分子生物学基础理论概要和常用实验技术简介课件

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1、单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,,,*,,20210426,分子生物学根底,理论概要和常用实验技术简介,,分子生物学根底,1,报告主要内容,分子生物学概要,几个分子生物学理论知识点,常用分子生物学实验技术,生物信息学简介,,报告主要内容分子生物学概要,2,一、什么是分子生物学？,二、分子生物学内容和原理,三、主要的理论成就,四、主要的应用成就,五、技术进步,分子生物学概要,,一、什么是分子生物学？分子生物学概要,3,一、什么是分子生物学？,从分子水平上研究生命现象物质根底的学科。研究细胞成分的物理、化学的性质和变化以及这些性质和变化与生命现象

2、的关系，如遗传信息的传递，基因的构造、复制、转录、翻译、表达调控和表达产物的生理功能，以及细胞信号的转导等。,分子生物学概要,,一、什么是分子生物学？分子生物学概要,4,①核酸的分子生物学,研究内容包括核酸/基因组的构造、遗传信息的复制、转录与翻译，核酸存储的信息修复与突变，基因表达调控和基因工程技术的开展和应用等。,②蛋白质的分子生物学,蛋白质的分子生物学研究执行各生命功能的主要分子──蛋白质的构造与功能。,③信号转导的分子生物学,研究细胞内、细胞间信息传递的分子根底。在一些外源信号的刺激下，细胞可以将这些信号转变一系列的生物化学变化，例如蛋白质构象的转变、磷酸化以及蛋白与蛋白相互作用的变化

3、等，从而使其增殖、分化及分泌状态等发生改变以适应内外环境的需要。信号转导研究的目标是说明这些变化的分子机理，明确每一种信号转导与传递的途径及参与该途径的所有分子的作用和调节方式以及认识各种途径间的网络控制系统。,二、分子生物学内容和根本原理,,①核酸的分子生物学二、分子生物学内容和根本原理,5,根本原理：,①构成生物体各类有机大分子的单体在不同生物中都是一样的。,②大分子建成规那么一样。,③某一特定生物体所拥有的核酸及蛋白质分子决定 了它的属性。,,根本原理：,6,三、主要的理论成就,1、DNA双螺旋模板学说,2、遗传中心法那么,3、基因表达调控理论,〔操纵子模型〕,4、基因学说的丰富和开展,

4、〔基因现代概念确实立〕,5、基因突变理论,6、基因作图理论,7、分子进化学说,8、信号转导学说,9、细胞周期调控理论,10、癌变的分子机制,11、通用遗传密码字典与,非通用遗传密码字典,12、生物信息学,13、基因组学与比较基因,组学,14、“RNA世界〞假说,15、细胞衰老和程序化死,亡机理,,三、主要的理论成就1、DNA双螺旋模板学说9、细胞周期调控理,7,〔1〕已用基因工程的技术研制出了一批珍贵的基因工程药物：,①人生长抑素,②生产胰岛素,③生产生长激素,④生产组织型血纤维蛋白溶酶原激活因子,⑤抗血友病因子Ⅳ,⑥制备乙型肝炎疫苗,⑦生产多种细胞因子,⑧制备基因工程抗体,1、在医学上的应用

5、成就,三、主要的理论成就,,〔1〕已用基因工程的技术研制出了一批珍贵的基因工程药物：1,8,〔2〕基因诊断与基因治疗,① 疾病诊断：遗传病、肿瘤、病毒感染的诊断，具有特异,性高，适应性强的特点，常用方法有核酸杂交、RFLP、,PCR、DNA指纹图谱,② 法医诊断、亲子鉴定,③ 基因治疗：方法有将目的基因与逆转录病毒重组、转染,受体细胞，使之表达以弥补缺陷；将目的基因对染色体,进展定位整合，即基因打靶；裸DNA直接注射。,,〔2〕基因诊断与基因治疗,9,〔2〕基因诊断与基因治疗,① 疾病诊断：遗传病、肿瘤、病毒感染的诊断，具有特异,性高，适应性强的特点，常用方法有核酸杂交、RFLP、,PCR、D

6、NA指纹图谱,② 法医诊断、亲子鉴定,③ 基因治疗：方法有将目的基因与逆转录病毒重组、转染,受体细胞，使之表达以弥补缺陷；将目的基因对染色体,进展定位整合，即基因打靶；裸DNA直接注射。,,〔2〕基因诊断与基因治疗,10,,,,,,(Southern/Northern/Western/FISH),6.基因克隆、基因文库,,,,,,,,,,五、技术进步,,五、技术进步,11,五、技术进步,,,,,,(Southern/Northern/Western/FISH),6.基因克隆、基因文库,,,,,,,,,,,五、技术进步,12,,,,,,,,,,,,,,,,,分子生物学基础理论概要和常用实验技术简

