直接法,和,间接法,1,）直接法：,

18、◇,,直接以限制性营养物质浓度作为反馈控制参数,,,例如碳源、氮源、碳氮比,◇,,由于缺乏直接测量重要参数的传感器，该法的使用受到,,一定限制。,,,目前只有少数基质，如甲醇、乙醇、葡萄糖等可直接测量,,2,）间接法,,,,以溶氧、呼吸商、代谢物浓度等作为反馈控制参数,,第四节,,溶氧浓度对发酵的影响及控制,,一、溶氧测定的意义,1,、溶氧作为发酵中氧是否足够的度量，了解菌对氧利用的规律。,2,、溶氧作为发酵异常情况的指示,,,溶氧一反往常，在较短的时间内跌到零附近，且跌零后长时间不回升，这很可能说明污染了好气菌,,,,如发酵过程中溶氧迅速回升，发酵液变稀，则很可能是污染了噬菌体,3,、溶

19、氧作为发酵中间控制的手段之一,,补糖后，溶氧出现明显下降的趋势,,,因此可利用溶氧作为参数来控制加料的次数、流加速度和加入量,4,、溶氧作为考查设备、工艺条件对氧供需与产物形成影响的指标之一,,二、适当溶解氧的选择,◆,在好氧微生物反应中，一般取,[DO],＞,[DO],cri,,以,保证反应的正常进行,。,临界氧浓度是不影响菌的呼吸所允许的最低氧浓度。,◆,,氧的满足度,——,实际溶解氧浓度与临界氧浓度之比。,,合适溶解氧选择的原则：,,如果要使菌体快速生长繁殖（如发酵前期），则应达到临界氧浓度；如果要促进产物的合成，则应根据生产的目的不同，使溶解氧控制在最适浓度（不同的满足度）,例如：

20、,,黄色短杆菌可生产多种氨基酸 ，但要求的氧浓度可能不同,,,对谷氨酸和天门冬氨酸的生产，当溶解氧浓度低于临界氧浓度时，氨基酸产量下降，也就是说要求氧的满足度,= 1,,但对于苯丙氨酸、缬氨酸和亮氨酸的生产，则在低于临界氧浓度时获得最大生产能力，它们的最佳氧浓度分别为临界氧浓度的,0.55,、,0.66,、,0.85,。,,三、发酵液中溶解氧的控制,,培养液中溶解氧浓度的任何变化都是供需平衡的结果，因此调节发酵液中溶氧量不外乎从供、需两方面考虑、着手,,G/, =,K,L,a,· V · (C* - C,L,),G ---,溶解于液体中的氧量，,mmol,, ---,气,-,液接触时

21、间，,h,,V ---,培养液的体积，,L,,C,L,,---,液相中氧的浓度，,mmol,/L,,C* ---,与气相中氧分压相平衡的液相中的氧饱和浓度，,mmol,/L,,K,L,---,以浓度差表示推动力的传质系数（氧传质系数），,m/h,,a---,比表面积（即单位体积的液体中所含的气,-,液接触面积），,m,2,/m,3,,,1,、供氧方面,1,）增加空气中氧的含量，使氧分压增加，进行富氧通气,,富氧,空气制备：,,深冷分离法 （可得,99.9%),,,吸附分离法 （吸去,N,2,和,CO,2,),,,膜分离法 （有机物高分子膜；,30%,）,,成本高，易爆炸 ；但关键时期使用

22、也是明智的,2,）提高罐压,,但同时会增加,CO,2,的溶解度（比氧气高,30,倍），影响,pH,、,可能会影响菌的代谢。,,,一般,0.3,～,1,kg /cm,2,3,）改变通气速率,4,）增加搅拌速度,,2,、需,氧,方面,,rO,2,=Q,O2,·X,1,）调整养料的浓度,2,）调节控制温度,Note,：,溶氧浓度必须与其它参数配合起来分析,,第五节,,泡沫对发酵的影响及控制,,一、泡沫对发酵的影响,1,）降低了发酵罐的装液系数,,2,）增加了菌群的非均一性,,3,）增加了污染杂菌的机会,,4,）导致产物的损失,,二、起泡机理,,当气体通入纯水的气,-,液界面时，气泡只能维持几分

