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1、,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第十四章,基因重组与基因工程,基因重组,：,genomic,recombination,重组,DNA,：recombinant DNA,第一节、自然界的基因重组,转化：,transformation,整合：,integration,转导：,transduction,转位：,transposition,转化,转化,：由外来,DNA,引起生物类型改变的过程称为转化。,细菌的转化,转化,病毒癌基因感染宿主细胞后，可整合到宿主染色体上，从而使宿主细胞癌变。,转染：,噬菌体感染宿主菌后，核酸进入菌体内的过程。,细胞
2、的转化,整合,整合：,噬菌体感染大肠杆菌的第一步,噬菌体粘附于细胞壁上，将自身的,DNA,注入菌体中。此,DNA,可,与细菌染色体重组，成为细菌染色体的一部分。,溶原菌：,整合了噬菌体基因组的细菌。,裂解：,噬菌体感染大肠杆菌的第二步,DNA,利用菌体的酶系统，复制自身及外壳蛋白，组装成大量新 噬菌体，并将细菌涨破。,整合,溶原,和,裂解,可以相互转变。,转导,溶原菌中,DNA,可以原样地切离出来，也可以,把邻近的宿主,DNA,在切离时带走一部分。后者称,转导,。,带有宿主,DNA,的噬菌体称,转导噬菌体,。,来源于宿主的基因称,转导基因,。,转位,转位,：一个或一组基因从一处转到基因组的另一
3、个位置。,这些游动的基因称为,转位子(,transposon,),。,转位,第二节、基因工程,基因工程,：是用分离纯化或人工合成的,DNA,在体外与载体,DNA,结合，成为重组,DNA，,用以转化宿主，筛选出能表达重组,DNA,的活细胞，加以纯化、传代、扩增，成为,克隆,。也叫,基因克隆,或,重组,DNA,技术,。,分子水平上操作，细胞水平上表达。,赋予重组,DNA,以新的生命力。,基因工程,肿瘤细胞的转移与细胞表面的糖链类型有关，而后者又与糖基转移酶的表达相关。,已经证实,GnT,-,与转移有关。,转入,GnT,-,基因,肝癌细胞株,SMMC7721,观察其迁移、侵袭、粘附等生物学行为,转入
4、反义,GnT,-,基因,转移,转移,基因克隆,分,切,接,转,筛,载体和目的基因,载体,：,vector,在宿主细胞内可独立复制的完整,DNA,分子。但必须利用宿主的酶系统，才能有进一步的基因表达能力。,常用的载体有：质粒、,噬菌体、,M13,噬菌体 逆转录病毒,DNA、,昆虫病毒,DNA,载体与宿主共培育可大量生成，经纯化后可用于基因工程。,质粒,质粒,：,plasmid,环形双链,DNA，,大小约为数千碱基对，存在于大多数细菌的胞质中。,拷贝数,：每个细菌能容纳的质粒数目。,质粒的性质：,易于从一个细菌转移入另一个细菌。,有两三个抗药性基因。,有一个限制性内切酶切口。,质粒,pBR322：
5、,常用的质粒,噬菌体载体,噬菌体、,M13,噬菌体,易于感染大肠杆菌,噬菌体,DNA,比质粒大，对限制性内切酶有不止一个切口，需经过改造。,一个切口：插入型载体。,二个切口：置换型载体。,噬菌体载体,目的基因的来源,直接从染色体,DNA,中分离：原核生物,人工合成：简单的多肽,从,mRNA,合成,cDNA,：,真核生物,基因文库：,(,gene library）,G,文库：用基因组的全部,DNA,制备。,c,文库：用细胞的全部,mRNA,制备出全套,cDNA,后建库。,从,mRNA,合成,cDNA,限制性内切酶的应用,限制性内切酶可辨认46个核苷酸：回文结构,回文结构,：,palindrome
6、 DNA,双链具有方向相反顺序一致的结构。,平端：,blunt end,在同一水平上切断两条链。(钝型末端),粘性末端：,sticky end,碱基序列被酶以错开几个核苷酸的形式切开。,限制性内切酶的应用,Alu,I .AGCT.AG CT.,平端,.,TCGA.TC GA.,BamH,I GGATCC .G GATTC,粘性,.,CCTAGG,CCTAAG,G,末端,限制性内切酶的应用,切载体,切目的基因,限制性内切酶,相同粘性末端,两者相连,要点：避免切断目的基因,载体和目的基因的连接,人工连接器,：,linker,人工合成的寡核苷酸，安置有限制性内切酶的识别序列。,DNA,连接酶,：可用
7、于连接碱基互补的二段核酸链。,连接方式：,粘端连接方式,尾接法,粘端连接,尾接法,重组体的转化,基因的转移：重组体进入宿主细胞的过程，已开发了很多方法。,化学法：,CaCl,2,转移法、碱金属离子转移法,物理法：显微注射法、基因枪法、电穿孔法,生物学法：逆转录病毒载体、腺病毒载体,重组体的转化,转化：重组载体导入宿主后，利用宿主的酶系统表达的过程。即改变宿主性状的过程。,基因工程的表达体系的发展,DNA,重组体的筛选与鉴定,根据重组载体的表型进行筛选：如质粒的抗药性、营养素的依赖型,DNA,限制酶切图谱分析：提取经粗选后的宿主,DNA，,用限制性内切酶切割后与原来载体比较。,利用核酸杂交和放射
8、自显影进行鉴定：用目的基因作探针监测宿主,DNA,是否重组体。,DNA,重组体的筛选与鉴定,灭活法筛选重组体。,提取转化细胞,DNA,限制性内切酶,琼脂糖凝胶电泳,与原来载体及重组体比较,DNA,重组体的筛选与鉴定,DNA,重组体的筛选与鉴定,菌落,硝酸纤维素滤膜,探针,X,线底片,显影,平板,基因工程策略,第三节、基因工程的应用,生命科学研究趋势,基因诊断和基因治疗,基因工程产品的开发和应用,生命科学研究趋势,基因的结构与功能研究,基因表达的调控,各种生物大分子之间的识别及结合,了解生命的奥秘,基因诊断和基因治疗,基因工程产品的开发和应用,基因工程疫苗：安全廉价 乙肝疫苗、甲肝疫苗 巨细胞病毒、流行性出血热、轮状病毒、,基因工程生产激素类：胰岛素、生长激素,细胞因子：生长因子、肿瘤坏死因子、造血因子、干扰素,第五节、聚合酶链反应,聚合酶链反应：,PCR,polymerase,chain reaction,耐热细菌：,DNA,聚合酶能耐高温，在7080有很高的催化力。,原理：以目的,DNA,为模板，快速合成大量的,DNA，,用于检测、制备、研究。,第五节、聚合酶链反应,变性：,95、15,s,引物粘合：,55、30,s,引物延伸：,72、1.5,m,
基因重组与基因工程课件