7、介课件,13,相关根底分子生物学理论,一、基因及基因突变,二、生物信息的传递〔中心法那么〕,三、真核基因的表达与调控,,相关根底分子生物学理论一、基因及基因突变,14,1、,关于基因的概念,基因的概念随着遗传学、分子生物学、生物化学等领域的开展而不断完善。从遗传学的角度看，基因是生物的遗传物质，是遗传的根本单位——突变单位、重组单位和功能单位；从分子生物学的角度看，基因是负载特定遗传信息的DNA分子片段，在一定条件下能够表达这种遗传信息，变成特定的生理功能。有的生物基因为RNA。,,1、关于基因的概念 基因的概念随着遗传学、,15,2、从分子水平来说，基因有三个根本特性：,①

8、基因可自体复制；,②基因决定性状，即基因通过转录和翻译决定多肽链的氨基酸顺序，从而决定某种酶或蛋白质的性质，而最终表达为某一性状,③基因的突变，即基因虽很稳定，但也会发生突变。一般来说，新的突变的等位基因一旦形成，就可通过自体复制，在随后的细胞分裂中保存下来。,,2、从分子水平来说，基因有三个根本特性：,16,3、基因的功能类型,．构造基因〔structural gene〕是可编码RNA或蛋白质的一段序列。构造基因的突变可导致特定蛋白质〔或酶〕一级构造的改变或影响蛋白质〔或酶〕量的改变。,. 调控基因〔regulator and control gene〕是指其产物参与调控其他构造基因表

9、达的基因。调控基因的突变可以影响一个或多个构造基因的功能，或导致一个或多个蛋白质〔或酶〕时的改变。,.重叠基因〔overlapping gene) 指同一段DNA的编码顺序，由于阅读框架的不同或终止早晚的不同，同时编码两个或两个以上多肽链的基因。,基因在染色体上可能有重叠，甚至一个基因完全存在于另一个基因内部。,,3、基因的功能类型．构造基因〔structural gen,17,④断裂基因或隔裂基因〔split gene),指一个构造基因内部为一个或者更多的不翻译的编码顺序。,外显子：参加蛋白质编码的DNA片段；,内含子：不参加蛋白质编码的DNA片段。,有的真核生物基因可能是不同外显子的组

10、合——断裂基因。,真核生物基因的典型构造,,④断裂基因或隔裂基因〔split gene),指一个构造基因,18,⑤跳跃基因(jumping gene)又称为转座(transposon)、转座因子、转位因子(transposable element)，指可作为插入因子和转座因子移动的DNA序列。,,⑥假基因〔pseudogene〕，同的基因相似，但位于不同位点，因缺失或突变而不能转绿或翻译，是没有功能的基因。,,,⑤跳跃基因(jumping gene)又称为转座(trans,19,◆基因突变(gene mutation)：染色体上某一基因位点内部发生了化学性质(构造)的变化，与原来基因形成对性关

11、系。,例如：植物高秆基因D突变为矮秆基因d。,经典遗传学认为：基因是一个“点〞，在染色体上具有一定的位置和相互排列关系。而基因突变就是一个点的改变，是以一个整体进展突变。因此从经典遗传学水平看，基因突变又称为“点突变〞(point mutation)。,◆locus与site,现代基因概念认为：基因是DNA分子带有遗传信息的碱基序列；基因是由众多碱基对构成，此时将一个碱基对称为基因的一个座位(site)；基因在染色体上的位置那么称为位点(locus)。,4、基因突变,人的自然突变频率为： 1×10-4～1×10-6。,,◆基因突变(gene mutation)：染色体上某

12、一基因位,20,5、 基因突变的类型,①根据基因构造的改变方式：,碱基替换突变；,碱基倒位；,移码(插入与缺失)突变,,②,根据突变所引起的表型改变分为：,形态突变型；,生化突变型；,致死突变型；,条件致死突变型,③从DNA碱基序列改变的多少：,单点突变(替换)；与经典遗传学的点突变point mutation比较.,多点突变(移码)。,,5、 基因突变的类型①根据基因构造的改变方式：②根据突变所引,21,④从突变所引起的遗传信息意义的改变：,,错义突变〔missense mutation〕:是指DNA分子中碱基改变后引起密码子变化。导致所编码的氨基酸发生替代，从而影响蛋白质功能，以至影响到

