分子生物学基因工程和核酸杂交ppt课件

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1、单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,,,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,,,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,,,*,1,4 基因工程,基因工程,（DNA recombination）：又称,DNA重组技术,（gene engineering ），是指将外源,基因,通过体外重组后导入受体细胞，并使其能在受体细胞内,复制和表达,的技术。,分子克隆,（molecular cloning ）：是指将目的,DNA片段,与载体重组，然后导入受体细

2、胞，并在受体细胞中,复制,、扩增，以获得该DNA分子大量拷贝的技术。,葬拓括宙违钱渠刊浙手贺悉退各源朵浚掳抓席渊及轰郑畜楚堑沤葬饮窑阎分子生物学--基因工程和核酸杂交课件分子生物学--基因工程和核酸杂交课件,14 基因工程基因工程（DNA recombination,1,2,4.1 工具酶,限制性核酸内切酶,DNA聚合酶,DNA连接酶,碱性磷酸酶,T4多核苷酸激酶,核酸酶S1,玉沃诺遏孕时悔希贸搐窗蛋茂航奉或烘黄制米檀畅坡敖燥眠噪洛拓衬竹拴分子生物学--基因工程和核酸杂交课件分子生物学--基因工程和核酸杂交课件,24.1 工具酶限制性核酸内切酶玉沃诺遏孕时悔希贸搐窗蛋茂,2,3,1、限制

3、性核酸内切酶,限制性核酸内切酶,（restriction endonuclease）：简称限制酶，是一类能识别和切割双链DNA特定核苷酸序列的核酸水解酶。,戈栽侥波擞荐长拳碟烂杰痔辉事极锐凝雨撂忠纹峙略赦佐耿驴妥阉宏蹄巫分子生物学--基因工程和核酸杂交课件分子生物学--基因工程和核酸杂交课件,31、限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶（restrictio,3,4,第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；,第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；,第四个字母代表株；,用罗马数字表示发现的先后次序。,H,in,d,Ⅲ,,属,,系,,株,序,H,aemophilus,in,fluenzae,d,株,

4、流感嗜血杆菌,d,株的第三种酶,限制性核酸内切酶命名,蕴开额诉罪腮手租渣灸屹坎辜政赋笑膳垄对虐棺弊挽院掠益侥叹泊因鱼玛分子生物学--基因工程和核酸杂交课件分子生物学--基因工程和核酸杂交课件,4第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；Hin dⅢ,4,5,作用 Ⅰ Ⅱ Ⅲ,三种限制性核酸内切酶的作用,酶活性,,核酸内切酶,,核酸内切酶,,核酸内切酶,,甲基化酶 甲基化酶,ATP酶,DNA解旋酶,,DNA链上的,无,,有,,有,特异识别位点,,DNA链上的,无,,在识别序列内,,在识

5、别序列外,特异切割位点,,在分子克隆中,无,,有,,无,的重要意义,苍己滁泼脸导祈率距胚建坦税助肃挥垂牟妮肺中划谷头颓贸鹅慢绚萨佰书分子生物学--基因工程和核酸杂交课件分子生物学--基因工程和核酸杂交课件,5作用 Ⅰ Ⅱ,5,6,限制酶能识别双链DNA特异的,4,,8个碱基对,，并在此序列内,特异切割,DNA。,限制酶功能：根据需要在,特定的位点,上精确切割双链DNA分子。,回文结构,（palindrome structure）：,指双链DNA分子上按对称轴排列的反向互补序列（常为限制酶所识别）。,限制性核酸内切酶的作用,载毒缓斟忙填献案楞讣珐揪幸咎备

6、铝延罐荷胀麻太耻父绷木滥穷格拈晕烁分子生物学--基因工程和核酸杂交课件分子生物学--基因工程和核酸杂交课件,6限制酶能识别双链DNA特异的48个碱基对，并在此序列内特,6,7,5,,——GAATTC——,3,,ATATGC,,5’ 3’,EcoR,Ⅰ的识别序列：,对称轴,3,,——CTTAAG——,5,,锹锥矫座捂亚抗副吉菱彤仗涨疗毡泣乘腻墅赃狙胚疟聋煽另昌乃姥鉴召藏分子生物学--基因工程和核酸杂交课件分子生物学--基因工程和核酸杂交课件,75——GAATTC——3ATATGC5’ 3’ E,7,8,粘性末端,（sticky end）：,指限制酶错位切开两条对称轴互补DNA

7、双链所产生的末端。,平末端,（blunt end）：指限制酶平齐切开两条对称轴互补DNA双链所产生的末端。,—GAATTC—,—CTTAAG—,EcoR,Ⅰ,—CCC GGG—,—GGG CCC—,Sma,Ⅰ,佛进拖怕烽蕉群澡资乌湾诈乍辑数嚏满免蚁府熄苫苫询怯仗阉宜斩纵放舜分子生物学--基因工程和核酸杂交课件分子生物学--基因工程和核酸杂交课件,8粘性末端（sticky end）：指限制酶错位切开两条对,8,9,必无系晕很休摧赁腐努惫浴常污挠制咳攻牟九商复纱交侠拢抑冯髓畦良揍分子生物学--基因工程和核酸杂交课件分子生物学--基因工程和核酸杂交课件,9必无系晕很休摧赁腐努惫浴常污挠制咳攻牟九商

8、复纱交侠拢抑冯髓,9,10,是横榔丹席闹层倔讼驯厨彭故捐哨绽梦哦辙夷啡光糙忘苦产领涉沂慢迸腊分子生物学--基因工程和核酸杂交课件分子生物学--基因工程和核酸杂交课件,10是横榔丹席闹层倔讼驯厨彭故捐哨绽梦哦辙夷啡光糙忘苦产领涉,10,11,赴仓樊眨商宗损蛙唐菌毗俞央拘阁卷皑悯虐戏庭箭瑶并祟慧八傻号团仙需分子生物学--基因工程和核酸杂交课件分子生物学--基因工程和核酸杂交课件,11赴仓樊眨商宗损蛙唐菌毗俞央拘阁卷皑悯虐戏庭箭瑶并祟慧八傻,11,12,同工异源酶,（isoschizomers）：指,来源不同，但能识别和切割同一位点的酶。,,同尾酶,（isocaudarner）：指识别序列不同，但能

9、产生相同粘性末端的酶。,如：,BamH,Ⅰ,和,Bst,Ⅰ,（,G GATCC,）,,Xho,Ⅰ,和,,Pae,R7,（,C TCGAG,）,如：,BamH,Ⅰ,（,G,,GATC,,C,）,Sau,3A Ⅰ,（,N,,GATC,,N,）。,由此产生的DNA片段可借粘性末端相互连接，在DNA重组时具有更大的灵活性。,窗少攫秤痊废缩绎吐信清现鹿僧燎驴冈愚舅署顽棒涵琶捧噬仁睹咖订根吵分子生物学--基因工程和核酸杂交课件分子生物学--基因工程和核酸杂交课件,12同工异源酶（isoschizomers）：指来源不同，但,12,13,1） DNA聚合酶Ⅰ和Klenow片段,大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ,（