23、之一秒，其稳定性等于零，这是由于能学上的不稳定性和围绕气泡的液膜强度很低所致。,,,,当气体通入起泡剂液体，因这些物质具有某些亲水基团和疏水基团，分子带极性的一端向着水溶液，而非极性一端向着空气，并力图在表面作定向排列，增加了泡沫的机械强度。,,,培养基中蛋白质以及微生物菌体等为起泡物质，具有稳定泡沫的作用,,,培养基的成分、温度、酸碱度、浓度及泡沫的表面积对泡沫的稳定性都有一定影响,,三、泡沫的消长规律及影响因素,1,、消长规律,◇,发酵过程中泡沫的消长表现出一定的规律,,,◇,但不同微生物的不同发酵通常不同,,2,、影响泡沫的因素,1,）与通气量、通气速度和搅拌速度等有关,2,）与所

24、用培养基的成分有关,玉米浆、蛋白胨、花生饼粉、黄豆饼粉、酵母粉、糖蜜是主要的发泡因素；且起泡能力随品种、产地、贮藏和加工条件而不同。,3,）与培养基的灭菌方法、灭菌温度和时间有关,例如：,糖蜜培养基从,110℃,升高到,130℃,（皆为,30,分钟），发泡系数增加一倍,,四、泡沫的控制,一） 机械消泡,内部：耙式、梳齿式、涡轮式,,外部：离心式、碟片式,优点：,,不需引入外界物质（如消泡剂），可减少培养液性质复杂化程度，便于产物的提取。,,缺点：,,不能从根本上消除引起稳定泡沫的因素,,二） 化学消泡,1,、消泡机理,1,）降低泡沫的机械强度，使泡沫破裂,2,）降低液膜的表面黏度，使液膜的液体

25、流失，导致泡沫破裂,当泡沫表层存在着由极性的表面活性物质形成的双电层时，可以加入另一种具有相反电荷的表面活性剂，以降低泡沫的机械强度；或加入某些具有强极性的物质与发泡剂争夺膜上的空间，降低液膜强度，使泡沫破裂。,当泡沫的液膜具有较大的表面黏度时，可以加入某些分子内聚力较小的物质，以降低液膜黏度,,2,、消泡剂选择的原则：,① 对发酵过程无毒，对人、畜无害，不影响生物合成。,,② 消泡作用迅速，效果高和持久性能好。,,③ 能耐高压蒸汽灭菌而不变性，在灭菌温度下对设备无腐蚀性或不形成腐蚀性产物。,,④ 不影响以后的提炼过程。,,⑤ 不干扰分析系统，如溶解氧、,pH,测定仪的探头。,,⑥ 消泡剂的来

26、源多，价格低，添加装置简单。,,⑦ 最好还能做到不影响氧的传递。,,1,）天然油脂,3,、消泡剂的种类,常用豆油、玉米油、米糠油,（能兼作碳源）,2,）聚醚类,3),高级醇类,主要是十八醇,4,）硅酮类,,主要是聚二甲基硅氧烷及其衍生物,,,结构通式为,:,(,CH,3,),3,Si[,Si,(CH,3,),2,],nSi,(CH,3,),3,,,,单独使用效果差，常与分散剂（微晶二氧化硅）一起使用,,3,、消泡剂的使用,1,）分散,◇,消沫剂的消沫效果与使用方式很有关系。,,◇,消沫剂加到发酵罐中能否起作用取决于它的扩散能力。,,◇,消沫剂的分散可借助于机械方法，也可加入某种分散剂将消

27、沫剂乳化成细小液滴。,2,）加量,,聚醚类,0.03,～,0.035%,3),加入时机,有的可先加入培养基；有的则在泡沫初起或大起时加入,,第六节,,杂菌与噬菌体的防治,,,◇,纯种发酵（单菌或混菌）；菌种以外的微生物都被视为杂菌。,,,◇,所谓染菌，是指在发酵培养基中侵入了有碍生产的其它微生物。,,,◇,几乎所有的发酵工业都有可能遭遇杂菌或噬菌体的污染。染菌的结果，轻者影响产量或质量，重者可能导致倒罐，甚至停产，造成原料、人力和设备动力的浪费。,,防止杂菌和噬菌体污染是保证发酵正常进行的关键之一,,一、杂菌污染的原因与防治,,1,、 从染菌的现象分析染菌的原因,,,1,）从染菌的时间分析,●