13、突变体的表型。,,无义突变〔nonsense mutation〕:是指由于DNA的碱基改变导致编码氨基酸的密码子突变成终止密码子。引起mRNA 翻译提前终止，产生一条短的不完整的多肽链。无义突变通常对所编码的蛋白活性有严重影响。,,,④从突变所引起的遗传信息意义的改变：,22,同义突变(沉默突变 silent mutation〕:是指DNA分子中的碱基改变后，突变的密码子仍然编码原来的氨基酸，并没有引起多肽链中氨基酸的变化。,不会引起表型突变，它们以多态的形式在生物体DNA中积累，引起同种生物不同个体间DNA序列的变化。,,延长肽链突变： 终止密码子突变成氨基酸的密码子。,,同义突变(沉默突变

14、 silent mutation〕:是指D,23,1、中心法那么及其开展,中心法那么(central dogma)阐述生物世代、个体以及从遗传物质到性状的遗传信息流向，即遗传信息在遗传物质复制、性状表现过程中的信息流向。,最初由Crick提出，并经过了屡次修正。,,1、中心法那么及其开展中心法那么(central dogma,24,,反转录(逆转录)：,反转录酶；,cDNA。,RNA的自我复制。,DNA指导蛋白质合成。,,,分子生物学基础理论概要和常用实验技术简介课件,25,2、遗传密码及其特性,,三联性；,非重叠性；,连续性；,简并性；,有序性；,通用性。,遗传密码的根本特性：,,2、遗传密

15、码及其特性遗传密码的根本特性：,26,起始密码子与终止密码子：,起始密码子：AUG(甲硫氨酸/甲酰甲硫氨酸)；,终止密码子(无义密码子)：UAA(赭石)、UAG(琥珀)、UGA(蛋白石)。,通用性的另外情况：,,2、遗传密码及其特性,,起始密码子与终止密码子：2、遗传密码及其特性,27,三、真核基因的表达调控,①诱发基因转录的信号、②基因调控在哪一步(模板DNA的转录、mRNA的成熟或蛋白质合成) 实现③不同水平基因调控的分子机制是研究基因调控的三个主要内容。,,a DNA水平的基因表达调控,b,转录水平的基因表达调控,,c,转录产物的加工转运调控,,d,翻译水平的基因表达调控,三个主要

16、内容：,,三、真核基因的表达调控 ①诱发基因转录的信号、②基因调,28,1. 真核生物基因组构造特点,〔1〕基因组大，基因多，存在大量重复序列，大局部与组蛋白和非组蛋白结合在一起；,〔2〕基因主要以单顺反子形式存在；,〔3〕多数基因是断裂的；,〔4〕存在基因家族；,〔5〕基因表达的调控位点多，位置多样化；,〔6〕局部基因组序列存在重排、扩增、丧失等规律性变化。,,1. 真核生物基因组构造特点〔1〕基因组大，基因多，存在大量,29,2,,转录水平的基因表达调控,,2.1,顺式作用元件,2.2,反式作用因子,,2.3,真核基因转录调控的主要模式,,2 转录水平的基因表达调控 2.1 顺

17、式作用元件,30,2.1 顺式作用元件,2.1.1 根本概念,2.1.2 顺式作用元件的分类,,2.1 顺式作用元件2.1.1 根本概念,31,2.1.1 根本概念,顺式作用元件(,cis,-acting elements),,基因周围能与特异转录因子结合而影响基因转录的DNA序列。,顺式作用(,cis,-acting ),顺式作用元件对基因表达起调控作用的过程。,,2.1.1 根本概念顺式作用元件(cis-acting el,32,2.1.2 顺式作用元件的分类,〔1〕启动子,〔2〕增强子,〔3〕绝缘子,〔4〕转座子,〔5〕其他应答元件,,2.1.2 顺式作用元件的分类〔1〕启动子

18、,33,〔1〕启动子(Promoter),① 定义,②,作用特点,③ 作用机制,④ 分类,,〔1〕启动子(Promoter)① 定义,34,,① 定义,位于转录起始点附近且为转录起始所必需的DNA序列。,,② 作用特点,,,一个基因可同时拥有一个及以上启动子；,,位置不定，一般在转录起始点上游；,,,可与增强子共同控制转录起始和强度；,,,发挥功能时除需RNA聚合酶外，还需转录调控因子与启动子,区各种调控元件相互作用。,,,① 定义,35,③ 作用机制,通过直接与RNA聚合酶相互作用，或结合于启动子关键元件上的蛋白质因子与RNA聚合酶的直接或间接作用，使得RNA聚酶处于适于转录起始的

