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1、
纸层析法分离氨基酸
班级 姓 名 ：
学号： 同组同学：
实验日期：
1、 实验目的
1、掌握分配层析的原理，学习氨基酸纸层析法的操作技术
2、学习未知样品的氨基酸成分(水解、层析及鉴定)分析的方法。
2、 实验原理
用滤纸为支持物进行层析的方法，称为纸层析法。纸层析所用展层溶剂大多由水和有机溶剂组成，滤纸纤维与水的亲和力强，与有机溶剂亲和力弱，因此在展层时，水是固定相，有机溶剂是流动相。溶剂由下而上移动，称上行法；由上而下移动的，称为下行法。将样品点在滤纸上，进行展层，样品中的各种氨基酸在两相溶剂中
2、不断进行分配。由于他们分配系数不同，不同氨基酸随流动相的移动速度就不同，于是将各种氨基酸分离开，形成距离远点距离不等的层析点。
溶质在滤纸上的移动速率用值表示：
只要条件不变，值是常数，故可以根据值作定性依据。
样品中如有多种氨基酸，其中某些氨基酸的值相同或相近，此时如用一种溶剂展层，就不能将它们分开。为此，当用一种溶剂展层后，将滤纸转动，再用另一种展层，从而就达到分离的目的，这种方法称为双向纸层析法。
氨基酸无色、利用茚三酮反应，可将氨基酸层析点显色作定性和定量。
3、 实验器材和药剂
1、实验试剂
1、氨基酸标准液(1mg/mL) 亮氨
3、酸、甘氨酸和脯氨酸标准液。
2、80%甲酸
3、0.1%茚三酮丙酮溶液
4、氨基酸混合液
5、正丁醇
6、蒸馏水
2、仪器
1 、新华滤纸
2、培养皿
3、电热鼓风干燥箱
4、吹风机
5、毛细管
6、针、线、尺。
7、钟罩
4、 实验步骤
1、 滤纸：选用国产新华 1号滤纸， 6cm7cm。在距滤纸2cm处划线，用铅笔在线上标上四个点作为点样位子
2、 点样：点样要合适，样品点的太浓，斑点易扩散或拉长，以致分离不清。用毛细管吸取氨基酸样品，与滤纸垂直方向轻轻碰触点样处的中心，这时样品就自动流出。点样的扩散直径控制在0.5cm之内，点样过程中必须在第一滴样品
4、干后再点第二滴，为使样品加速干燥，可用吹风机吹干，但要注意温度不可过高，以免氨基酸破坏，影响定量结果。
3、 将点好样品的滤纸两侧比齐，用线缝好，揉成筒状。注意缝线处纸的两边不要接触。避免由于毛细管现象使溶剂沿两边移动特别快而造成溶剂前沿不齐，影响Rf值。
4、 展层：将揉成圆筒状的滤纸放入培养皿内 (注意滤纸不要碰皿壁)，当溶剂展层至距离纸的上沿约1cm时，取出滤纸，立即用铅笔标出溶剂前沿位置
5、 酸溶剂系统：正丁醇： 80%甲酸：水=15:3:2(体积比)，茚三酮2ml。温度25℃，时间1h。
6、 显色：待展层基本结束后, 置65℃鼓风箱中10-20min，鼓风保温，滤纸上即显
5、出紫红色/黄色斑点。
7、 E、Rf值的计算：用尺测量显色斑点的中心与原点(点样中心)之间的距离和原点到溶剂前沿的距离，求出此值，即得氨基酸的Rf值。
5、 数据处理和计算
亮氨酸
甘氨酸
脯氨酸
待测氨基酸
原点到层析点中点距离
5.9cm
1.5cm
2.5cm
1.6
2.6
5.9
原点到溶剂最前沿距离
8.0cm
8.0cm
8.0cm
8.0cm
0.7375
0.2143
0.3125
0.2
0.325
0.7375
判断待测氨基酸
待测氨基酸应为亮氨酸，甘氨酸脯氨酸的混合物
6、 思
6、考与讨论
1、 为什么在展层时有时用一种溶剂系统，而有时用两种溶剂系统?
答：在样品所含溶质较多或某些组分在单相纸层析中的Rf比较接近，不易明显分离时，应用这种方法，如果溶质在第一溶剂中不能完全分开，而经过第二种溶剂的层析能得以完全分开，大大的提高了分离效果。
2、 酸性溶剂系统(或碱性溶剂系统)对氨基酸极性基团的解离有何影响?
答：酸性溶液中，有利于氨基酸的碱式电离，氨基结合质子，整个分子带正电荷；反之，碱性溶液中有利于羧基的酸式电离，氨基酸分子整体带负电荷
3、 酸性溶剂系统(或碱性溶剂系统)对碱性氨基酸(赖、精、组)和酸性氨基酸(天冬、谷)的Rf值有什么影响?
答：你往溶剂系
7、统中对于加入碱，对于酸性氨基酸来说，羧基会更多的解离，自然Rf降低。而对于碱性氨基酸的盐溶液来说，解离度降低，Rf增大。 你往溶剂加酸，对于酸性氨基酸来说，羧基变化不大，氨基接受质子更多解离，Rf降低。对于碱性氨基酸，解离度增大，Rf也减小
4、什么是分配系数？
答：当溶质在两种互不兼容的溶剂中分配时，在温度达到一定平衡时，溶质在两相的浓度比值，,有效分配系数，分别代表A相和B相的体积。
注意事项：
使用茚三酮显色法，必须在整个层析操作中避免手直接接触层析纸，因为手上常常有少量含氮物质。显色时它也呈现紫色斑点。污染了层析结果，因此操作时应戴橡皮手套或指套。同时也要防止空气中的氨。
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8、、 从结果中所得到的的心得
在做实验前,一定要将课本上的知识吃透,因为这是做实验的基础,否则,在老师讲解时就会听不懂,这将使你在做实验时的难度加大,浪费做实验的宝贵时间老师还会根据自己的亲身体会,将一些课本上没有的知识教给我们,拓宽我们的眼界,使我们认识到这门课程在生活中的应用是那么的广泛.真正是我们受益匪浅。在实验的过程中我们要培养自己的独立分析问题，和解决问题的能力。培养这种能力的前题是你对每次实验的态度。如果你在实验这方面很随便，抱着等老师教你怎么做，拿同学的报告去抄，尽管你的成绩会很高，但对将来工作是不利的。我们做实验绝对不能人云亦云，要有自己的看法，这样我们就要有充分的准备，
9、若是做了也不知道是个什么实验，那么做了也是白做。我们必须坚持理论联系实际的思想，以实践证实理论，从实践中加深对理论知识的理解和掌握。实验是我们快速认识和掌握理论知识的一条重要途径。
8、 从结果中的误差分析
查阅文献资料得知 脯氨酸，甘氨酸，亮氨酸在酸相的Rf值分别为：0.48，0.30，0.79。而我实验结果的分别为：0.3125、0.2143、0.7375.结果明显偏小。分析实验过程的得知实验误差原因有：
1、 层析溶液酸系统的配制时没有充分摇匀。
2、 层析时间太短，氨基酸没有完全跑出来。
3、 原点到层析点和原点到前沿的距离测量误差。
4、 层析液配制没有严格按照实验说明配比配制。
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