柠檬酸发酵机制

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1、单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,柠檬酸发酵机制,重点：,柠檬酸生物合成途径；柠檬酸生物合成的代谢调节机制。,难点：,柠檬酸生物合成的代谢调节机制。,1,一、柠檬酸简介,柠檬酸又名枸橼酸，学名,-,羟基丙烷三羧酸，是生物体主要代谢产物之一。化学名称,2-,羟基丙三羧酸，英文文献俗名,citric acid,，分子式,C,6,H,8,O,7,。无色或白色晶体，无臭，味极酸，易溶于水和乙醇、微溶于乙醚、水溶液呈酸性反应。,第一节 概述,2,食品工业：,酸味剂

2、、增溶剂、抗氧化剂，除腥脱臭剂；,医药工业：,化学工业：,美容品、化妆品,二、柠檬酸及其盐的应用概况,3,三、我国柠檬酸生产现状,生产状况：,60,年代开始，生产柠檬酸年总产量居世界第一，出口量一直占国内总产量的,50%,以上。目前，生产厂家近百家，万吨级以上的有,6,家。主要有,安徽丰原生物化学集团公司,（生产能力为,12.0,万吨,/,年）、,江苏无锡罗氏中亚柠檬酸有限公司,（生产能力为,4.0,万吨,/,年）、,安徽华源生物药业有限公司,（生产能力为,3.5,万吨,/,年）等。,存在问题：,出口量增长过快，技术创新相对滞后，加上国际市场竞争激烈，已出现严重的供大于求的局面，设备利用率不到

3、,60%,，行业经济效益呈滑坡态势。,4,5,第二节 柠檬酸合成途径与代谢调控,1940,年，,Krebs:TCA,；,1953,年，,Jagnnathan,证实黑曲霉中存在,EMP,途径所有酶；,1954,年，,Shu,提出葡萄糖,80%,经,EMP,途径代谢；,1954-1955,年，,Ramakrishman,等发现黑曲霉中存在,TCA,循环。,一、柠檬酸合成途径的发现,6,二、黑曲霉柠檬酸生物合成途径,7,黑曲霉利用糖类发酵生成柠檬酸其生物合成途径是，葡萄糖经,EMP,、,HMP,途径降解生成丙酮酸，丙酮酸一方面氧化脱羧生成乙酰,CoA,，另一方面经,CO,2,固定化反应生成草酰乙酸，

4、草酰乙酸与乙酰,CoA,缩合生成柠檬酸。,(1),生长期与产酸期都存在,EMP,与,HMP,途径，前者,EMP:HMP=2:1,，后者,EMP:HMP=4,：,1,(2),黑曲霉柠檬酸产生菌中存在,TCA,循环与乙醛酸循环，在以糖质原料发酵时，当柠檬酸积累时，,TCA,和乙醛酸循环被,阻断或减弱,。,(3),由于,TCA,和乙醛酸循环被阻断或减弱，,草酰乙酸,是由丙酮酸（,PYR,）或磷酸烯醇式丙酮酸（,PEP,）羧化生成的。即由两个,CO,2,固定化反应体系，其中以丙酮酸羧化酶作用下固定化,CO,2,生成草酰乙酸为主。,8,三、柠檬酸生物合成的代谢调节机制,9,1,、磷酸果糖激酶（,PFK,

5、）：,（一）糖酵解及丙酮酸代谢的调节,Mn,2+,浓度对磷酸果糖激酶的影响,Mn,2+,缺乏为何会使,NH,4,+,浓度升高呢,？,当培养基中,Mn,2+,缺乏时，微生物体内积累几种氨基酸（,GA,、,GLu,、,Arg,、,Oin,等），这些氨基酸的积累，意味着体内蛋白质的合成受阻，而外源蛋白质的分解速度则不受到影响，这样,NH,4,+,的消耗下降，,NH,4,+,浓度就会升高。,10,2,、丙酮酸羧化酶：,催化生成草酰乙酸。,3,、丙酮酸脱氢酶：,催化生成乙酰,CoA,11,（二）三羧酸循环的调节,1,、柠檬酸合成酶的调节：,柠檬酸合成酶是,TCA,循环第一个酶。但黑曲霉中柠檬酸合成酶没有

6、调节作用。,2,、顺乌头酸水合酶、异柠檬酸脱氢酶的调节：,顺乌头酸水合酶、,NAD,和,NADP-,异柠檬酸脱氢酶,在柠檬酸产生与不产生时，这,3,种酶均存在，而当铜离子,0.3mg/L,，铁离子,2mg/L,和,pH2.0,情况下，这,3,种酶均不出现活力，发酵中柠檬酸正是在这个,pH,条件下积累的。,顺乌头酸水合酶,是催化柠檬酸,顺乌头酸,异柠檬酸正逆反应的酶，研究表明，黑曲霉中有一种单纯的位于线粒体上的顺乌头酸水合酶，它在催化时能建立下面的平衡：柠檬酸,:,顺乌头酸,:,异柠檬酸,90:3:7,。,12,3,、,-,酮戊二酸脱氢酶的调节,在黑曲霉柠檬酸产生菌中，,TCA,循环的一个显著特