19、位置，从而利于转录起始。,④ 分类,,细胞特异启动子,,诱导型启动子,,通用启动子,,③ 作用机制,36,〔2〕增强子(enhancer),① 定义,② 作用特点,③ 作用机制,④ 分类,,〔2〕增强子(enhancer)① 定义,37,① 定义,,指位于离转录起始点较远位置上，具有参与激活和增强起始功能的序列元件。,② 作用特点,,增强效应显著；,,增强效应与其位置和取向无关；,,要有启动子才能发挥作用；,,须与特定蛋白质因子结合才能发挥作用；,,一般具有组织或细胞特异性；,,无基因专一性。,,① 定义,38,③ 增强子的作用机制,通过提高启动子附近激活剂浓度而起作用。当它被约束在启动子附

20、近时，可在任何位置起作用。,三种可能的作用方式：, 可影响模板附近的DNA双螺旋构造；, 将模板固定在细胞核内特定位置；, 增强子区可以作为反式作用因子或RNA聚合酶Ⅱ进入染色质特定构造的入口。,④ 增强子的种类, 细胞特异性增强子 诱导性增强子, 通用增强子,,③ 增强子的作用机制,39,一种负调控元件，参与基因表达的负调控。其作用可不受序列方向影响，能远距离发挥作用。,〔3〕绝缘子(Insulator),〔4〕转座子〔transposon〕,能将自己插入基因组中新的位置的DNA序列。,,一种负调控元件，参与基因表达的负调控。其作用可不受序列方,40,反式作用因子(trans-acting

21、 factor),一种基因的RNA或蛋白质产物，能影响位于基因组另一条染色体上的〔或基因组别处的〕另一个基因的活性。,反式作用(trans-acting),反式作用因子对基因表达起调控作用的过程。,2.2.1 根本概念,,反式作用因子(trans-acting factor)2.2,41,2.2.2 转录因子的类型,〔1〕根本转录因子(Basal factor),和RNA聚合酶一起结合于转录起始点和TATA盒；,〔2〕激活剂(activator),特异性识别短共有序列元件的转录因子。结合于启动子或增强子位点上。通过增加根本转录复合体(basal apparatus) 结合于启动子的效率而起

22、作用；,〔3〕辅激活剂(coactivator),连接了激活剂和根本转录复合体；,〔4〕一些调节因子(Some regulators),可使染色质构造改变。,,2.2.2 转录因子的类型〔1〕根本转录因子(Basal,42,2.3 真核基因转录调控的模式,,2.3.1,RNA聚合酶Ⅰ的启动子和转录因子,2.3.2,RNA聚合酶Ⅲ的启动子和转录因子,2.3.3,RNA聚合酶 Ⅱ的启动子和转录因子,,2.3 真核基因转录调控的模式 2.3.1 RN,43,酶,主要转录产物,RNA聚合酶Ⅰ,rRNA，大多数snRNA,RNA聚合酶Ⅱ,mRNA前体，部分snRNA,RNA聚合酶Ⅲ,tR

23、NA、部分snRNA,真核细胞细胞核中共有3类RNA聚合酶,,酶主要转录产物RNA聚合酶Ⅰ rRNA，大多数snRNAR,44,,RNA聚合酶Ⅰ的启动子由一个核心启动子 (core promoter) 和一个上游控制元件 (upstream control element, UCE) 组成。,2.3.1 RNA聚合酶Ⅰ的启动子和转录因子,,RNA聚合酶Ⅰ的启动子由一个核心启动子 (core,45,2.3.2 RNA聚合酶Ⅲ的启动子和转录因子,RNA聚合酶Ⅲ识别的启动子分为两类：,♣ 5S RNA和tRNA基因的启动子位于基因内部(起始点下游)，称内部启动子(internal promot

24、er) ；,♣ 核小RNA〔snRNA〕基因的启动子那么位于起始点上游，与其他常规启动子的作用方式一样。,,2.3.2 RNA聚合酶Ⅲ的启动子和转录因子 RNA,46,2.3.3 RNA聚合酶 Ⅱ的启动子和转录因子,RNA聚合酶Ⅱ的启动子构造复杂，且序列变化很大，与转录启动有关的位点包括4个部位：,⑴ 帽子位点〔转录起始点〕，其碱基大多为A；,⑵ -25附近的TATA框；,⑶ -75附近的CAAT框；,⑷ -100以上的远上游序列，即增强子。,转录要起始，需很多的转录因子参与。,,2.3.3 RNA聚合酶 Ⅱ的启动子和转录因子 RNA,47,3 转录产物的加工转运调控,3.