28、,早期（如接种后,12,h,或,24,h,），,除了种子带菌外，主要是培养基或设备灭菌不彻底。,,●,相反，中、后期染菌则可能与中间补料、设备渗漏以及操作不合理等有关，也可能是空气过滤器不严所致。,2,）从污染的杂菌类型分析,●,污染耐热的芽孢杆菌，多数是因培养基灭菌不彻底或设备存在死角所致；,,●,污染无芽孢杆菌、球菌等不耐热菌，可能是从蒸汽的冷凝水中带来的，或空气系统不严造成。,3,）从发酵罐及批次分析,大批发酵罐染菌是指整个工厂各个产品的发酵罐都出现杂菌现象，而且染的是同一种菌，主要是空气过滤器除菌不净，空气带菌而造成的。,个别发酵罐连续染菌，较多地是由于设备问题而造成的。如阀门的渗漏或

29、罐体破损，特别是蛇形管的穿孔，有时不易察觉。有时设备破损引起的染菌会出现每批染菌时间前移现象。,个别发酵罐偶然染菌的原因最为复杂，各种染菌途径都有可能引起。,,,根据谷氨酸发酵情况分析，染菌原因以设备问题（设备渗漏、管道不严、设备死角）和空气问题（过滤器不严、过滤器失效、过滤器受潮）为主，种子（二级种子染菌）次之，而培养基消毒不透的情况较少。,,2,、 防止染菌要点,（,1,）空气系统,提高空压机进口空气的洁净度、防止空气带油、水及过滤器失效。,,如提高空压机吸气口位置并加强压缩前的过滤；防止空气冷却器漏水而进入空气系统；在空气过滤器灭菌时要防止冲翻介质而短路，防止烤焦介质或着火；装填纤维介质

30、时要压紧；操作中要防止空气的压力剧变和流速激增等。,,,（,2,）设备,●,发酵罐及其附属设备应注意严密和防止泄漏，避免形成“死角”。与物料、空气、下水道连接的阀门皆需保证严密度。,,,●,,用超净工作台及净化室代替无菌室，以提高无菌程度。,,,●,,连消设备的连消塔要简单，易拆装清理，操作时蒸汽能与物料均匀混合，并易控温度；维持罐在料液输送时培养基在罐中能均匀地缓慢上升，不走短路。,,（,3,）工艺操作,,① 空罐准备,,,,放罐后应进行全面检查和清洗。要清理罐内残渣，去除罐壁污垢，清除空气分布管、温度计套管等处堆积的污垢及罐内的“死角”。要防止端面轴封漏气、搅拌添料箱及阀门渗漏等。蛇管和夹

31、层要按设计规定的压力定期试压。空消时应先将罐内空气排尽，保持蒸汽畅通，阀门、管道均要彻底灭菌。,② 实罐灭菌,,,,配制培养基时要防止原料结块。配料罐出口应有筛板过滤器（筛孔直径≤,0.5mm,），,以防块状物及异物进入罐内。灭菌时，要保证各路进气畅通及罐内料液翻腾激烈，控制好温度与压力，严防泡沫冒顶及料液倒流到空气系统中。,,,③ 连消,,,,料液进入连消塔前需先预热。灭菌过程中，料液温度及其在维持罐停留的时间都必须符合要求，确保灭菌彻底。当冷却管开放冷水时，防止因突然冷却造成负压而吸入外界空气。为确保灭菌温度稳定，连消必须实现自动控制。,,④ 补料,,,,补入发酵罐内的料液一定要保证无菌。

32、,⑤ 种子,,,,有关种子操作的制度要严格遵守；摇瓶瓶塞要确保严密。,,⑥ 无菌试验,,,,无菌试验要严格取样操作，力求减少误差。应同时用肉汤和双碟作对照，以便迅速作出判断。当发现染菌时，要通过分辨菌型来探索菌源，并对杂菌做耐热试验考察。如果怀疑种子罐染菌，则种子不能轻率进发酵罐。,,,3,、 无菌检查与染菌的处理,,为了防止在种子培养或发酵过程中污染杂菌，在接种前后、种子培养及发酵过程中分别进行无菌检查，以便及时发现染菌，并在染菌后及时进行必要处理是很重要的。,,（,1,）无菌检查,,◆,,染菌通常通过,3,个途径发现：无菌试验、发酵液直接镜检、发酵液的生化分析。其中无菌试验是判断染菌的主要

