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1、重叠延伸PCR技术（SOE PCR）1. 重叠延伸PCR技术的概念 重叠延伸PCR技术(SOE PCR)是指在PCR技术的基础上，采用具有互补末端的引物,使PCR产物形成了重叠链,通过重叠链的延伸,将不同来源的片段重叠拼接起来的一项新技术。该技术可以很快获得依靠其它限制性内切酶消化的方法难以得到的产物，其成功的关键是重叠互补引物的设计。SOE PCR在基因的定点突变、长片段基因的合成、基因敲除以及目的基因的扩增等方面有着独特的应用。2. 重叠延伸PCR技术的原理 重叠延伸PCR 技术由于使用了具有互补末端的引物，使PCR 产物形成了重叠链，从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，将不同来源的扩
2、增片段重叠拼接起来。可简单迅速的将两个DNA 片段连在一起，用于嵌合基因的构建。 比如有两个基因，一个命名为M，一个命名为N，基因M和N序列如下所示：M的序列为5-ATGCATGCTAGCTAGAACGCTACGCTGACTACCCCCTGATC-3N的序列为5-ATGCTAGTAGCTAGCCCCCCCCAGGGGATAATTTTTTAAAACG-3 现在要将它们连接到一起，首先必须要设计引物，假设引物的序列为：M1:5-ATGCATGCTAGCTAGAACGCT-3M2:5-GGGGGGCTAGCTACTAGCATGATCAGGGGGTAGTCAGCGT-3N1:5-ACGCTGACTAC
3、CCCCTGATCATGCTAGTAGCTAGGGGGGG-3N2:5-CGTTTTAAAAAATTATCCCCT-3 该过程的目的是将基因M、N通过PCR的方法连接起来，我们观察上面的引物M2和N1，会发现它们要比另外两条引物长很多，为什么要进行这样设计呢？原来这是因为在设计的时候将M2的3端加入了20个N基因5端的序列，在N1的5端加入了20个M基因3端的序列，然后再进行如下相关步骤：（1）以M1、M2扩增M基因，N1、N2扩增N基因（2）回收M、N基因（3）以M、N为共同的模板，M1和N2为引物，扩增M+N，这样就将M+N拼接起来了。反应机理5555333355335533加入酶，buf
4、fer等反应液。PCR仪中解链，退火单链模板结合F1 引物R1引物F2 引物R2 引物无目标产物5533加入F1引物、R2引物5533F1 引物R2 引物大量扩增目的基因基因A基因B*3.重叠延伸PCR的特点 (1) 不需要内切酶消化和连接酶处理,利用PCR技术在体外进行有效的基因重组和定点突变,操作非常简便,可以利用这一技术很快获得利用内切酶消化的方法难以得到的产物,可用于大片段基因的人工合成,且成功率非常高 (2) 此技术可以将任意的两个目的基因拼接连接形成2个目的基因的融合基因,中间无任何非目的基因的DNA序列,这样就避免因加入连接序列可能出现的非目的基因序列,从而在体外就可得到高质量的
5、目的基因序列. (3) 此技术可以得到短至几十碱基和长至20以上的片段,弥补了一般PCR对短于100bp和长几十片段的重组几乎无能为力的缺憾,极大地丰富了PCR技术的扩增范围,并且在获得长片段DNA方面,省去了常规亚克隆的烦琐工作4 .重叠pcr的应用 4.1 在定点突变方面的应用 在重叠延伸PCR 中，两个重叠的DNA 片段是分别从两个独立的PCR 扩增反应得到的。预设突变构建在重叠区域，存在于两个扩增片段中。设计4 种引物，用第一对引物扩增含有突变位点及其上游序列的DNA 片段，第二对引物被用来扩增含突变位点及其下游序列的DNA 片段，两个侧翼引物含野生型序列，两个突变引物含有希望引进的突