25、1 RNA的不同剪接和编辑使同一基因转录产生出不同的蛋白质,3.2 RNA的切割和加polyA改变基因编码的蛋白质,3.3 RNA从核中转运到细胞质的过程受控制,,,3 转录产物的加工转运调控3.1 RNA的不同剪接和,48,基因操作,也称,重组DNA技术,，主要包括DNA分子的切割与连接、细胞转化、凝胶电泳、核酸分子杂交、核酸序列分析以及基因人工合成、定点突变和PCR扩增等，是分子生物学研究的核心技术。,基因工程是指在体外将核酸分子插入各种载体分子中，构成遗传物质的新组合，并使之进入新的寄主细胞内，进展持续稳定的繁殖和表达。,,常用分子生物学实验技术,两个概念,,基因操作

26、也称重组DNA技术，主要包括DNA分子的切割与连接、,49,主要内容,一、 重组DNA技术,二、DNA的根本操作,三、 RNA的提取和反转录,,主要内容一、 重组DNA技术,50,一、什么是重组DNA技术？,1、重组DNA技术〔Recombinant DNA Technique〕,又称为基因克隆〔Gene Cloning〕或分子克隆〔Molecular Cloning〕技术。是按照人们意愿，在体外对DNA分子进展重组，再将重组分子导入受体细胞，使其在细胞中扩增和繁殖，以获得该DNA的大量拷贝。,重组DNA技术包括了一系列的基因操作步骤。,,一、什么是重组DNA技术？1、重组DNA技术〔Reco

27、mbi,51,2、重组DNA技术的根本步骤,①目的DNA的获得与载体的制备；,②目的DNA与载体的连接；,③重组DNA导入受体细胞；,④重组DNA的筛选和鉴定；,⑤目的DNA的表达及表达产物的检测与别离纯化。,,2、重组DNA技术的根本步骤 ①目的DNA的获得与载体的制备,52,3、载体应当具备的条件,〔1〕能自主复制。容易获得大量的重组的DNA分子；,〔2〕具有适宜的外源DNA插入的位点〔克隆位点或限制性内切酶的切点〕。便于接纳不同的DNA片段。,〔3〕具备可供选择的遗传标记。便于进展重组体筛选和鉴定。,〔4〕载体本身应尽量小。不含或尽量少含多余的DNA局部，这样可以容纳较大的外源DNA。,

28、〔5〕在宿主细胞内的稳定性高。,,3、载体应当具备的条件〔1〕能自主复制。容易获得大量的重组的,53,,,,,多克隆位点,,,,,,Ori,复制起始点,遗传标记,Amp,,MCS,载体,,多克隆位点Ori复制起始点遗传标记AmpMCS载体,54,4、工具酶,我们的根本目的是：把外源基因与载体连接在一起形成重组DNA分子，最少需要以下两类工具酶：,①、准确切割DNA分子的工具〔“分子手术刀〞〕,------限制性内切酶,②、DNA片段的连接工具〔“分子缝合针〞〕,------DNA连接酶,,4、工具酶 我们的根本目的是：把外源基因与载体,55,①、限制性核酸内切酶------ “分

29、子手术刀〞,限制性核酸内切酶〔Restriction Endonuclease, RE〕：,是一类能识别和切割双链DNA分子中特定碱基顺序的核酸水解酶。,,GGATCC,CCTAGG,G,CCTAG,GATCC,G,,+,Bam,HⅠ,分类:,I、II、III〔重组DNA技术中常用II型〕,,①、限制性核酸内切酶------ “分子手术刀〞限制性核酸内,56,识别序列特点—— 回文构造(palindrome),即反向重复构造，以DNA分子中某一处为轴，其两侧核苷酸排列呈回文对称的序列。,每种限制性内切酶都有一个它所识别、结合并切割的特异序列，称为限制性位点或切点〔4~8bp〕。,识别序列：,