7、点是，,-,酮戊二酸脱氢酶的合成受葡萄糖和铵离子的阻遏。因此当以葡萄糖为碳源时，在柠檬酸生成期，菌体内不存在,-,酮戊二酸脱氢酶或活力很低。,-,酮戊二酸脱氢酶催化的反应是,TCA,循环中唯一不可逆反应，一旦,-,酮戊二酸脱氢酶丧失，就会引起：,TCA,循环中的苹果酸、富马酸、琥珀酸是由草酰乙酸逆,TCA,循环生成，使,TCA,循环成,“,马蹄形,”,。,-,酮戊二酸又抑制异柠檬酸脱氢酶的活性。,13,(,三,),氧对柠檬酸积累的调节,乙酰,CoA,和草酰乙酸结合生成柠檬酸过程中要引进一个氧原子，因此氧也可以看作为柠檬酸生物合成底物。它对柠檬酸发酵的作用为：,(1),氧是发酵过程生成的,NAD

8、H2,重新氧化的氢受体。,(2),近来的研究发现，黑曲霉中除了具有一条标准呼吸链以外，还有一条侧系呼吸链。,当缺氧时，只要很短时间中断供氧，就会导致此侧系呼吸链的不可逆失活，而导致柠檬酸产酸急剧下降。,14,（四）乙醛酸循环与醋酸发酵柠檬酸,乙醇,乙酸,3,醋酸,1,柠檬酸,生成的柠檬酸一半转化为异柠檬酸,酵母,N,源耗尽后开始烷烃发酵，低浓度,AMP,抑制,NAD-,异柠檬酸脱氢酶的活性，柠檬酸大量合成并积累。此时顺乌头酸水合酶催化反应平衡为：柠檬酸：异柠檬酸：顺乌头酸,=90,：,7,：,3,。细胞质中积累大量异柠檬酸。,15,Mn,2+,缺乏抑制蛋白合成,NH,4,+,，有一条呼吸活动强

9、的不产生,ATP,的侧呼吸链：,解除磷酸果糖激酶的代谢调节,，,促进,EMP,途径畅通。,丙酮酸羧化酶是组成型酶，不被调节控制。丙酮酸氧化脱羧生成乙酰,CoA,和,CO,2,的固定两个反应的平衡，以及柠檬酸合成酶不被调节，增强了合成柠檬酸的能力。,小结：,顺乌头酸水合酶在催化时建立了以下平衡：,柠檬酸：顺乌头酸：异柠檬酸,=90,：,3,：,7,同时控制,Fe,2+,含量时，顺乌头酸酶活力降低，使柠檬酸积累。,随着柠檬酸积累，,pH,降低到一定程度时，使顺乌头酸酶和异柠檬酸脱氢酶失活，更有利于柠檬酸的积累。,16,（五）柠檬酸发酵的产率,1,、无,CO,2,固定反应的产率,合成,1,分子柠檬酸

10、需要,3,分子乙酰辅酶,A,，也就是需要,1.5,分子的葡萄糖。,理论产率为：,192/(1801.5)=71.1%,17,2,、通过,CO,2,固定反应提供,C,4,二羧酸,18,四、柠檬酸发酵过程的控制要点,（,1,）控制,Mn,2+,、,NH,4,+,浓度，解除柠檬酸对,PFK,的抑制，使,EMP,畅通无阻。,（,3,）控制培养基中的,Fe,2+,的浓度，使顺乌头酸水合酶失活。,（,2,）控制溶氧，防止侧系呼吸链失活。,19,五、柠檬酸产生菌育种的传统方法：,1.,透明圈大的菌株,平板：,10%,甘薯,+2%,的琼脂,+0.5%CaCO,3,诱变后，涂布，透明圈大的则好,2.,显色圈大小

11、,平板：麦汁培养基,+pH,值指示剂 诱变后，,33,培养,3,天，透明圈大的则好。,20,3.,不分解柠檬酸的菌株,不利用柠檬酸为碳源的菌株，说明其,TCA,循环中柠檬酸后续酶的活性较低，或者丧失，这有利于积累柠檬酸。方法：以柠檬酸为唯一碳源的培养基上生长不好的突变株。,4.,选育不长孢子、少长孢子、迟长孢子的菌株,在培养基中如果菌株能够大量合成积累柠檬酸，自然会使,TCA,循环中的中间产物浓度降低，这样不利于孢子的形成。,（为何？中间产物少，,C,架少，不利于合成代谢,）,21,思考题,1.,柠檬酸发酵过程中有哪几个控制要点，如何控制？,2.,说明柠檬酸发酵过程中氧的重要性。,3.,简述二氧化碳固定反应对提高柠檬酸产率的意义。,22,