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1、基因编辑技术CRISPR/Cas9 1 9 8 7年，日本大阪大学（Osaka University） 在对一种细菌编码的碱性磷酸酶基因进行研究时，发现在这个基因编码区域的附近存在一小段不同寻常的DNA片段，但一直不清楚功能。后来的研究发现，这种重复序列广泛存在于细菌和古细菌中。 2 0 0 2年才正式命名为成簇的规律间隔性短回文重复序列CRISPR(Clustered regulatory interspaced short palindromic repeats). 2 0 1 3年之后，研究者们在science 和nature等国际著名杂志上发表多篇文章介绍CRISPR/Cas9系统，并
2、且已成功在人类、小鼠、斑马鱼等物种上实现精准的基因修饰。1 .CRISPR/Cas系统概述 已测序的接近9 0 %的古细菌和4 0 %的细菌的基因组或是质粒中至少存在CRISPR 基因座。 根据Cas 基因核心元件序列的不用，CRISPR/Cas 免疫体统分为3中类型：型、型和型。型和型CRISPR/Cas免疫系统需要多个Cas蛋白形成复合体切割DNA双链，而型CRISPR/Cas9免疫系统只需要一个Cas9蛋白来切割DNA双链，目前型系统是被改造的最成功的人工核酸内切酶。1 .CRISPR/Cas系统概述1 .1 CRISPR的分布与分类： CRISPR/Cas系统是很多细菌和大部分古细菌的
3、天然免疫系统，通过对入侵的病毒和核酸进行特异性的识别，利用Cas蛋白进行切割，从而达到对自身的免疫。1 .2 CRISPR系统获得：1 .CRISPR/Cas系统概述 2 .CRISPR/Cas系统结构2 .1 CRISPR/Cas 主要由两部分组成： 2 .2 CRISPR结构： CRISPR是一种特殊的DNA 重复序列家族，广泛分布于细菌和古细菌基因组中。CRISPR位点通常由短的高度保守的重复序列(repeats)组成，重复序列的长度通常为2 1 -4 8 bp，重复序列之间被2 6 -7 2 bp间隔序列(spacer)隔开。CIRSPR通过这些间隔序列(spacer)与靶基因进行识别
4、。2 .CRISPR/Cas系统结构 2 .3 Cas家族： Cas(CRISPR associated)存在于CRISPR位点附近，是一种双链DNA核酸酶，能在guide RNA 引导下对靶位点进行切割。它与fokI酶功能类似，但是它并不需要形成二聚体才能发挥作用。2 .CRISPR/Cas系统结构 u CRISPR基因座的表达（包括转录和转录后的成熟加工）u当该噬菌体再次入侵细菌时，CRISPR簇首先转录为长的crRNA前体，然后逐步加工成小的成熟的crRNA.u CRISPR/Cas系统活性的发挥或外源遗传物质的干扰u crRNA结合相关的Cas蛋白后，形成crRNA-Cas蛋白复合体，
5、通过碱基互补配对精确地与目标DNA相结合，随后Cas蛋白对目标DNA 进行断 裂和降解。 3 .CRISPR/Cas9系统作用机制 4 .CRISPR/Cas9系统Type 因其简单性及可操作性，被改造成有力的基因工程工具-CRISPR/Cas9。现在广泛使用的CRISPR/Cas9系统来源于酿脓链球菌。Type II系统具有以下特点：u在CRISPR/Cas基因座上游会表达tracrRNA;u tracrRNA会参与crRNA的加工，这个工程亦需要RNaseIII的参与；u tracrRNA会与crRNA形成二聚体指导Cas对 双链DNA的切割。 Cas9是一种核酸内切酶,其具有：RuvC和
6、HNH两个内切酶活性中心Jinek等发现Cas9在细菌和试管里对双链DNA具有强烈的切割能力,但是这种切割能力需要的crRNA和tracrRNA介导。4 .CRISPR/Cas9系统 Jinek等创造性的把crRNA和部分tracrRNA融合成一条嵌合的RNA链,使其同时具有crRNA和tracrRNA的特性,随后的切割实验表明,这条嵌合的RNA同样可以引导Cas9切割目标DNA。现在普遍使用的都是crRNA和全长tracrRNA 融合体,简称 sgRNA (single guide RNA) 4 .CRISPR/Cas9系统 4 .CRISPR/Cas9系统酿脓链球菌 4 .CRISPR/C
7、as9系统 CRISPR Design Tool: http:/crispr.mit.edu/E-CRISPR: http:/www.e-crisp.orgZiFiT: http:/zifit.partners.org/Cas9 Design: http:/cas9 http:/ http:/crispr.cos.uni-heidelberg.de/4 .CRISPR/Cas9系统gRNA 在线设计工具： 4 .CRISPR/Cas9系统 u基因敲除或者敲入；u基因修复；u基因调控；u文库筛选。4 .CRISPR/Cas9系统CRISPR/Cas 作用： 5 .CRISPR/Cas9 脱靶效
8、应u 2 0 1 3年，研究者们发表多篇文章介绍CRISPR/Cas9系统，但CRISPR/Cas9目前仍存在一个很严重且无法避免的问题，即潜在的脱靶效应不可消除。u CRISPR/Cas9与靶位点识别的特异性主要依赖于gRNA与靠近PAM处1 0 -1 2 bp碱基的配对，而其余远离PAM处8 -1 0 bp碱基的错配对靶位点的识别影响不大。u Cas9蛋白不具特异性 沈彬，2 0 1 5 6 .降低脱靶效应Cas9切口酶通过点突变的方法，使Cas9只有单链切割活性，类似于切口酶 Yu Hisano et al.2 0 1 4 6 .降低脱靶效应添加同源臂(homology arm,HR)
9、Nicolas Wyvekens et al.2 0 1 5FoKI-dCas9 6 .降低脱靶效应 Feng Zhang et al. 2 0 1 5 6 .降低脱靶效应CRISPR/Cpf1系统Cpf1系统更简单一些，它只需要一条RNA。Cpf1酶也比标准SpCas9要小，使得它更易于传送至细胞和组织内。Cpf1以一种不同于Cas9的方式切割DNA。Cas9切割留下“平端”（blunt ends）。Cpf1复合物生成的两条链切口是偏移的，在裸露端留下了短悬端（overhang）。这预计有助于精确插入。 Cpf1切口远离识别位点。Cpf1 Is a Single RNA-Guided Endonuclease of a Class 2 CRISPR-Cas System 7 .视频：基因编辑CRISPR-Cas9原理
CRISPR-Cas9-基因编辑技术简介