30、,GG,A,T,CC,CC,T,A,GG,Bam,HⅠ,,识别序列特点—— 回文构造(palindrome),57,,Bam,HⅠ,CCC,GGG,G,CCTAG,GATCC,G,+,GGATCC,CCTAGG,Sam,I,CCCGGG,GGGCCC,GGG,CCC,+,平末端〔Blunt end〕：,对称轴切割,粘性末端〔Sticky end〕：,交织切割,切口：,平端切口、粘端切口,,,Bam HⅠCCCGGATCC+GGATCCSam ICCC,58,几个常用限制性内切酶及其切点,,几个常用限制性内切酶及其切点,59,②、DNA连接酶------ “分子缝合针〞,DNA连接酶〔DNA L

31、igase〕：,催化两条DNA链的3´-OH和5´-P之间形成磷酸二酯键而把两个DNA分子连接在一起。例如:T4 DNA连接酶。,,②、DNA连接酶------ “分子缝合针〞DNA连接酶〔D,60,外源基因与载体的连接方式：,〔1〕粘性末端连接,方式：,① 同一限制性内切酶切点的连接,②不同限制性内切酶切点的连接,,,,外源基因与载体的连接方式：〔1〕粘性末端连接方式：① 同一限,61,〔2〕平端连接,适用于：,① 限制性内切酶作用产生的平端,② 粘端经特殊酶处理变为平端,,,〔2〕平端连接适用于：① 限制性内切酶作用产生的平端,62,〔四〕宿主细胞,大肠杆菌,酵母,昆虫细胞,哺乳动物细胞,

32、1、常用种类,2、导入方式,转化〔transformation〕,转染〔transfection〕,转导〔transduction〕,,〔四〕宿主细胞大肠杆菌1、常用种类2、导入方式转化〔tran,63,DNA的根本操作技术,〔Techniques for DNA Manipulation〕,一、核酸的凝胶电泳,二、细菌转化与目标DNA分子的增殖,,DNA的根本操作技术〔Techniques for DNA,64,一、核酸的凝胶电泳,核酸凝胶电泳是重组DNA技术的核心技术之一，它可以按分子量大小对DNA或RNA进展别离。因此，可用于别离、鉴定和纯化DNA或RNA片段，也是许多分子生物学研究方法

33、，如DNA分型、DNA核苷酸序列分析、限制性内切酶片段分析、凝胶回收等等一系技术的技术根底。,,一、核酸的凝胶电泳 核酸凝胶电泳是重组DNA技,65,一、核酸的凝胶电泳,核酸凝胶电泳是重组DNA技术的核心技术之一，它可以按分子量大小对DNA或RNA进展别离。因此，可用于别离、鉴定和纯化DNA或RNA片段，也是许多分子生物学研究方法，如DNA分型、DNA核苷酸序列分析、限制性内切酶片段分析、凝胶回收等等一系技术的技术根底。,,一、核酸的凝胶电泳 核酸凝胶电泳是重组DNA技,66,常用的核酸凝胶电泳有琼脂糖(Agarose)凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳〔PAGE〕。可以

34、在水平或垂直的电泳槽中进展。,,常用的核酸凝胶电泳有琼脂糖(Agarose)凝胶电泳和聚丙烯,67,琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为0.2-50 kb之间。,聚丙烯酰胺凝胶的分辨范围为1-1, 000 bp之间。,凝胶浓度的上下影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。,,琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为0.2-50 kb之间。,68,琼脂糖及聚丙烯酰胺凝胶分辨DNA片段的能力,,,,,,琼脂糖及聚丙烯酰胺凝胶分辨DNA片段的能力,69,二、细菌转化与目标DNA分子的增殖,细菌转化〔Transformation〕:,一种细菌菌株由于捕获了外源DNA而导致性状特征发生遗传改变

35、的生命过程。承受转化DNA的细菌菌株那么被称为受体菌株。,绝大多数细菌，正常条件下仅能获得极少量的DNA。为了高效转化这些细菌，必须对受体细菌进展一些物理或化学的处理，以增加它们获得DNA的能力。经历这种处理的细胞被称为感受态细胞〔Competent Cell〕。,,二、细菌转化与目标DNA分子的增殖细菌转化〔Transfor,70,常用细菌转化的方法1------,CaCl,2,法,将快速生长中的大肠杆菌置于经(0℃〕预处理的低渗氯化钙(0.1mol/L)溶液中，使细胞膨胀形成原生质球，外源DNA粘附在细胞外表。,42℃下做短暂热刺激，细胞吸收外源DNA。在全培养基中生长一段时间使转化基因实

