猪和家禽的可食性组织中维吉尼亚霉素M1残留量的测定 液相色谱-串联质谱法（征求意见稿）

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1、 中华人民共和国国家标准 GB- 代替GB/T20765-2006 食品安全国家标准 猪和家禽的可食性组织中 维吉尼亚霉素M1残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 National food safety standards- Determination of virginiamycin M1 residue in edible tissues of swine and poultry by liquid chromatography tandem mass spectrometry method （征求意见稿） --发布

2、 --实施 中华人民共和国农业农村部 中华人民共和国卫生健康委员会 国家市场监督管理总局 发布  前 言 本标准按照 GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规则起草。 本标准代替GB/T20765-2006《猪肝脏、肾脏、肌肉组织中维吉尼亚霉素M1残留量的测定 液相色谱-串联质谱法》。 本标准与GB/T20765-2006相比：主要变化如下： —标准文本格式修订为食品安全国家标准文本格式 —标准范围中增加了家禽可食性组织和猪的脂肪中维吉尼亚霉素M1残留

3、检测方法 —简化原标准中组织中药物的提取净化过程，将原标准中提取液改成了乙腈，去除了固相萃取的过程，避免使用有毒试剂三氯甲烷。 本标准所代替标准的历次版本发布情况为： —GB/T20765-2006 1 食品安全国家标准 猪和家禽的可食性组织中维吉尼亚霉素M1残留量的测定 液相色谱 串联质谱法 1　 范围 本标准规定了猪和家禽可食性组织中维吉尼亚霉素M1残留检测的制样和液相色谱-串联质谱测定方法。 本标准适用于猪和家禽（包括鸡、鸭和鹅）的肌肉、肝脏、肾脏及皮脂中维吉尼亚霉素M1残留量的检测。 2　 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可

4、少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法。 3　 原理 试料中残留的维吉尼亚霉素M1，用乙腈提取，正己烷除脂，液相色谱-串联质谱检测，外标法定量。 4　 试剂和材料 以下所用的试剂，除特别注明者外均为分析纯试剂；水为符合GB/T 6682规定的一级水。 4.1　 试剂 4.1.1　 乙腈（CH3CN）：色谱纯。 4.1.2　 甲酸（HCOOH）：色谱纯。 4.1.3　 乙腈（CH3CN） 4.1.4　 正己烷（C6H14） 4.

5、2　 溶液配制 4.2.1　 乙腈溶液：取乙腈600mL、水400mL，混匀。 4.2.2　 0.1％甲酸溶液：取甲酸1 mL，用水稀释至1000 mL，混匀。 4.3　 标准品 维吉尼亚霉素M1（virginiamycin M1，C28H35N3O7，CAS 号:21411-53-0）含量≥90%。 4.4　 标准溶液制备 4.4.1　 标准储备液：取维吉尼亚霉素M1标准品10mg，精密称定，用乙腈适量使溶解并稀释定容至200mL棕色容量瓶，配制成浓度为50 μg/mL的维吉尼亚霉素M1标准储备液。4℃以下保存，有效期7天。 4.4.2　 标准中间液：准确量取标准储备液0.1、

6、0.5、1、2、和3 mL，分别置50 mL棕色容量瓶中，用乙腈稀释至刻度，配制成浓度为0.1、0.5、1、2和3μg /mL的维吉尼亚霉素M1标准中间液。4℃以下保存，有效期7天。 4.5　 材料 4.5.1　 刻度试管：10 mL。 4.5.2　 有机滤膜：0.22 μm。 5　 仪器和设备 5.1　 液相色谱－串联质谱仪：配电喷雾电离源。 5.2　 分析天平：感量0.00001 g和0.01 g。 5.3　 均质机 5.4　 超声仪 5.5　 离心机：＞5000 r/min。 5.6　 涡旋振荡器 5.7　 移液器 6　 试料的制备与保存 6.1　 试料

7、的制备 取适量新鲜或解冻的空白或供试组织，绞碎并使均质。 ——取均质的供试样品，作为供试试料。 ——取均质的空白样品，作为空白试料。 ——取均质的空白样品，添加适宜浓度的标准工作液，作为空白添加试料。 6.2　 试料的保存 -40℃以下保存，避免反复冻融。 7　 测定步骤 7.1　 提取 取试料2g（准确至0.02g），加乙腈4ml（肌肉组织先加水2 ml），涡旋 2 min，超声 30 min，4 000 r/min离心10 min，取上清液转移至15mL具塞离心管中。残渣加乙腈2 mL重复提取一遍，合并上清液，备用。 7.2　 净化 取备用液，加水至约9.5

8、mL，涡旋混合30s加正己烷3 mL，涡旋 30s，4 000 r/min离心 10 min，弃去上层正己烷，重复除脂一次。将下层溶液转移至10mL刻度试管中，加水至 10 mL，涡旋混合 30 s，备用。取备用液（肝脏：取备用液2.0ml，加乙腈溶液4.0ml，混匀；肾脏、皮脂：取备用液2.0ml，加乙腈溶液6.0ml，混匀），过滤，供液相色谱-串联质谱法测定。 7.3　 标准曲线的制备 7.3.1 家禽肌肉、肝脏基质匹配标准曲线的制备 准确量取浓度为0.1、0.5、1、2和3 μg /mL的维吉尼亚霉素M1标准中间液各200 μL，分别加于按7.1和7.2正己烷除脂处理后的空白组