6、变位点，如置换插入或缺失。混合两次PCR 的产物，由于两个突变引物有重叠区，重叠片段之间退火，延伸成异源双链，加入外侧引物进行第三次PCR，即可得到目标突变体。在定点突变方面的应用 G C A A A G G C A T C G A C G T T T C C G T A G C TF1引物F2引物R1引物R2引物碱基同源区域突变碱基突变碱基：可以在引物上换成任何其他碱基。碱基同源区域：保证20bp左右，这样有利于Overlap PCR 得到目标序列。 G C A A AC G T T TG C A A A T G C A T C G AC G T T T A C G T A G C TF1引
7、物R1引物F2引物R2引物G C A A A T G C A T C G AC G T T T A C G T A G C TOverlap PCR得到突变后的目的基因* 4.2 构建融合基因 重叠延伸PCR 法还可以用于两个或两个以上异源基因DNA 片段的拼接 。如同致突变引物一样，SOE 引物亦含有末段互补序列，通过PCR 产生的两个DNA 片段可通过引物延伸进行剪接和扩增，从而获得重组体。与定点突变不同的是：一是待融合的PCR 产物来自两个不同的基因；二是通过SOE 引物在两种PCR 产物中产生相互重叠的链进而获得融合基因5. 重叠延伸PCR技术的试题解析 例题：重叠延伸PCR技术是一种
8、通过寡聚核苷酸链之间重叠的部分互相搭桥、互为模板，通过多次PCR扩增，从而获得目的基因的方法。该技术在扩增较长片段的DNA、不同来源的DNA片段拼接等方面具有广泛的应用前景。下图是利用重叠延伸PCR技术扩增目的基因的过程。其主要设计思路是用具有互补配对片段的引物（图中引物2、引物3），分别PCR,获得有重叠链的两种DNA片段，再在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸获得目的基因。结合所学知识，分析下列问题。 （1）引物中G+C的含量影响着引物与模板DNA结合的稳定性，引物中G+C的含量越高，结合稳定性_。 （2）在第一阶段获得两种具有重叠片段DNA的过程中，必须将引物1、2和引物3、4置于不同反应
9、系统中，这是因为_。 （3）引物1、引物2组成的反应系统和引物3、引物4组成的反应系统中均进行一次复制，共产生_种双链DNA分子。 （4）在引物1、引物2组成的反应系统中，经第一阶段形成图示双链DNA至少要经过_次复制。 （5）如果利用微生物扩增目的基因，其基本步骤包括：_-、_、微生物的筛选和培养、从菌群中获取目的基因。答案：（1）越高（2）引物2和引物3中存在互补配对片段，置于同一反应系统时它们会发生结合而失 去作用（3）3 （4）2 （5）目的基因与载体结合 将重组DNA导入受体细胞 解析：重叠延伸PCR技术在扩增较长片段的DNA、不同来源的DNA片段拼接、基因的定点诱变等方面有广泛的应
10、用。老师要予以关注，在讲评中可适当拓展。G与C碱基对之间是三个氢键，引物中GC含量越多，越稳定。由图可知，因为引物2、3有互补片段，但引物1、4没有互补片段。利用引物1、2进行扩增，可产生 两种DNA片段，利用引物3、4进行扩增，可产生 ，其中a、c分别是以引物1和引物4扩增产生的DNA片段，是相同的DNA片段，b、d分别是以引物2和引物3扩增的DNA片段，碱基序列是不同的，共三种。因为新的核苷酸链必须从5端到3端，在第二阶段，含引物1和引物4的脱氧核苷酸链因为有互补的碱基序列，而部分互补，并能互为模板进行延伸，但含引物2和引物3的脱氧核苷酸链虽能部分互补，但因方向问题，不能延伸。6 展望 SOE PCR 的关键不仅仅在反应操作中，而主要在于引物的设计。通过设计特定的搭桥引物，将两个目的序列融合在一起，避免了不必要地酶切和连接。更重要的是，重叠延伸对融合位点及其附近序列没有特殊要求，融合部位可以是任意位点，只要根据相应原理设计好搭桥引物就可以按照常规PCR 轻松操作。因此，此技术会在越来越多的实验室得到广泛的应用
重叠延伸PCR技术