36、现表达，涂布于选择性培养基中别离转化子。,,常用细菌转化的方法1------CaCl2法将快速生长中的大,71,常用细菌转化的方法2------,电转化法,利用锐利的电脉冲在细胞膜上造成小凹陷，进而形成,纳米级疏水孔洞,。随着跨膜电压增加，一些较大的疏水性孔洞会转变为亲水性孔洞，溶液中的DNA很容易通过孔洞进入细胞质。,,常用细菌转化的方法2------电转化法 利用,72,克隆的筛选和鉴定：,1、抗生素,常用的抗生素有：氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、四环素、链霉素等。,2、α-互补蓝白斑筛选法,实验室常用带有不同,抗生素,的选择性培养基结合,α-互补蓝白斑筛选法,鉴定转化细胞。

37、,载体上：β-半乳糖苷酶基因〔LacZ〕的调控序列和氨基 端〔N端〕146个氨基酸编码序列，在编码区中插入了一个多克隆位点〔MCS〕； ---- 片段,宿主细胞：,编码β-半乳糖苷酶,C端,序列,,----,片段,,克隆的筛选和鉴定：1、抗生素 常用的抗生素有：氨,73,宿主和质粒编码的片段虽都没有酶活性，但它们同时存在时，可形成具有酶学活性的蛋白质。这样，,Lac,Z基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补，称为,α-互补,。,,宿主和质粒编码的片段虽都没有酶活性，但它们同,74,,分子生物学基础理论概要和常用实验技术简介课件,75,细

38、菌转化与目标DNA分子的增殖的操作过程,,细菌转化与目标DNA分子的增殖的操作过程,76,三、RNA的提取和反转录,RNA存在于从简单的病毒到哺乳动物细胞的所有的生命形式之中。应用RNA对细胞和分子生物学的各个方面进展研究非常普遍。,由于当前没有一种方法能够直接扩增RNA，为了研究RNA所包含的功能信息，一般将其反转录成稳定的DNA双螺旋〔Complementary DNA，cDNA)，再插入到可以自我复制的载体中。由于cDNA来自RNA，几乎不含冗余序列，通过特异性探针筛选cDNA文库，可以较快的别离到相关基因。,,三、RNA的提取和反转录 RNA存在于从简单的,77,1、 总

39、RNA的提取,细胞中的总RNA包括,信使RNA (mRNA) 、核糖体RNA (rRNA)、转运RNA (tRNA),以及一些,非编码的小RNA,。一个典型的动物细胞约含有10,-5,μg,RNA，,其中,rRNA,占80%~85%，tRNA和非编码小RNA占15%~20% ， mRNA 占1%~5%。,,1、 总RNA的提取 细胞中的总RNA包括信使,78,按照提取试剂的种类来分，可分为：异硫氰酸胍法、盐酸胍法、异硫氰酸胍-苯酚法。,Trizol试剂是使用最广泛的抽提RNA专用试剂。主要由异硫氰酸胍和苯酚组成，可以迅速破坏细构造，使存在于细胞质及核内的RNA释放出来，并使蛋白质

40、与RNA分子别离，还能保证RNA的完整性。,常用的RNA提取方法,①,、常用提取方法的种类,,按照提取试剂的种类来分，可分为：异硫氰酸胍法,79,由于,RNA酶,存在于所有的生物中并且能够抵抗诸如煮沸这样的物理破坏，固此建立一个,无RNA酶的环境,对于制备优质RNA很重要。对于制备mRNA来说这些预防措施尤其重要。,②、本卷须知,,由于RNA酶存在于所有的生物中并且能够抵抗诸,80,纯的RNA样品其OD260／OD280应介于1.8-2.0之间。,1〕假设RNA样品OD260/OD280比值太小，说明有蛋白质或酚的污染；,2〕比值大于2.0时，可能被异硫氰酸胍等污染；,,OD260值=1，相当

41、于单链DNA或RNA为40μg/mL，寡核苷酸为20μg/mL。,RNA的纯度、浓度与完整性,1、RNA的纯度,2、RNA的浓度,,纯的RNA样品其OD260／OD28,81,rRNA大小完整，而且28S rRNA和 18S rRNA亮度接近2：1；mRNA分布均匀，那么认为RNA质量较好。,3、RNA的完整性,,rRNA大小完整，而且28S rRNA和 18S,82,2、 cDNA的合成,使用Oligo dT Primer时的cDNA合成,使用Random Primer时的cDNA合成,缺陷：不具有ploy〔A〕尾构造的mRNA无法使用此方法！,,2、 cDNA的合成使用Oligo dT P

