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1、银柱蛋白纯化
一、原理 镇柱里面含有琼脂糖微球体，在琼脂糖鳌合介质的作用下微球体与NI2+ 发生螯合，螯合后的M2+能与HIS上的咪嘎环发生特殊的相互作用，从而 实现蛋白质的分离。影响蛋白质/多肽与金属离子鳌合力大小的因素主要是 蛋白质表面可结合的氨基酸（种类、数目和分布）、金属离子的种类和密 度、层析条件（PH、盐的种类和浓度、添加剂等）
二、缓冲液的配制（500ml PH = 7.4）
Binding buffer: PBr 50ml
2、
5mM 0.45g
《10 mM 0.9g
15 mM 1.35g
20 mM 1.8g
40Mm 3.6g
Elution buffer:
PB
50ml
Nacl 14.625g
100 mM 9g
200mM 18g
400mM 咪嘎 45g
bOOmM 咪嘎 63g
三、操作步骤
此步骤过银柱的所有溶液、上清蛋白都要先用滤膜过滤，所有液体过镇 柱的速度要严格控制2.5ml/min,中间银柱不能进气泡
工、5倍银柱体积去离子水洗涤，去除空气和20%乙醇(5ml/mm)
2、5~10倍银柱体积Binding buffer平衡
3、上蛋白样品
4、5倍银
3、柱体积Wsahing buffer洗脱杂蛋白(HIS标签含有6个组氨酸，
结合能力强于含有单个组氨酸的杂蛋白)，此步骤设洗脱梯度
5、5倍银柱体积Elution buffer洗脱目的蛋白，此步骤设洗脱梯度
6、5倍体积去离子水清洗掉缓冲液
7、20%乙醇保存于4C0
注意：洗脱可能会把金属离子和蛋白质的复合物一起洗下来
四、镇柱重生(介质使用约3-20次，具体与原料来源、样品体积等有关)
1. 银柱用去离子水清洗
2. 5 倍银柱体积 EDTA 重生银柱(20 mM PB + 0.5 M NaCI +50 mM EDTA, pH 7.4)
3. 5 倍体积 Binding b
4、uffe「平衡
4. 5倍体积去离子水清洗
5. 20倍体积IM NaoH洗涤
6. 水洗至中性
7. 5倍柱体积挂银
8. 用5倍体积以上的纯水清洗层析柱.去除游离的金属离子
9. 20%乙醇保存4C
五、注意事项
1、推荐在中性至弱碱性的条件下（PH7〜8）结合重组蛋白，磷酸盐Buffer 是常用的缓冲液,Tnc-cl在一般情况下可用，但要注意它会降低结合强度 2、避免在Buffer中包含EDTA或柠檬酸盐等螯合剂
3、若重组蛋白以包涵体形式表达,在所有Buffe「中添加6M盐酸胭或8M 尿素
4、避免缓冲液中有高浓度的供电子基团, 如：NH4,甘氨酸，精氨酸.
Tris
5、各种Buffe「中不能含有高浓度的强还原剂，比如DTT,防止二价NI被 还原
6、不能含有离子型的去垢剂，比如SDS,防止Ni流失
7、Buffe「里可加入甘油，防止蛋白之间由于疏水相互作用而发生聚集沉淀, 甘油浓度可高达50%
8、Buffer中Nacl浓度应在300 Mm 〜2M之间
9、可加入非离子型去垢剂
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镍柱蛋白纯化