33、依据。,,,,◆,,无菌试验方法有双碟培养、斜面培养、肉汤培养等，其中以双碟和肉汤培养为主。,,（,2,）染菌的判断,,◆,以肉汤和双碟培养的反应为主，镜检为辅。,,,◆,每,8h,一次的无菌检查，至少用,2,只酚红肉汤及,1,只双碟同时取样。,,,◆,无菌试验时，如果肉汤连续,3,次变色（红→黄）或产生浑浊，或双碟培养连续,3,次有杂菌菌落，即判断为染菌。,,,（,3,）染菌率的统计,,,以发酵罐染菌批（次）为基准，染菌罐批（次）应包括染菌重消的重复染菌批（次）在内。整个发酵周期中，无论前期或后期染菌，均作“染菌”论处。,发酵（罐）染菌批（次）,,,总投罐批（次）,染菌率（,%,）,=,,

34、,100%,,,（,4,）染菌的处理,,,发现染菌后，应立即根据染菌的种类及产生菌的菌龄等具体情况分别进行处理。除据染菌时间及危害程度对污染罐进行挽救或处理外，对有关设备也应进行处理。,◆,发酵中后期染菌或前期染菌轻微而发现较晚时，可加入适当的杀菌剂或抗生素；或把高单位的后期发酵液压一部分到染菌罐中，抑制杂菌生长速度；或者降低罐温，减缓杂菌繁殖速度。,◆,种子罐染菌后，种子不能再接入发酵罐中，这时可用备用种子接种。如无备用种子，则可选一适当培养龄的发酵罐培养物作种子，即生产上所说的“倒种”。,◆,发酵罐前期染菌后，如培养基中,C,、,N,含量尚高，则可重新灭菌，接种后再运转；若染的杂菌危害性较

35、大，则放掉部分料液，补入新料液，重新灭菌、接种。,,二、噬菌体污染的防治,,在国内外，发酵工业中噬菌体的危害是一个普遍的问题。对于丙酮丁醇、氨基酸、酶制剂和抗生素等发酵都有噬菌体的危害，所带来的经济损失是相当惊人的。,,1,、噬菌体的污染源,,◆,噬菌体广泛地存在于适合宿主生存的泥土、污水和空气中；,,,◆,发酵工业生产菌的噬菌体可以从异常发酵液和工厂环境中分离出来，溶源性细菌也混杂在工厂周围环境的细菌中；,,,◆,一个新的发酵工厂往往在投产不久便会出现噬菌体污染；,,,◆,研究认为，当有许多细菌存在时，相应的噬菌体就会马上出现，其浓度在自然条件下很容易增高。,,,◆,,工厂本身的排放物有时也

36、给重复污染提供了噬菌体来源。生产过程中发酵气体排出，可以带有大量的生产菌。,,,,◆,在生产罐污染有少量噬菌体（尚可进行生产）时，噬菌体也被排到环境中，造成恶性循环。,,,,◆,废弃的发酵液处理不当可以成为难以对付的污染源。,,2,、 噬菌体污染与发酵异常,,,噬菌体污染后的情况因发酵工业的种类、污染的噬菌体特性、污染时间、感染复度（即培养物内的噬菌体与细菌的比率）、培养基成分、发酵罐内的物理和化学条件不同而异。即使同样的噬菌体并不一定引起同样的异常发酵情况。,,一般来说，噬菌体污染引起的异常发酵有以下表现：,,,（,1,）污染较轻，或在发酵末期污染，则使发酵过程减慢或降低发酵产率。也有的行业

37、在这种情况下产率反而增高；,,,,（,2,）在细菌对数生长期污染，而且污染量大，就会造成细菌溶解，发酵终止。,,,噬菌体污染后可以观察到糖消耗减慢，,pH,异常变化，产气减少，发酵稀薄，继之活的生产菌减少。通过测定可过滤性、传染性、宿主特异性、溶菌斑形成能力和电镜观察来鉴别异常发酵中的噬菌体。,,,3,、噬菌体污染的防治,,发酵工业生产中噬菌体污染是一个复杂的问题，虽然至今还没有完全满意地解决这一问题，但采取一些措施来防治噬菌体的污染，也有一定的成效。,（,1,）防止噬菌体入侵和蔓延,,发酵工厂生产菌的噬菌体广泛存在于其周围环境中，为了防止噬菌体的污染，保持周围环境的清洁是必要的，所有设备和设