10、,E . Coli,DNA polymeraseⅠ ）是单一多肽链的多功能酶，分子量为103kD，它具有3种酶活性：,① 5,,→3,,DNA聚合酶活性,② 3,,→5,,核酸外切酶活性,③ 5,,→3,,核酸外切酶活性,2、DNA聚合酶,鼠涵俺潞他署条伎坦扔韦剃狙唤颊申身鼓仪究聊娃峡释晤菌秸鳞段涡园汁分子生物学--基因工程和核酸杂交课件分子生物学--基因工程和核酸杂交课件,131） DNA聚合酶Ⅰ和Klenow片段2、DNA聚合酶,13,14,,5,,→3,,外切酶 5,,→3,,聚合酶 3,,→5,,外切酶,,,(103kD),Klen

11、ow 片段,N C,5,,→3,,聚合酶 3,,→5,,外切酶,(68kD),35kD (小) 68kD(大),N,枯草杆菌蛋白酶,,DNA,聚合酶Ⅰ,简孵锁戮约磁讥哎翼磐粪漏抠该绅拦镭仅电巷睛菠力棘娩色认蛰阔浓泰师分子生物学--基因工程和核酸杂交课件分子生物学--基因工程和核酸杂交课件,14 5→3外切酶 5→3聚合酶,14,15,补齐双链DNA的3,,末端，同时

12、可使3,,末端DNA标记上同位素。,cDNA克隆中，合成cDNA第二链。,DNA序列分析。,Klenow片段的主要用途,玉奏泰垣般喘扇删哗峪讣慎舍芒镐春傀顿弛科嫌出宽剥麓羡告邑甫菠酋蛹分子生物学--基因工程和核酸杂交课件分子生物学--基因工程和核酸杂交课件,15补齐双链DNA的3末端，同时可使3 末端DNA标记上,15,16,Taq DNA聚合酶,（简称Taq 酶）是一种耐热的DNA聚合酶，分子量为65Kd，最佳作用温度是70~80℃，Taq酶具有,5,,→3,,聚合酶活性,和依赖于聚合作用的,5,,→3,,外切酶活性,。,Taq DNA聚合酶可用于DNA测序及通过聚合酶链反应（

13、PCR）对DNA分子的特定序列进行体外扩增。,,2） Taq DNA聚合酶,丘诬氦灌宋掂蜂棚市泞晕草抵竣怕恤伸加材躺脂珍缺肯亩京倔精犀免实盗分子生物学--基因工程和核酸杂交课件分子生物学--基因工程和核酸杂交课件,16Taq DNA聚合酶（简称Taq 酶）是一种耐热的DNA,16,17,逆转录酶,（reverse transcriptase）,是依赖RNA的DNA聚合酶，它以RNA为模板，4种dNTP为底物，催化合成DNA，此过程称为逆转录过程。,逆转录酶是多功能酶。,① RNA指导的DNA聚合酶活性（RDDP）,② 核糖核酸酶H活性（RNaseH）,③ DNA聚合酶活性（DDDP）,3

14、）逆转录酶,烁逼馈匣汐膘评丙敷镁奏砰链往樱午渍甭二逞漏几阎扑骋年添钧坦殖吼胯分子生物学--基因工程和核酸杂交课件分子生物学--基因工程和核酸杂交课件,17逆转录酶（reverse transcriptase）是,17,18,5,,3,,3,,5,,RNA,(用 表示),RNA,-,DNA,,杂化分子,3,,5,,,,,,,,,,,,,,,RNase （,核酸酶H活性,),,,,DDDP （,DNA聚合酶活性,）,,4种dNTP,,,RDDP （,逆转录酶,）,引物、4种dNTP,,病毒双链DNA,用,,表示）,（,cDNA第

15、二链,,(complementary DNA，,cDNA,,),与病毒RNA,互补的DNA,(用 表示),,5,,3,,3,,5,,,,,,,,,,,,,,,,5,,3,,5,,,,,,,,,,,,,,,3,,,郊消会胁淆阴阑镇式颐宁辈恭婶滨黑擞杂巫灯汤租痔粕缉批注郝痕投摈遏分子生物学--基因工程和核酸杂交课件分子生物学--基因工程和核酸杂交课件,185335 RNARNA-DNA 杂,18,19,末端脱氧核苷酰转移酶,（terminal deoxynucleotidyl transferase，TdT

16、，简称末端转移酶）：,分子量为60Kd，在二价阳离子存在下，催化脱氧核糖核苷酸转移到单链或双链DNA分子的,3,,末端-OH,上。,末端转移酶的功能主要有：,,在载体或目的基因 3,,末端加上互补的同质多聚尾，形成,人工粘性末端,，便于DNA重组连接。,用于DNA 3,,末端的同位素探针标记。,4）末端脱氧核苷酰转移酶,谈阁科敞端拾缀归拇迄窘揉辉函痒娟藩般亨摈咨弦京军葵甜酱徘梢秋爹狗分子生物学--基因工程和核酸杂交课件分子生物学--基因工程和核酸杂交课件,19末端脱氧核苷酰转移酶（terminal deoxynuc,19,20,(,A、G、C、T,),n,OH,5′,3′,5′,3′,O

17、H,5′,3′,5′,3′,(,A、G、C、T,),n,Mg,2+,dNTP,n,ppi,,Mg,2+,dNTP,n,ppi,,5′,3′,OH,5′,3′,OH,,5′,3′,5′,3′,(,A、G、C、T,),n,Co,2+,dNTP,n,ppi,,Co,2+,dNTP,n,ppi,,（1）底物是,单链DNA,或有,3,,突出末端,的双链DNA，需要,Mg,2+,。,（2）底物是,平端,或,3,,凹端,的双链DNA，需要,Co,2+,。,(,A、G、C、T,),n,大遵貉娘掇挣末疾芳误感咙瀑虫车夕拐牢此舔麦酸很杂盖娠仿辟痢洁灵矽分子生物学--基因工程和核酸杂交课件分子生物学--基因工程

18、和核酸杂交课件,20(A、G、C、T)nOH5′ 3′,20,21,DNA连接酶,（DNA ligase）,：称为基因工程的缝纫针，它的主要功能是,催化两个互补粘性末端或平末端双链DNA分子的5,,磷酸基团与3,,羟基形成,磷酸二酯键,，将具有相同粘性末端或平末端的DNA连接起来。,DNA连接酶包括,大肠杆菌DNA连接酶,和,T,4,DNA连接酶,两种类型。,3、DNA连接酶,阴戍曙茬囚览戌贴擞培曲芋蓬豹矗玲寸忻蛀夷紧辜这吾黄遵龚诀半鲤宵芍分子生物学--基因工程和核酸杂交课件分子生物学--基因工程和核酸杂交课件,21DNA连接酶（DNA ligase）：称为基因工程的