9、织提取液中，加水至10mL，混匀，同法处理。制备成维吉尼亚霉素M1浓度为2、10、20、40和60 ng/mL的系列基质匹配标准溶液，过滤，临用现配，供液相色谱联用质谱仪测定。以测得特征离子峰面积为纵坐标，对应的标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线。求回归方程和相关系数。 7.3.2 其他组织标准曲线的制备： 分别准确量取浓度为0.1、0.5、1、2和3 μg /mL的维吉尼亚霉素M1标准中间液各200 μL，加乙腈溶液至10.0 mL，配制成维吉尼亚霉素M1浓度为2、10、20、40和60 ng/mL系列标准工作液，临用现配，供液相色谱联用质谱仪测定。以测得特征离子峰面积为纵坐标，对应的标

10、准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线。求回归方程和相关系数。 7.4　 测定 7.4.1　 色谱条件 a) 色谱柱：C18（100mm2.1mm，1.7 m），或相当者； b) 柱温：30℃； c) 进样量：5 mL； d) 流速：0.2 mL/min； e) 流动相：A：乙腈；B：0.1％甲酸水溶液，梯度洗脱程序见表1； 表1 梯度洗脱程序 Time（min） A（%） B（%） 0 30 70 1 30 70 3 42 58 6 42 58 6.5 95 5 8.5 95 5 9 30 70 10 30 70

11、7.4.2　 质谱条件 a) 离子源：电喷雾离子源； b) 扫描方式：正离子扫描； c) 检测方式：多反应监测（MRM）； d) 离子源温度：150℃； e) 脱溶剂温度：200℃； f) 毛细管电压：3.0k V； g) 脱溶剂气流速：800L/h。 h) 锥孔反吹气流速：150L/h。 i) 定性离子对、定量离子对、锥孔电压和碰撞能量见表2。 表2 药物的定性、定量离子对及锥孔电压、碰撞能量的参考值 化合物 定量离子对 m/z 定性离子对 m/z 碰撞能量 eV 锥孔电压 V 维吉尼亚霉素M1 526.3>355.1 526.3>355.1

12、 18 20 526.3>337.1 22 20 7.5　 测定法 7.5.1　 定性测定 在相同的测试条件下，试料溶液中维吉尼亚霉素M1色谱图的保留时间与相应标准工作液中保留时间偏差应不大于2.5％；且检测到的离子的相对丰度，应当与浓度相当的标准溶液相对丰度一致。其允许偏差应符合表3要求。 表3 定性测定时相对离子丰度的最大允许偏差 相对离子丰度 ＞50% ＞20%至50% ＞10%至20% ≤10% 允许的最大偏差 20% 25% 30% 50% 7.5.2　 定量测定 取试料溶液和相应的基质匹配标准工作液/标准工作液，作单点或多点校准，按

13、外标法以峰面积定量，基质匹配标准工作液/标准工作液及试料溶液中的维吉尼亚霉素M1响应值均应在仪器检测的线性范围内。在上述色谱-质谱条件下，维吉尼亚霉素M1基质匹配标准溶液的特征离子质量色谱图见附录A。 7.6　 空白试验 取空白试料，除不加药物外，采用完全相同的步骤进行平行操作。 8　 结果计算 试样中维吉尼亚霉素M1残留量按标准曲线或式（1）计算： X=ACSVASmf…………………………………….…….……………(1) 式中： X-试样中维吉尼亚霉素M1残留量，单位为微克每千克（μg/kg）； CS-标准工作液中维吉尼亚霉素M1浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；

14、A-试料溶液中维吉尼亚霉素M1峰面积； AS-标准工作液中维吉尼亚霉素M1峰面积； V-定容后溶液体积，单位为毫升（mL）； f —稀释倍数 m-供试试料质量，单位为克（g）。 注：计算结果需扣除空白值，测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留三位有效数字。检测方法灵敏度、准确度和精密度 8.1　 灵敏度 本方法维吉尼亚霉素M1在肌肉、肝脏、肾脏和皮脂的检测限分别为2μg/kg、6μg/kg、8μg/kg和8μg/kg，肌肉的定量限为10μg/kg，其他组织定量限为50μg/kg。 8.2　 准确度 本方法维吉尼亚霉素M1在家禽和猪肌肉组织10μg/kg～200μg/kg、肝脏和肾脏组织50μg/kg～600μg/kg、皮脂组织50μg/kg～800μg/kg测定浓度水平上的回收率为70%～130％。 8.3　 精密度 本方法批内相对标准偏差≤20%，批间相对标准偏差≤30%。 附 录A (资料性附录) 色谱图 3 2 1 说明：1-M1特征离子质量色谱图（526.3>355.1） 2-M1特征离子质量色谱图（526.3>337.1） 3-M1总离子质量色谱图 图 A.1 维吉尼亚霉素M1标准溶液特征离子质量色谱图(20 ng/mL) 6