38、施如发酵罐、管道系统等要进行灭菌处理。,,妥善地保藏菌种、对原料和水进行无菌处理、对工厂空气、种子、发酵液、泥土和污水的噬菌体浓度进行日常检查，即使空气中噬菌体浓度极低时，也要进行检测。,,,喷洒氯化物或杀藻胺,(,benzalkonium,chloride),气溶胶能杀灭活噬菌体，紫外线照射用作一种额外的保护措施。漂白粉,(0.2%),、阳离子表面活性剂（如季铵盐,0.01%,,0.1%,）和福尔马林（,1%,）均可单独使用，如果必要也可联合使用。,,（,2,）选用抗噬菌体突变株,抗噬菌体突变株应具备以下特征：,,,1,）对以前出现过的噬菌体都具有抗性；,,2,）为非溶源菌；,,3,）具有

39、与原始菌株相当或更高的生产能力；,,4,）没有回复突变成噬菌体敏感株的能力。,,对付噬菌体污染的一个措施就是分离抗正在污染的噬菌体的细菌突变株，用于发酵生产上。,,（,3,）使用抑制噬菌体复制的化学药物,,药物必须具有以下性质：,,,① 选择性抑制噬菌体而不影响宿主菌生长或发酵过程；,,② 在食品发酵工业上要求该化学物质不影响产品质量；,,③ 用量要小，要经济。,,◆,,有些噬菌体感染需要双价阳离子,(Ca,2+,、,Mg,2+,),吸附或,DNA,注射才能进行。使用络合剂可获得较好的效果，如,0.2-0.3%,多磷酸钠、,0.1-0.2%,肌醇六磷酸,(,phytic,acid),、,0.2

40、-0.5%,柠檬酸或草酸等可抑制乳糖发酵短杆菌的噬菌体。,◆,,非离子去污剂如聚乙烯二醇酯酸、聚羟乙烯烷基醚、吐温,20,、吐温,60,均能明显地抑制噬菌体吸附、复制，或引起流行性感染。,◆,,有些抗生素能抑制多种噬菌体，氯霉素（,1,,g/ml,）,对丙酮丁醇乳酸棒杆菌的,HM,噬菌体有良好的抑制作用，对宿主菌无影响。,,第 七 节,,发 酵 终 点 的 判 断,,不同类型的发酵，要达到的目标不同，因而发酵终点的判断标准也不同,,1,） 一般对发酵及原材料成本占整个生产成本主要部分,,的发酵产品，主要追求提高：,,,产率 （,kg / m,3,·h),,,得率 （,Kg,产物,/ kg,基

41、,质）,,发酵系数 （,kg,产物,/,罐容积,m,3,·,发酵周期,h,）,2,）如下游提取、精制占主要部分，则除了要求高的,产率,和,,发酵系数,外，还要求高的,产物浓度,。,,t,T,—,培养放罐、检修的工作时间,,t,D,,—,打料、灭菌时间,,t,L,,—,停滞期,分批培养的生产率,,发酵总的生产周期：,,,,t = 1/,μ,m,lnX,f,/X,0,+,t,T,+,t,L,+,t,D,t,T,—,培养放罐、检修的工作时间,,t,D,,—,打料、灭菌时间,,t,L,,—,停滞期,,X,0,和,X,f,——,起始和终了时的细胞浓度；,,μ,m,——,最大比生长速率,,◆,,如要提高总的生产率则有必要缩短发酵周期,。,,,就是要在产物合成速率较低时放罐，延长发酵虽然略能提高产物浓度，但生产率下降，且消耗每千瓦电力，每吨冷却水所得产量也下跌，成本提高。,◆,,放罐时间对下游工序有很大影响,,放罐时间过早，会残留过多的养分，如糖、脂肪、可溶性蛋白等，对提取不利，这些物质能增加乳化作用或干扰树脂的交换；,,放罐时间太晚，菌丝自溶，不仅会延长过滤时间还会使一些不稳定的抗生素单位下跌，扰乱提取工段的作业计划。,,