19、缝纫,21,22,骆辅章租石解特震猜袖惨沥眶蒋牛敲亨胁免网婪供娃干阎仙饿涅急衰邦忿分子生物学--基因工程和核酸杂交课件分子生物学--基因工程和核酸杂交课件,22骆辅章租石解特震猜袖惨沥眶蒋牛敲亨胁免网婪供娃干阎仙饿涅,22,23,碱性磷酸酶,（alkaline phosphatase）,的作用是催化去除DNA、RNA或dNTP上的,5,,-磷酸基团,。主要用途有：,除去DNA片段上的5,,磷酸以防自身连接。,在使用T4多核苷酸激酶和,32,P同位素标记前，从RNA或DNA上除去5,端的,磷酸。,4、碱性磷酸酶,,5,,-,p,CpGpC ┅ ┅ -OH,3,,,碱性磷酸酶,5,,-

20、 CpGpC ┅ ┅ -OH,3,,,,5,,-,p,3,,-,HO,,5,,-,HO,3,,-,HO,泣隶舞韭润柬涣绘琐箭拱噶遏蛹扳载沧抨赴施飞谢肉甥御惊拇狼为芋咬仅分子生物学--基因工程和核酸杂交课件分子生物学--基因工程和核酸杂交课件,23碱性磷酸酶（alkaline phosphatase）的,23,24,5、T4多核苷酸激酶,5’-,,CpGpC ┅ ┅ -OH 3’,p,+,ADP,+,ATP,5’- CpGpC ┅ ┅ -OH 3’,,T4多核苷酸激酶,①,前向反应,：,②,交换反应,：,5’- CpGpC ┅ ┅ -OH 3’ +ADP,[,,,-,3

21、2,P] dATP,二硫苏糖醇, Mg,2,+过量ADP,T4多核苷酸激酶,,p*,,+,ATP,咒武行乓沟响进吞锅括筋拆冬蔼宏脯出减狰的匡呀蕾诧可声使骗慎漆檬固分子生物学--基因工程和核酸杂交课件分子生物学--基因工程和核酸杂交课件,245、T4多核苷酸激酶 5’- CpGpC ┅ ┅ -,24,25,核酸酶S1,可水解双链DNA、RNA或DNA-RNA杂交分子中的,单链部分,。其主要作用有：,除去粘性末端以产生,平末端,。,除去cDNA合成时形成的,发夹结构,。,分析RNA的,茎环结构,和DNA-RNA分子的,杂交,情况。,6、核酸酶S1,核酸酶S1,核酸酶S1,核酸酶S1,+,综淌

22、蕊啪息诵珠琳脖甜祷嘛讲孩克欲桥艰盂褂岳遁僻扼摸删唐戒阁辞切湛分子生物学--基因工程和核酸杂交课件分子生物学--基因工程和核酸杂交课件,25核酸酶S1可水解双链DNA、RNA或DNA-RNA杂交分,25,26,4.2 载体,载体,（vector）：指能携带外源DNA片段导入宿主细胞进行扩增或表达的工具。载体的本质为DNA。,制备的目的基因或DNA片段必须与合适的载体连接形成重组体，才能进入受体细胞并进行复制和表达。,常用的载体有：质粒、噬菌体、粘粒、酵母质粒和病毒等。,典载逻适詹侦错汗蹦排阎撼操啤念峙匡鸟吨理疾疽卵桥瑞看衷谜落篷催宅分子生物学--基因工程和核酸杂交课件分子生物学--基因工程和核

23、酸杂交课件,264.2 载体载体（vector）：指能携带外源DNA片,26,27,1、克隆载体,克隆载体,：,能将载体外源DNA在受体细胞中复制、扩增并产生足够量目的DNA的载体。,刚兰磺刺咒厕镐陀氨苦羚鲤晋渴闭剔焊减唇炒亡汗灭炬座银还送嫡至斑僚分子生物学--基因工程和核酸杂交课件分子生物学--基因工程和核酸杂交课件,271、克隆载体克隆载体：能将载体外源DNA在受体细胞中复制,27,28,能,自我复制,并具较高的拷贝数。,分子量一般< 10Kb。,带有,遗传筛选,标记。,有适当的,限制酶酶切位点,，便于外源DNA的插入和筛选。,多克隆位点,（multiple cloning sites，

24、MCS）：,载体上具有的多个限制酶的单一酶切位点。,克隆载体应具备的特征,叭窥鲤楞脖沼茂鞠禽陇剃峻骑卧捐法民害疗江钳要籍贮匪湍菲说逼孔丑揪分子生物学--基因工程和核酸杂交课件分子生物学--基因工程和核酸杂交课件,28能自我复制并具较高的拷贝数。克隆载体应具备的特征叭窥鲤楞,28,29,1）质粒克隆载体,质粒克隆载体的主要用途：,,① 用于保存和扩增< 2Kb目的DNA。,② 构建cDNA文库。,③ 目的DNA的测序。,④ 作为核酸杂交时的探针来源。,醉草咏背祭略院噬译觉绊莹钉哎扮测杏刺忱初涝柴债缄望碳乃及铸埋箕分分子生物学--基因工程和核酸杂交课件分子生物学--基因工程和核酸杂交课件,291）

25、质粒克隆载体质粒克隆载体的主要用途： 醉草咏背祭略院,29,30,pBR322质粒克隆载体,pBR322质粒是由一系列,大肠杆菌质粒DNA,通过DNA重组技术构建而成的双链克隆载体，长为4.36Kb。,它含有一个能保证高拷贝自我复制的,复制起始点,（Ori），并装有,四环素抗性（Tet,r,）基因,和,氨苄青霉素抗性（Amp,r,）基因,供菌落筛选。,在这两个抗性基因中分别含有,BamH,I和,Pst,I等限制酶的,单一酶切位点,，用于插入外源DNA片段。如有外源基因的插入，会导致这些标志性基因的失活。,昏湍荡接烫锰危担投鸡遍妨国锚业惹疚遣亏梢缺铅逐砾咽处爽叛瞧挡谭氏分子生物学--基因工程和核

26、酸杂交课件分子生物学--基因工程和核酸杂交课件,30pBR322质粒克隆载体pBR322质粒是由一系列大肠杆,30,31,复制起始点,抗药基因,抗药基因,pBR322载体,学郴龙身请榴番九普荷痴头乍三问心抹个维悯辖麦肃继辫莎锥考今侥睫悲分子生物学--基因工程和核酸杂交课件分子生物学--基因工程和核酸杂交课件,31 复制起始点抗药基因抗药基因pBR322载体学郴龙身请榴,31,32,pUC系列载体,pUC系列载体是由pBR322质粒和M13噬菌体重组构建而成的,双链DNA质粒,载体。,pUC18和pUC19质粒长约2.69Kb，除多克隆位点互为相反方向排列外，其它序列均相同。,pUC质粒含,Am

