SDS-PAGE电泳实验步骤

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1、 一、实验目的 学习 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法 (SDS— PAGE)测定蛋白质的分子量的原理和基本操作技术。 二、实验原理 蛋白质是两性电解质，在一定的 pH 条件下解离而带电荷。当溶液的 pH 大于蛋白 质的等电点 (pI) 时，蛋白质本身带负电，在电场中将向正极移动；当溶液的 pH 小于蛋 白质的等电点时，蛋白质带正电，在电场中将向负极移动；蛋白质在特定电场中移动 的速度取决于其本身所带的净电荷的多少、蛋白质颗粒的大小和分子形状、电场强度 等。 聚丙烯酰胺凝胶是由一定量的丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚

2、合而成的三 维网状孔结 构。本实验采用不连续凝胶系统，调整双丙烯酰胺用量的多少，可制成不同孔径的 两层凝胶；这样，当含有不同分子量的蛋白质溶液通过这两层凝胶时，受阻滞的程 度不同而表现出不同的迁移率。由于上层胶的孔径较大，不同大小的蛋白质分子在 通过大孔胶时，受到的阻滞基本相同，因此以相同的速率移动；当进入小孔胶时， 分子量大的蛋白质移动速度减慢，因而在两层凝胶的界面处，样品被压缩成很窄的 区带。这就是常说的浓缩效应和分子筛效应。同时，在制备上层胶 ( 浓缩胶 ) 和下层胶 ( 分离胶 ) 时，采用两种缓冲体系；上层胶 pH=—，下层胶 pH＝； Tris

3、 — HCI 缓冲液中的 Tris 用于维持溶液的电中性及 pH，是缓冲配对离子； CI - 是前导离子。在时， - 胶之间 pH 的不连续性， 控制了慢离子的解离度， 进而达到控制其有效迁移率之目的。 不同蛋白质具有不同的等电点，在进入分离胶后，各种蛋白质由于所带的静电荷不 同，而有不同的迁移率。由于在聚丙烯酰胺凝胶电泳中存在的浓缩效应，分子筛效 应及电荷效应，使不同的蛋白质在同一电场中达到有效的分离。 如果在聚丙烯酰胺凝胶中加入一定浓度的十二烷基硫酸钠 (SDS) ，由于 SDS 带 有大量的负电荷，且这种阴离子表面活性剂能使蛋白质变性，特别是在

4、强还原剂如巯基乙醇存在下，蛋白质分子内的二硫键被还原，肽链完全伸展，使蛋白质分子与 SDS 充分结合，形成带负电性的蛋白质— SDS 复合物；此时，蛋白质分子上所带的负 电荷量远远超过蛋白质分子原有的电荷量， 掩盖了不同蛋白质间所带电荷上的差异。 蛋白质分子量愈小，在电场中移动得愈快；反之，愈慢。蛋白质的分子量与电泳迁 移率之间的关系是： r -b · m r m M =K(10 ) logM =LogK — b· R ， 式中 M r ——蛋白质的分子量； logK ——截距； b——斜率； Rm ——相

5、对迁移率。 实验证明，蛋白质分子量在 15,000 — 200,000 的范围内，电泳迁移率与分子量 的对数之间呈线性关系。 蛋白质的相对迁移率 Rm＝蛋白质样品的迁移距离／染料 ( 溴 酚蓝 ) 迁移距离。这样，在同一电场中进行电泳，把标准蛋白质的相对迁移率与相应的蛋白质分子量对数作图，由未知蛋白的相对迁移率可从标准曲线上求出它的分子 量。 SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE) 法测定蛋白质的分子量具有简便、 快速、 重 复性好的优点，是目前一般实验室常用的测定蛋白质分子量的方法。 三、试剂及主要器材 1

6、．主要试剂 1) 标准蛋白混合液 内含：兔磷酸化酶 B(Mw 97,400) ，牛血清蛋白 (Mw 66,200) ，兔肌动蛋白 (Mw 43,000) ， 牛磷酸酐酶 (Mw 31,000) 和鸡蛋清溶菌酶 (Mw 14,400) 2)30 ％ 凝 胶贮 备 液 ：丙烯 酰 胺（ Acr ） 29.2g ， 亚甲 基 双 丙烯 酰 胺 （ Bis ） 0.8g, 加双蒸水至 100mL。外包锡纸， 4℃冰箱保存， 30 天内使用。 3) 分离胶缓冲液／ L): Tris 18.17g, 加双蒸水溶解 ,6m

7、ol/L HCl 调 , 定容 100mL。 4℃ 冰箱保存 4) 浓缩胶缓冲液／ L): Tris 6.06g, 加水溶解， 6mol/L HCl 调，并定容到100mL。 4℃冰箱保存 5) 电极缓冲液： SDS lg ， Tris 3g ， Gly 14.4g ，加双蒸水溶解并定容到 1000mL。4℃冰箱 保存。 6)10 ％ SDS，室温保存 7) 质量浓度 10％过硫酸铵 ( 新鲜配制 ) 8) 上样缓冲液：／ L Tris-HCl ，甘油 2mL，

8、10％ SDS 2mL，β - 巯基乙醇 1mL，％ 溴酚蓝，加蒸馏水定溶至 10mL。 9) ％考马斯亮蓝 R-250 染色液： 0.25g 考 马 斯 亮 蓝 R250，加 入 91ml50% 甲 醇 ， 9ml 冰 醋 酸 10) 脱 色 液 ： 50ml 甲 醇 ， 75ml 冰 醋酸 与 875ml 双 蒸 水混 合 11) 未知分子量的蛋白质样品 (1mg ／ mL ) 2．实验器材 1) DYCZ-24D 垂直板电泳槽 ( 北京市六一仪器厂 ) 2) 电泳仪 3) 长滴管及微量加样