42、rimer时的c,83,生物信息学简介,概念,：生物信息学是用数理和信息科学的观点、理论和方法去研究生命现象、组织和分析呈现指数增长的生物学数据的一门学科。,首先是研究遗传物质的载体DNA及其编码的大分子蛋白质，以计算机为其主要工具，开展各种软件，对逐日增长的浩如烟海的DNA和蛋白质的序列和构造进展收集、整理、分析和研究，逐步认识生命的起源、进化、遗传和发育的本质，破译隐藏在DNA序列中的遗传语言，提醒人体生理和病理过程的分子根底，为人类疾病的预测、诊断、预防和治疗提供最合理和有效的途径。生物信息学已经成为生物医学、农学、遗传学、细胞生物学等学科开展的强大推动力量，也是药物设计、环境监测的重要

43、组成局部。,,生物信息学简介概念：生物信息学是用数理和信息科学的观点、理论,84,1、美国国家信息中心 (National Center of Biotechnology Information, NCBI)的Gen Bank( :/ / nchi. nlm. nih. gov/ web/Gen Bank/ imdex. html),,2、欧洲分子生物学室验室(European Molecular Biology L aboratory-Euro-pean Bioinformatics Institute, EMBL-EBI)的 EMBL ( :// ebi. a

44、c.uk/ databases/ index.html),,3、日本 DNA数据库 (DNA Data Bank of Japan, DDBJ) ( :/ / ddbj.nig.ac.jp/ ),三大生物信息数据库,,1、美国国家信息中心 (National Center of,85,生物信息学的主要研究内容,,1、序列比对〔Alignment〕比较两个或两个以上符号序列的相似性或不相似性。序列比对是生物信息学的根底，非常重要。两个序列的比对有较成熟的动态规划算法，以及在此根底上编写的比对软件包——BALST和FASTA,2、构造比对 较两个或两个以上蛋白质分子空间构造的相似,

45、性或不相似性,,3、蛋白质构造预测，包括2级和3级构造预测，是最重要的课题之一。,,前者主要是从一些根本原理或假设出发来预测和研究蛋白质的构造和折叠过程。分子力学和分子动力学属这一范畴。后者主要是从观察和总构造造的蛋白质构造规律出发来预测未知蛋白质的构造,,生物信息学的主要研究内容 1、序列比对〔Alignment〕,86,4、计算机辅助基因识别(仅指蛋白质编码基因),,根本问题是给定基因组序列后，正确识别基因的范围和在基因组序列中的准确位置。从具有较多内含子的真核生物基因组序列中正确识别出起始密码子、剪切位点和终止密码子,5、非编码区分析和DNA语言研究，是最重要的课题之一,,在人类基因组中

46、，编码局部进展总序列的3~5%，其它通常称垃圾〞DNA，其实一点也不是垃圾，只是我们暂时还不知道其重要的功能。分析非编码区DNA序列需要大胆的想象和崭新的研究思路和方法。DNA序列作为一种遗传语言，不仅表达在编码序列之中，而且隐含在非编码序列之中。,,4、计算机辅助基因识别(仅指蛋白质编码基因) 根本问题是给定,87,6、分子进化和比较基因组学，是最重要的课题之一,近年来由于较多模式生物基因组测序任务的完成，为从整个基因组的角度来研究分子进化提供了条件。,,7、序列重叠群〔Contigs〕装配〔拼接〕,一般来说，根据现行的测序技术，每次只能测出片段序列，这就有一个把大量的较短的序列全体构成了重

47、叠群〔Contigs〕。逐步把它们拼接起来形成序列更长的重叠群，直至得到完整序列的过程称为重叠群装配。拼接EST数据以发现全长新基因也有类似的问题。,8、遗传密码的起源,,,6、分子进化和比较基因组学，是最重要的课题之一 近年来由于较,88,9、基于构造的药物设计,基于生物大分子构造的药物设计是生物信息学中的极为重要的研究领域。为了抑制某些酶或蛋白质的活性，在其3级构造的根底上，可以利用分子对接算法，在计算机上设计抑制剂分子，作为候选药物。这种发现新药物的方法有强大的生命力，也有着巨大的经济效益。,10、其他,如基因表达谱分析，代谢网络分析；基因芯片设计和蛋白质组学数据分析等，逐渐成为生物信息学中新兴的重要研究领域 。,,9、基于构造的药物设计 基于生物大分子构造的药物设计是生物信,89,The end,,The end,90,