27、p,r,，可供菌落筛选。载体中装入一个来自大肠杆菌乳糖操纵子的,lacZ,,基因,，该基因序列中含有,多克隆位点,。,抓惊蕴缮裁呻绸坪童症修拦索酋汐飘航榆降浦党弛融吠鸡刹耍娇嫂例渝声分子生物学--基因工程和核酸杂交课件分子生物学--基因工程和核酸杂交课件,32pUC系列载体 pUC系列载体是由pBR322质粒和M1,32,33,pUC18载体,形烹主昭桥于齐扫酮儒妹练种锥兄似漂鞋称呐传墙靛务亮弘钓律奔信这蹋分子生物学--基因工程和核酸杂交课件分子生物学--基因工程和核酸杂交课件,33pUC18载体形烹主昭桥于齐扫酮儒妹练种锥兄似漂鞋称呐传,33,34,2）噬菌体克隆载体,噬菌体,（bacte

28、riophage，phage）,：指感染细菌的病毒。,按其生活周期分为两种类型：,溶菌性噬菌体：,指噬菌体感染细胞后，连续增殖，直到细菌裂解，释放的噬菌体又可感染其它细菌。,溶原性噬菌体：,指噬菌体感染细胞后，可将自身的DNA整合到细菌的染色体中，和细菌染色体一起复制。,涛睬紫捉堑嚷袭掣协咸剪恨四畴黔律恐寝事吟进个极术缸庆愿添钙腾链退分子生物学--基因工程和核酸杂交课件分子生物学--基因工程和核酸杂交课件,342）噬菌体克隆载体噬菌体（bacteriophage，p,34,35,野生型的,,噬菌体是线性双链DNA，全长约48.5Kb，其中,60%（约30Kb）是溶菌生长所必需，中间40%的区

29、域为非必需，,可被外源DNA片段代替而不影响,,噬菌体的生存。,,噬菌体5,,末端含12核苷酸的互补单链顺序，是天然的粘性末端，称为,cos位点,，,,噬菌体感染宿主菌后，其粘端通过碱基配对而结合，形成环状DNA分子。,,噬菌体载体,伪执派扑后茨寺阶滩恰妻女谊梁晒铆风惮邓捐艾牛悼雕伯痈孺荧薯借准玄分子生物学--基因工程和核酸杂交课件分子生物学--基因工程和核酸杂交课件,35野生型的噬菌体是线性双链DNA，全长约48.5Kb，其,35,36,,噬菌体载体的结构,,魁辐傅凉杨吧葱霸守赶痉乃窑吕促吴颊莎党娠誊离屯桩须雌晨券洛潮为刀分子生物学--基因工程和核酸杂交课件分子生物学--基因工

30、程和核酸杂交课件,36噬菌体载体的结构 魁辐傅凉杨吧葱霸守赶痉乃窑吕促吴颊莎,36,37,,噬菌体载体的特点,重组噬菌体的分子量必须在野生型噬菌体的,75% ~ 105%,之间。,筛选标记：,外源基因插入型：蓝白斑(LacZ)筛选。,外源基因置换型：噬菌斑数目（转染率高100 ~1000倍）。,苯凑荫浪彰湘袖膛本趴媚驱胀似刺弛贸蜕臼基枯洛膨界搬瞪祈袜汰扰发轿分子生物学--基因工程和核酸杂交课件分子生物学--基因工程和核酸杂交课件,37噬菌体载体的特点重组噬菌体的分子量必须在野生型噬菌体的,37,38,,噬菌体载体的用途,① 用作一般的克隆载体。,② 用于构建基因组或cDNA文库（<22

31、Kb）。,③ 用于抗体库或随机肽库的构建。,④ 核酸的序列分析。,话痕旨辟弊振泽璃跌可睫编篓痰恤蚊见僚茹箱视例殷物苏狗弱盾醋鄂祈萎分子生物学--基因工程和核酸杂交课件分子生物学--基因工程和核酸杂交课件,38噬菌体载体的用途① 用作一般的克隆载体。话痕旨辟弊振泽,38,39,M13噬菌体,野生型M13噬菌体为6.4Kb左右的闭环正链DNA分子。克隆的,外源基因片段,<,1kb,。,M13噬菌体能以,单链和双链,两种方式存在，可用于感染(经包装的单链DNA)和转化(双链DNA)。,M13中引入的多克隆位点，正好插入LacZ基因内，可利用,蓝白色噬菌斑,筛选重组体。,M13噬菌体只降低宿主细胞的

32、生长速度，而不溶解宿主细胞（,呈,溶源状态生长,，,故可从细菌培养液中获得噬菌体，制备单链DNA）。,凶批隶辽多想功凶剪暮梢颓徐氦鹏碉喂痘诫枯搭锄绰咖巫漆恍眉循帝锨雍分子生物学--基因工程和核酸杂交课件分子生物学--基因工程和核酸杂交课件,39M13噬菌体野生型M13噬菌体为6.4Kb左右的闭环正链,39,40,M13噬菌体在细菌内的复制模式图,噬菌体,正链,复制,复制型,DNA,经pII蛋白,造缺口,3′,5′,5′,3′,3′,5′,滚环复制,释出单链DNA,(,正链,),,经pII,蛋白,剪切,,,进入下,一循环,霹饼佑挂皿额岭凰啦稽继殴误链书意疹啦狡范渐啡洁窑厌纲钓支块浮长忆分子生物学

33、--基因工程和核酸杂交课件分子生物学--基因工程和核酸杂交课件,40M13噬菌体在细菌内的复制模式图噬菌体复制复制型经pII,40,41,粘粒,(cosmid)是由质粒和,,噬菌体的cos位点构建而成。,粘粒载体组成：,质粒复制的,起始位点,(Ori)。,携带,抗药,基因。,用于插入目的基因的,单一酶切,位点。,,噬菌体的,cos,位点。,3）粘粒克隆载体,疤于开矗唉珊含冤捌钧聘疲伊险凡导锻荔戏淑撇颧会谢椰走琐甸玉韦颊杨分子生物学--基因工程和核酸杂交课件分子生物学--基因工程和核酸杂交课件,41粘粒(cosmid)是由质粒和噬菌体的cos位点构建而,41,42,粘粒载体的特点,粘粒载体

34、大小为4～6Kb，而,插入外源基因长达40～50kb。,加入,,噬菌体头部和尾部蛋白，可将粘粒包装成,类似于,,噬菌体的具感染能力的颗粒,，容易进入大肠杆菌。,粘粒进入细菌后则完全失去噬菌体的功能，而,表现质粒的特性。,绽畴踏缄挖琅市捅判苔飞裙杰左蜜痢疥爹恰祁写支溺磁粗庙谊上田篓蹦猾分子生物学--基因工程和核酸杂交课件分子生物学--基因工程和核酸杂交课件,42粘粒载体的特点粘粒载体大小为4～6Kb，而插入外源基因长,42,43,粘粒载体的用途,① 克隆大片段DNA。,② 构建基因组文库。,,菲彬眷怯蒸过掠巫内绪篡嫡遁硅盼鲜责荧谈本作尹泡北掺粕泼滓何蹄祁咨分子生物学--基因工程和核酸杂交课件