9、器 4) 烧杯 (250mL 、 500m1) 、 量 筒 (500mL 、 250m1) 、 培 养皿 (15cm l5cm) 5) 注射器等 四、实验操作 1． 装板 将密封用硅胶框放在平玻璃上，然后将凹型玻璃与平玻璃重叠，将两块玻璃立起来使底端接触桌面，用手将两块玻璃夹住放入电泳槽内，然后插入斜插板到适中 程度 , 即可灌胶。 2． 凝胶的聚合 分离胶和浓缩胶的制备： 按下表中溶液的顺序及比例， 配置 10％的分离胶和％的浓缩胶。 试剂名称 10%的分离胶 5%的浓缩胶 Acr/Bis 30%/ml

10、 分离胶缓冲液（） /ml 0 浓缩胶缓冲液（） 0 10%SDS/ml 10%过硫酸铵 /ul 50 25 双蒸水 /ml TEMED/ul 5 5 按上表各液加入混匀后配制成分离胶后，将凝胶液沿凝胶腔的长玻璃板的内面缓 缓用滴管滴入，小心不要产生气泡。将胶液加到距短玻璃板上沿 2cm 处为止 , 约 5mL。 然后用细滴管或注射器仔细注入少量水 , 约。室温放置聚合 30-40min 。 待分离胶聚合后，用滤纸条轻轻吸去分离胶表面的水分，按上表制备浓缩胶。用 长滴管小心加到分离胶的上面，插入样品模

11、子 ( 梳子 ) ；待浓缩胶聚合后，小心拔出样 品模子。 3 ．蛋白质样品的处理 若标准蛋白质或欲分离的蛋白质样品是固体，称取 lmg 的样品溶解于 lmL ／ L 盐 酸缓冲液或蒸馏水中；若样品是液体，要测定蛋白质浓度，按～／ mL溶液比例，取蛋 白质样液与样品处理液等体积混匀。 本实验所用样品为 15～ 20 g 的标准蛋白样品溶 液，放置在的离心管中，加入 15— 20 l 的样品处理液。在 100 ℃水浴中处理 2min ， 冷却至室温后备用。 吸取未知分子量的蛋白质样品 20 l ，按照标准蛋白的处理方法进行处理。 4． 加样

12、 SDS-聚丙烯酰胺凝胶垂直板型电泳的加样方法 用手夹住两块玻璃板 , 上提斜插板使其松开 , 然后取下玻璃胶室去掉密封用硅胶 框 , 注意在上述过程中手始终给玻璃胶室一个夹紧力 , 再将玻璃胶室凹面朝里置入电 泳槽 , 插入斜板 , 将缓冲液加至内槽玻璃凹面以上 , 外槽缓冲液加到距平板玻璃上沿 3mm处即可 , 注意避免在电泳槽内出现气泡。 加样时可用加样器斜靠在提手边缘的凹槽内，以准确定  位加样位置，或用微量 注射器依次在各样品槽内加样，各加 20 ～ 30 l ( 还要根据胶的厚度灵活掌握  10～ 15 ) 。

13、  l(  含蛋白质  10～ 15  g) ，稀溶液可加 5．电泳 加样完毕，盖好上盖，连接电泳仪，打开电泳仪开关后，样品进胶前电流控制 在 15～ 20mA，大约 15 ～ 20min ；样品中的溴酚蓝指示剂到达分离胶之后，电流升到 30 ～ 45mA，电泳过程保持电流稳定。 当溴酚蓝指示剂迁移到距前沿 1～ 2cm 处即停止 电泳，约 1-2 小时。如室温高，打开电泳槽循环水，降低电泳温度。 6．染色、脱色 电泳结束后，关掉 电源，取出玻璃板，在长短两块玻璃板下角空隙内，用刀轻 轻撬动，即将胶面与一块玻璃板分

14、开，然后轻轻将胶片托起，指示剂区带中心插入 铜丝作为标志，放入大培养皿中染色，使用％的考马斯亮蓝染液，染色 2 ～ 4h，必 要时可过夜。 弃去染色液，用蒸馏水把胶面漂洗几次，然后加入脱色液，进行扩散脱色，经常换脱色液，直至蛋白质带清晰为止。 7．结果处理 1) 测量脱色后凝胶板的长度和每个蛋白质样品移动距离 ( 即蛋白质带中心到加样孔 的距离 ) ，测量指示染料迁移的距离。 2) 按以下公式计算蛋白质样品的相对迁移率 (Rm) 相对迁移率＝样品迁移距离 (cm) ／染料迁移距离 (cm)

15、3) 标准曲线的制作：以各标准蛋白质相对迁移率为横坐标，蛋白质分子量的对数为纵坐标在半对数坐标纸上做图，得到一条标准曲线。 4) 测定蛋白质样品的分子量：根据待测蛋白质样品的相对迁移率，从标准曲线上查得该蛋白质的分子量。 五、思考题 1． 聚丙烯酰胺盘状凝胶电泳的几个不连续性是什么？ 2． 电泳时的三个物理效应是什么？是怎样造成的？ 3． 电泳后上下槽缓冲液可否混合后再使用？为什么？ 4． 上样缓冲液中加入甘油的作用是什么？ 5． 贮液配制及贮存应注意什么？ 6．过硫酸铵、 7%乙酸和考马斯亮蓝在实验中有什么作用？ 附：不同分离胶的配制方法 分离胶的浓度 20% 15% 12% 10% % 双蒸水 /ml L Tris-Hcl/ml 10%SDS/ml 凝胶储备液 （ Acr/Bis ） /ml 10%过硫酸铵 /ul 50 50 50 50 50 TEMED/ul 5 5 5 5 5 总体积 /ml 10 10 10 10 10