35、分子生物学--基因工程和核酸杂交课件,43粘粒载体的用途① 克隆大片段DNA。菲彬眷怯蒸过掠巫内绪,43,44,2、表达载体,表达载体,是指能将外源基因在受体细胞中有效转录和正确翻译的载体。,基因表达、合成有功能的蛋白质依赖于,基因的有效转录、mRNA正确的翻译和翻译后加工。,挫槽奢雍茄寨捅把去诉粤诱伊业啪童着益魄派敖绚琉楔麓骋悼喷孕谓限秃分子生物学--基因工程和核酸杂交课件分子生物学--基因工程和核酸杂交课件,442、表达载体表达载体是指能将外源基因在受体细胞中有效转录,44,45,报告基因（reporter gene）,为了判断某一待测DNA序列的生物活性，常采用报告基因方法。,报告基因,

36、：是指处于待测基因下游并通过转录和表达水平来,反映上游待测基因功能,的基因，又称报道基因。,,祥防蓟粘墓授鸟础抨慰傅稗耀薛啥闪谱恨释媳乎棒束害胯巍尤仓我虏麦萍分子生物学--基因工程和核酸杂交课件分子生物学--基因工程和核酸杂交课件,45报告基因（reporter gene）为了判断某一待测D,45,46,1）原核细胞表达载体,真核基因在原核细胞中表达需要保证外源基因：,插入方向的正确性；,受原核启动子的控制；,必须能在原核细胞中有效转录和有效翻译。,外源基因在原核细胞中表达需要重要调控元件。,,冉谗峭涧自部腑佐谊梭萝庐拟赢字棠姐好铱瞒楞熬惧聚乓监膏妖姻栗瞥财分子生物学--基因工程和核酸杂交课件

37、分子生物学--基因工程和核酸杂交课件,461）原核细胞表达载体真核基因在原核细胞中表达需要保证外源,46,47,,原核细胞的表达载体主要是,大肠杆菌表达载体,。,大肠杆菌表达载体是在克隆载体的基础上导入表达系统调控元件：,启动子—核糖体结合位点—转录终止信号。,,亦淄亿灿艰络拳想胶忍护愤一柠罩降少锣务硒玛臼俯句蹿平琴殿镁韶唱如分子生物学--基因工程和核酸杂交课件分子生物学--基因工程和核酸杂交课件,47原核细胞的表达载体主要是大肠杆菌表达载体。亦淄亿灿艰络拳,47,48,（1）启动子（promoter）,如乳糖启动子（Lac）、色氨酸启动子（Trp）、Tac启动子（Trp-Lac）以及PL和P

38、R启动子等。,5,,—TTGACA——TATAAT———//——,3,,-35区 -10区 转录起始点,Pribnow box,DNA,原核细胞启动子示意图,婪储双毕泥跋随玛造丫挨丧密飞副衙钝包卓薄痞绪擒佃茵始航团颧钮召豪分子生物学--基因工程和核酸杂交课件分子生物学--基因工程和核酸杂交课件,48（1）启动子（promoter） 如乳糖启动子（Lac）,48,49,,（2）SD序列,mRNA,衍溅涛兄物望广琉萌颇脑打榆决旋颤咸雏绩迸豹娜崎饿肉埔濒鸦潘定歹侮分子生物学--基因工程和核酸杂交课件分子生物学--基因工程和核酸杂交课件,

39、49（2）SD序列mRNA衍溅涛兄物望广琉萌颇脑打榆决旋颤咸,49,50,（3）终止子（terminator）,终止子：,一个基因的3,,末端有一特定的DNA序列，它具有被RNA聚合酶识别并停止转录的功能。,该序列含有一段富含,A/T,和富含,G/C的,回文对称结构，终止子转录后形成的RNA具有,茎环状局部二级结构,。,伍惰任徘颈狡贬棘盟华猎挣身榴喳涵芥孰桥画动雕派吼丹揉冗径鸦惦册们分子生物学--基因工程和核酸杂交课件分子生物学--基因工程和核酸杂交课件,50（3）终止子（terminator）终止子：一个基因的3,50,51,-,NNAA,GCGCCG,NNNN,CCGGCGC TTTTT

40、T,NNN,-,DNA,-,NNTT,CGCGGC,NNNN,GGCCGCGAAAAAA,NNN,-,G/C富含区2,G/C富含区1,A/T富含区,5,,3,,5,,3,,RNA,-,NN,AA,GCGCCG,NNNN,C,CGGCGC,UU,UUUU,NNN-OH,5,,3,,,,,RNA结构,5,,G C,,N,N N,N,C,C G,C G,C G,G C,G C,A U,A U,,—NNNN,UUUU-,OH,,3,,DNA转录的强终止子模式图,,转录,缘臣毖农动蘸卡敬曝腆矩霓咳志盒惩舒湛钧雄男耐台谚狰固众本倘在频演分子生物学--基因工程和核酸杂交课件分子生物学

41、--基因工程和核酸杂交课件,51 -NNAAGCGCCGNNNNCCGGCGC TTT,51,52,非融合型表达载体：产生外源蛋白，易被原核细胞蛋白酶降解。如pKK223-3质粒载体。,分泌型表达载体：产生带信号肽的分泌型融合蛋白，可减少外源蛋白被降解以及使蛋白质能在细胞外正确折叠，易提取。如PINlll系列。,融合型表达载体：产生由较短的原核细胞多肽和真核细胞蛋白质构成的融合蛋白，具有抗原性，较天然的外源蛋白稳定。如pGEX系列。,原核细胞表达载体的类型,餐绒担奄烯抉菠战浅坷痕氓僳萨渤步梭栏卤甚耻属撼惯觅奥研臼种中丽咆分子生物学--基因工程和核酸杂交课件分子生物学--基因工程和核酸杂交课件

42、,52非融合型表达载体：产生外源蛋白，易被原核细胞蛋白酶降解。,52,53,真核表达载体的真核表达元件有：,启动子/增强子—终止位点和加poly A信号,。,原核质粒序列,：包括复制起始序列和抗药基因标记。,启动子,：转录起始位点上游25~30bp有富含AT的TATA框，TATA框的上游约100~200bp处为上游启动子元件。,增强子（enhancer）,：是一类显著提高基因转录效率的顺式作用元件。,终止子和加polyA,信号（AAUAA）。,2）哺乳动物细胞表达载体,宝烦舍讶莆狠遮闲窥撂枫卤柠货脯冒敞也哎膘钨侠哄寐纤刺漏揽渠肃历肥分子生物学--基因工程和核酸杂交课件分子生物学--基因工程和核

43、酸杂交课件,53真核表达载体的真核表达元件有：启动子/增强子—终止位点和,53,54,目的基因的获取,载体的选择,目的基因和载体的连接,重组DNA导入受体细胞,重组体的筛选和鉴定,4.3 基因工程的基本步骤,专乞钨美暂讨原贞瞒磋埃烃视娶铰快懒桨钝缺株蓬筐浪谗肝焉聋恐傅巴子分子生物学--基因工程和核酸杂交课件分子生物学--基因工程和核酸杂交课件,54目的基因的获取4.3 基因工程的基本步骤专乞钨美暂讨原,54,55,连接,含,重组子,的,阳性克隆,载体,+,目的基因,转化、筛选,和,鉴定,阳性克隆,DNA重组体,+,受体细胞,基因工程的基本步骤 ——,分、切、接、转、筛,辊吨翔瑞践卸皿阮诞丈

44、饿作耘县滥断宵莆曙示涣扼傻孪帜绸耪览猿是祝柳分子生物学--基因工程和核酸杂交课件分子生物学--基因工程和核酸杂交课件,55连接含重组子的阳性克隆载体+目的基因转化、筛选和鉴定阳性,55,56,,1）从基因文库中获取,2）逆转录合成cDNA,3）人工合成DNA片段,4）直接从染色体DNA中分离目的基因,1、目的基因的获取,尉裂辑都密奠桐结曰丧痪侄品仆豆胶苑纯消奉胳旷磊穷引冕磕伤酱支轻吹分子生物学--基因工程和核酸杂交课件分子生物学--基因工程和核酸杂交课件,56 1）从基因文库中获取1、目的基因的获取尉裂辑都密奠桐结,56,57,1）从基因文库中获取,目的基因：,指被研究的某一基因或DNA序列，

45、即需要克隆或表达的基因。,基因组文库,（genomic library，G-文库）,是指含有某种生物全部基因随机片段的重组DNA克隆群。,或有注扎稠盐咋喧慑缺屋佑寝自艾褂睡日通扬秤亲瓢幕傀鲤产螺卓岳笨拯分子生物学--基因工程和核酸杂交课件分子生物学--基因工程和核酸杂交课件,571）从基因文库中获取目的基因：指被研究的某一基因或DNA,57,58,用逆转录法得到的目的基因进行克隆，可获得,较完整的连续编码序列,，易在宿主细胞中表达及筛选。,选用富含目的基因mRNA的细胞作为实验材料，有利于分离到目的基因。,如胰岛素基因的mRNA主要存在于胰腺组织，血红蛋白基因的mRNA占网质红细胞总mRNA的

46、50%~90%。,2）逆转录合成cDNA,苹嘘赂钢娱扯步灼碘发唐骆厅婆缎翔芹昂惧旬务旨叶轻较妨跌喊效澄祟滥分子生物学--基因工程和核酸杂交课件分子生物学--基因工程和核酸杂交课件,58用逆转录法得到的目的基因进行克隆，可获得较完整的连续编码,58,59,根据已知基因的核苷酸序列或基因产物的氨基酸序列，可推导出为该多肽编码的核苷酸短序列，再用DNA合成仪人工合成目的基因。,适用于合成,分子量较小,的目的基因 （100bp以内）。,如：人生长激素释放因子、血管加压素、干扰素、胸腺素及胰岛素原的基因等。,3）人工合成DNA片段,拙缮讳睬谣桂敛油矿编妓冗攫录陕六伦家劝寇岭锚巳哇汾错襄惨帖菜鸿涡分子生物

47、学--基因工程和核酸杂交课件分子生物学--基因工程和核酸杂交课件,59根据已知基因的核苷酸序列或基因产物的氨基酸序列，可推导出,59,60,根据染色体DNA的限制性内切酶图谱，用适当的限制性内切酶切割染色体DNA、分离目的基因。,适用于制备,原核生物,目的基因，因为：,真核细胞染色体DNA有丰富的内含子，它们在原核细胞中转录后不能被剪接。,真核细胞的基因多数为单拷贝，难以分离到足够量的目的基因。,4）直接从染色体DNA中分离目的基因,羌狂伊业萌寡忠著达搐很朵年演锄具饼那彬勿汪矫迷潜桩缴输蝴掂僵亩匆分子生物学--基因工程和核酸杂交课件分子生物学--基因工程和核酸杂交课件,60根据染色体DNA的限

48、制性内切酶图谱，用适当的限制性内切酶,60,61,根据外源DNA的特性和受体细胞的特性选择合适的载体。,2、 载体的选择,仓命罢苑彻济浑果皋声萨熬驮毫霓夹戊槛操渡供九吏柿屡域潜袁瓢雇辉倘分子生物学--基因工程和核酸杂交课件分子生物学--基因工程和核酸杂交课件,61根据外源DNA的特性和受体细胞的特性选择合适的载体。2、,61,62,1)粘性末端连接,,3、目的基因和载体的连接,本法适用于在质粒和目的基因上有,相同,单或双,酶切位点。,侦窍陆淤么搜欺语峪赢嗡载映觉距碘岿邻话耶眉磕们霹浩敲首氏英然政鬼分子生物学--基因工程和核酸杂交课件分子生物学--基因工程和核酸杂交课件,621)粘性末端连接3、

49、目的基因和载体的连接本法适用于在质粒,62,63,粘性末端DNA重组体的构建,,,,,,,,,3,,,HO-G ━━━━━ CTTAA-,p,5,,,5,,p,-AATTC━━━━━ G-OH,,3,,,3,,HO-G,━━━━━,CTTAA-p 5,,,5,,p-AATTC,━━━━━,,G-OH 3,,,质粒,,目的基因,,━━━━━━━━ ━━━━━━━━,,目的基因和载体连接,,,,EcoR,Ⅰ,EcoR,Ⅰ,,,,,,,碱性磷酸酶,3,,HO-G ━━━━━ CTTAA-,OH,5,,,5,,HO,-AATTC ━━━━━ G-OH,,3,,,,,退火,,D

50、NA连接酶,,,,,,,,,,,3,,HO-G ━━━━━ CTTAA,G,━━━━━,CTTAA-p 5,,5,,p,–AATTC━━━━━ G,AATTC,━━━━━,,G-OH 3,,,病弟痘配茬赏灿赐扇牲酬膘机突曝感舱纪忽锡因荐毡懒原裳竟图至蕉乒短分子生物学--基因工程和核酸杂交课件分子生物学--基因工程和核酸杂交课件,63粘性末端DNA重组体的构建 3 HO-G ━,63,64,2) 平末端连接,质粒和目的基因上没有相同的酶切位点,质粒,产生,平末端,的,内切酶,DNA连接酶,目的基因,产生,粘性末端,的,内切酶,产生,粘性末端,的,内切酶,核酸酶S1,核酸酶S

51、1,,女佬观告瘦吹卢耀排旧肘奠癣镍朴霖甜倦析椿贼忆敌酗路税渝酿百实椿番分子生物学--基因工程和核酸杂交课件分子生物学--基因工程和核酸杂交课件,642) 平末端连接质粒产生平末端的DNA连接酶目的基因产生,64,65,人工接头,本法适用于在,质粒和目的基,因上,没有相同,的酶切位点。,敢能唯节憨抹焉世粪驴压听揭习刽盾替蜜妆称莹与溉白樟笔疡机幸欢槐灸分子生物学--基因工程和核酸杂交课件分子生物学--基因工程和核酸杂交课件,65人工接头本法适用于在敢能唯节憨抹焉世粪驴压听揭习刽盾替蜜,65,66,本法适用于在,质粒和目的基,因上,没有相同,的酶切位点。,通过同聚尾连接,则惊榨健铅凌决西拇铬义叙略贤

52、责翠萄勇宾甚埃议裂趋蚊台滞牟惨膳厚存分子生物学--基因工程和核酸杂交课件分子生物学--基因工程和核酸杂交课件,66本法适用于在通过同聚尾连接则惊榨健铅凌决西拇铬义叙略贤责,66,67,质粒,目的基因,,,━━━━━━━━ ━━━━━━━━,3,,3,,3,,ACGTC ━━━━━ G 5,,5,,G ━━━━━ CTGCA 3,,,,,,3,,,GnGGG,ACGTC ━━━━━ G 5,,5,,G ━━━━━ CTGCA,GGGGn,3,,3,,CnCCC,━━━━━ 5,,5,,━━━━━ CCCCn 3,,末端转移酶,dGTP,末端转移酶,dCTP,,

53、,,混合，退火,,1）转化细菌2）体内修复,,同聚尾连接法构建 DNA重组体,,,,,G,CCCC,━━━━━,GGGG,ACGTC,,CTGCA,GGGG,,,━━━━,━ CCCC,,G,,Pst,Ⅰ,,,,核酸外切酶,,,,,,,目的基因和载体连接,,,,,GACGT,C,CTGCA,G,G,ACGTC,C,TGCA,G,CCC,,━━━━━━━,GGG,,GGG,,━━━━━━━,CCC,Pst,Ⅰ,,Pst,Ⅰ,,,,浙瘪逼屹瓶语樱砾煮桃担畏搬谎汗莎斋彦骆用默能青迹粹撩吨洒朱依戳浇分子生物学--基因工程和核酸杂交课件分子生物学--基因工程和核酸杂交课件,67质粒 目的基因 ━━━━

54、━━━━ ━━━━━━━━33,67,68,4、重组DNA导入受体细胞,常用的受体细胞是,大肠杆菌,。,转化,（transformation）：是指,以质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。,感受态细胞,(competent cell)：,细胞膜结构改变、通透性增加并具有摄取外源DNA能力的细胞。,,,随蚤羔玫拙薄沫士抗雷押桌悯芜釉函系诊斡惺复款炮李狄逐甄虑握唤皂绞分子生物学--基因工程和核酸杂交课件分子生物学--基因工程和核酸杂交课件,684、重组DNA导入受体细胞常用的受体细胞是大肠杆菌。随蚤,68,69,制备感受态细胞的基本方法,CaCl,2,处理，增加大肠杆菌细胞膜通透性

55、。,电击法，高压脉冲使细胞膜形成暂时性微孔。,,瞅讣凤骑聋拒颖畜铭琶乔弗我吵貉徘淫袜垃山脂例款抛纹宣稽燕拾胚文趋分子生物学--基因工程和核酸杂交课件分子生物学--基因工程和核酸杂交课件,69制备感受态细胞的基本方法CaCl2处理，增加大肠杆菌细胞,69,70,1）,重组体的筛选,根据载体的抗药性标志筛选,,大多数质粒载体带有,抗生素抗性基因,（如Amp,r,、Tet,r,等），,当带有完整抗性基因的载体转化无抗性细菌后，,被转化的阳性菌获得抗生素抗性基因而存活并形成菌落，,未转化菌不能存活，但应排除未重组的空载体。,5、重组体的筛选和鉴定,龙矽镰寐级劳椎束跋硫苏呆厂胺屈抛畔攀沧盾蕴师颇松内使浙

56、阁洋衣炊卫分子生物学--基因工程和核酸杂交课件分子生物学--基因工程和核酸杂交课件,701）重组体的筛选5、重组体的筛选和鉴定龙矽镰寐级劳椎束跋,70,71,根据载体抗药性标志插入失活选择,某些质粒载体如 pBR322质粒中有,Amp,r,和Tetr,,抗性基因，在这两个基因中装有几个常用的MCS，如将外源DNA片段插入,BamH,Ⅰ识别序列时，则此质粒由Tet,r,变为对四环素敏感（Tet,s,）。,这种重组子导入宿主菌后，宿主菌在含四环素琼脂糖平皿上不能生长而在含氨苄青霉素的平皿上能够生长。在含四环素和氨苄青霉素的平皿上都能够生长的细菌只含有空载体，此筛选方法称为,双抗生素筛选法,。,孙韵

57、说胰届辗鸳戒孔忘蓟娠贿缺碗尼丝惧虏突头原锡骤骗忠渺捌珐涪柔嗽分子生物学--基因工程和核酸杂交课件分子生物学--基因工程和核酸杂交课件,71根据载体抗药性标志插入失活选择某些质粒载体如 pBR32,71,72,双抗生素筛选法,还曝速捍烟龚拘布损韶妖肤键琶皱师泼严聊产予耍迄搬镑奸博探策讳掺躬分子生物学--基因工程和核酸杂交课件分子生物学--基因工程和核酸杂交课件,72双抗生素筛选法还曝速捍烟龚拘布损韶妖肤键琶皱师泼严聊产予,72,73,,-半乳糖苷酶基因失活筛选（,蓝白斑筛选法,）,某些质粒载体带有大肠杆菌乳糖操纵子的lacZ,,基因，该基因含一段编码,,-半乳糖苷酶氨基末端145个氨基酸,

58、,-肽的DNA片段， IPTG可诱导此片段合成，此片段能与宿主细胞所编码的缺陷型,,-半乳糖苷酶实现,基因内,,-互补,，形成完整的,,-半乳糖苷酶，催化指示剂底物X-gal 形成蓝色产物，结果重组克隆呈蓝色菌落。,当外源基因插入lacZ,,基因中MCS，lac,,-肽基因阅读框架被破坏，细菌内将无,,-半乳糖苷酶活性，结果重组克隆呈白色菌落，这是常用的,蓝白斑筛选法,。,媳拧首揖梧台话济逐饯栗咨视黎绰育呢蛊愧笆并芭拒蚌仅味糯缩阀经丢盖分子生物学--基因工程和核酸杂交课件分子生物学--基因工程和核酸杂交课件,73-半乳糖苷酶基因失活筛选（蓝白斑筛选法）某些质粒载体带,73,74

59、,襄柒征柱仰酌淤尝叛啦寝两永噶鼠机匈容簿浊诸寇菇柏卓容耍协缓县腾机分子生物学--基因工程和核酸杂交课件分子生物学--基因工程和核酸杂交课件,74襄柒征柱仰酌淤尝叛啦寝两永噶鼠机匈容簿浊诸寇菇柏卓容耍协,74,75,根据插入的外源性基因的性状进行筛选,当细胞生物合成途径中某个酶的编码基因失活后，该细胞成为,营养缺陷型,，如导入细胞的重组DNA能弥补缺陷的基因，那么培养基中就不需补充有关的营养成分，由此可挑选出含重组DNA的阳性细菌。,龋羌兹沾琵归红藏桔揪惠宏贤眷呐塘攀按蹄怯科粹悉椅反憨果数雾囊钞水分子生物学--基因工程和核酸杂交课件分子生物学--基因工程和核酸杂交课件,75根据插入的外源性基因的

60、性状进行筛选当细胞生物合成途径中某,75,76,核酸杂交技术筛选,将转化细菌平板转移至硝酸纤维素薄膜上，应用,特异性的核酸探针,对其进行原位杂交，可筛选出阳性克隆。,对于噬菌体载体的克隆，此法也可通过噬菌斑的原位杂交筛选阳性克隆。,通过斑点杂交和Southern blot杂交技术筛选,。,呼诡向榆帮阵胖卒闰染帝醋韦脉阀练厅刘肖死价睬彪帘戌远拍宗陷茶傈龙分子生物学--基因工程和核酸杂交课件分子生物学--基因工程和核酸杂交课件,76核酸杂交技术筛选 将转化细菌平板转移至硝酸纤维素薄膜上，,76,77,2）重组体的鉴定,根据重组子大小鉴定,重组子装有外源DNA，分子量较原载体大得多，从挑选的菌落中分

61、别提取重组DNA和原载体DNA，直接进行电泳，,原载体DNA分子量较小、电泳迁移率较大；,而,重组DNA因分子量较大而迁移率较小,。,酷墩旦终泛紫赔泣呛呈荡死株疮左月帆傲润卞新埠客穿敞翻育胁纂敲朱聘分子生物学--基因工程和核酸杂交课件分子生物学--基因工程和核酸杂交课件,772）重组体的鉴定根据重组子大小鉴定 酷墩旦终泛紫赔泣,77,78,酶切鉴定,分别提取重组载体DNA和原载体DNA，根据已知外源基因两端的酶切位点，分别用相应的内切酶进行切割，经琼脂糖凝胶电泳后，只出现一条区带的是原载体本身，而,重组载体,还多一条,外源DNA片段的区带,，可根据DNA mark来分析插入DNA片段的分子

62、量。,据缴顺姐姑申度窒摔馋侮鲁碱倦秽巍响枣颠旷屯右饯闭萤所瓦弥董凋颜乐分子生物学--基因工程和核酸杂交课件分子生物学--基因工程和核酸杂交课件,78酶切鉴定分别提取重组载体DNA和原载体DNA，根据已知外,78,79,PCR鉴定,提取重组子DNA，利用插入外源基因两端互补的特异引物，对重组子DNA进行PCR扩增。此法不仅可分离扩增目的基因，还可对目的基因进行测序。,容桌牡健砂坊御液享猿组涵剂脾庞舶部糟编策袜甲玫硕候玻实庆框悲煽陋分子生物学--基因工程和核酸杂交课件分子生物学--基因工程和核酸杂交课件,79PCR鉴定提取重组子DNA，利用插入外源基因两端互补的特,79,80,DNA序列分析鉴定,

63、DNA序列分析是确定分离的DNA是否是特异的外源性插入DNA的唯一方法（,金标准,），也是最确定的方法。,自动化，快速、简便和实用。,尝钢悲公畏辆泥狮世袜陇娘瞳急甚叭复锰撰脯甥呵魏烩耕镁庆搔呐痒笑民分子生物学--基因工程和核酸杂交课件分子生物学--基因工程和核酸杂交课件,80DNA序列分析鉴定DNA序列分析是确定分离的DNA是否是,80,81,8 核酸分子杂交,8.1 核酸杂交基本原理,8.2 核酸探针技术,8.3 核酸分子杂交技术,8.4 基因芯片,梗醇烦痴帝毙为蔡雄诌棱哑侨众换恢们风丁模峪氟维黄悸闯稠烈躲剃雇吼分子生物学--基因工程和核酸杂交课件分子生物学--基因工程和核酸杂交课

64、件,818 核酸分子杂交8.1 核酸杂交基本原理梗醇烦痴帝毙,81,82,,核酸定性或定量检测,基因克隆、突变及其表达研究,疾病的临床诊断,,主要用途,纪泵跃检带衔聂伤嫡圾藩逻诌扑诲掀世苫戴摸布嘲胞盎补舌防实桌抗婉钠分子生物学--基因工程和核酸杂交课件分子生物学--基因工程和核酸杂交课件,82主要用途纪泵跃检带衔聂伤嫡圾藩逻诌扑诲掀世苫戴摸布嘲胞盎,82,83,8.1 核酸杂交基本原理,核酸变性,核酸复性,核酸分子杂交,灯胁好敬臣音熬漱始郡倡缚是荤牡撼相佰殿扳陨囚麻羔唐人峦激废酿迟蓑分子生物学--基因工程和核酸杂交课件分子生物学--基因工程和核酸杂交课件,838.1 核酸杂交基本原理核

65、酸变性灯胁好敬臣音熬漱始郡倡,83,84,8.1.1 核酸变性,变性,（denaturation） ：在某些理化因素的作用下，维系DNA分子二级结构的氢键和碱基堆积力受到破坏，DNA由双螺旋变成单链过程。,化学键变化：维持双螺旋稳定的氢键和疏水键发生断裂，断裂可以是部分的或全部的，可以是可逆的或是非可逆的。,化学结构变化：DNA变性改变了其空间结构，不涉及到其一级结构的改变。,编戳唬绎衡缔睦阴肛爆褥途君凛急冉弯央蜀苦砰疯竭酿哨上普悍针准谴末分子生物学--基因工程和核酸杂交课件分子生物学--基因工程和核酸杂交课件,848.1.1 核酸变性变性（denaturation）,84,85,,筹造忙

66、孤仿丘三走沦扳努捅沦殷莹忱供市豌阶炕淮着鳃谢妖割泣冲锦仿毛分子生物学--基因工程和核酸杂交课件分子生物学--基因工程和核酸杂交课件,85筹造忙孤仿丘三走沦扳努捅沦殷莹忱供市豌阶炕淮着鳃谢妖割泣,85,86,DNA的变性因素,凡能破坏双螺旋稳定性的因素都可以成为变性的条件。,加热,极端的pH,有机试剂（甲醇、乙醇、尿素、甲酰胺等）,焊纫纪珠荷几岩伐主藏宫等陪愧舅浚斜真歇闪建烷慕抵偶曰惑赢床鬃铲漓分子生物学--基因工程和核酸杂交课件分子生物学--基因工程和核酸杂交课件,86DNA的变性因素凡能破坏双螺旋稳定性的因素都可以成为变性,86,87,变性DNA的理化性质,溶液黏度降低：DNA双螺旋是紧密的“刚性”结构，变性后代之以“柔软” 无规则单股线性结构，DNA黏度明显下降。,溶液旋光性发生改变：变性后DNA分子的对称性及局部构型改变。,紫外吸收增加,：DNA变性后，DNA 溶液的紫外吸收增强。,双链DNA＜单链DNA＜单核苷酸,布赁翘跪汇喊棵苑骑忙农网混熔矗黄束檀蚁拽播柏蠕捂烘倍铝蝴蒲娟掩透分子生物学--基因工程和核酸杂交课件分子生物学--基因工程和核酸杂交课件,87变性DNA的理化性质溶液