琼脂糖凝胶电泳浓度与dna长度的确定

《琼脂糖凝胶电泳浓度与dna长度的确定》由会员分享，可在线阅读，更多相关《琼脂糖凝胶电泳浓度与dna长度的确定（6页珍藏版）》请在装配图网上搜索。

1、琼脂糖凝胶电泳：胶浓度与 DNA长度的 • 2010年1月22日 1,527 views Biology *没有评论 分离不同大小的DNA片段所用的最适凝胶浓度是不同的，数据见下表。 凝胶浓度（% 线性DNA长度（bp） 0.5 1000〜30000 0.7 800〜12000 1.0 500〜10000 1.2 400〜7000 1.5 200〜3000 2.0 50〜2000 胶回收DNA注意事项 ① 切胶回收DNA片段是要把整个目的片断所在位置的胶全部回收。 所以为了 减少胶的体积，我们就可以用相对比较薄的胶来跑电泳，通常只要够点

2、样即可， 或是采用薄而宽的梳子来跑胶。这样可减少回收试剂引起的一些后续麻烦。 ② 主要还是DNA勺浓度，如果DNA浓度不够，想胶小点也不可能。 ③ 紫外灯下切下含待回收DNA勺凝胶时，要衬以干净的塑料薄膜，使用无 DNA亏染的新刀片，其目的在于防止外源 DNA勺污染。 ④ 利用凝胶回收试剂盒DNA回收效率较低或者未回收到目的片段可能有以 下几个原因：胶块未完全溶解，可适当延长水浴时间，并增加上下颠倒次数辅助 溶解；胶块体积太大，应先将其切为小块，分多次回收；电泳缓冲液 pH太高， 硅基质膜在高盐低pH结合DNA如pH太高，应作适当调整；漂洗液中未加入无 水乙醇。 ⑤ 可以改用去离

3、子水洗脱。但是实验室所用纯水一般 pH偏低，可利用NaOH 适当调高其pH值，以增加洗脱得率。 ⑥ 洗脱产物含有残留的乙醇会影响后续酶切实验，请确保彻底去除漂洗缓冲 液，具体方法参见回收效率低的解决方案。 ⑦ 不可以使用更小洗脱体积（小于说明书提供的最小洗脱体积） 进行洗脱以 提高浓度，因为说明书提供的最少洗脱体积是能完全覆盖吸附膜的最小体积， 若 减少体积则不能将DNA完全洗脱下来。 ⑧ 电泳检测只有一条目的带，可以选用凝胶回收试剂盒。如果后续实验对片 段纯度要求较高，建议即使只有一条带，也可以切胶纯化，其回收得到片段的纯 度可能要比直接回收高一些。 ⑨ 琼脂糖凝胶胶块不溶可能是下

4、述原因： 琼脂糖质量不好；含目的片段的凝 胶再空气中放置过久，使胶块失水、干燥，建议切胶后立即进行回收或将胶块保 存在4C或-20C ;制胶的电泳缓冲液浓度过高或陈旧。 关于胶回收切胶的一点注意事项 1. 电泳的buffer和gel都是新制的，切胶的台子清理干净，刀片最好洗净 灭菌，总之一句话就是保证切下的带没有外源 dna污染。 2. 切胶是要把整个目的片断所在位置的胶全部回收。为了减少胶的体积，可以 用相对比较薄的胶来做，只要够点样即可，也可采用薄而宽的梳子来跑胶。 3. 关于防护，在一般有机玻璃后就足够了，戴上防护面具以保护眼睛，如果戴 树脂眼镜就可以了。要是非常害怕紫外照射，或

5、者对于胶有特殊要求，例如要求 不含EB，可以采用点marker和带刻度的尺子一起照相的方法来确定目的条带 在胶上的位置进行切胶。 4. 按照正常程序点marker跑胶，然后切下有marker的胶，EB染色，紫外 灯下与带刻度的尺子一起照相。由于要回收的带与 marker间的相对位置已知， 根据尺子来衡量未染色胶上目的带的位置即可。 如果觉得很难判断，可以直接在 marker边点少量的样，这样位置就容易确定了。 胶回收 一. 提高胶回收量的办法： 1） 增加电泳时的上样量。 2） 电泳缓冲液用新鲜配制的。 3） 切胶时尽量只切有条带的胶，减小切胶体积：含目的片断很少的胶就不要要 了

6、，不然影响回收率。 4） 把切的两块或多块胶融化后，无论多大的体积都用一个管子，转移到同一个 柱子上。 5） 溶胶时所加的溶液可多一点，这样更有利于 DNA与膜的结合，不过一般不要 多余750ul。 6） 胶回收的关键是通过柱子的溶液的盐浓度、酸碱性（电荷）和疏水性使 DNA 与柱子结合，因此，若电泳缓冲液的 PH偏高，可在溶胶液中加入10ul（ PH5.0， 3mol/L的NaAC ；为了使DNA分子更好的拦截在膜上，可以添加30%异丙醇在 加热溶解胶后的液体里。 7） 加洗脱液之前，将柱子在室温放置几分钟（大约需 10分钟），以使乙醇充分 挥发。 H最后少加些洗脱液，尽量减少回收

7、体积，一般用 30-50卩l洗脱液洗脱（不能 太少，否则无法浸湿膜反而不利于洗脱）；洗脱液滴在膜中央，以充分洗脱结合 在膜上的DNA 9） 可以在加入洗脱液之后，可以在55度水浴5分钟或放在50度水浴10分钟以 上再洗脱，或用封口膜密封4度过夜，第二天再离心回收，效果不错。 10） 将离心后的洗脱液加回吸附柱，再次离心。 二. 几种PCR产物回收的详方法和步骤 1）普通胶回收 如果要胶回收，最好还是用试剂盒，方便，回收率也略高，实在要手工回收，可 以切胶后加入3倍体积TE,水浴熔化后，酚、酚/氯仿抽提干净，乙醇沉淀即 可。另外好像还有冷冻法，没作过，不是很清楚。 2） 从低熔点凝胶

8、回收 DNA 纯化 DNA片段 加与凝胶体积相等的 TE（ 10mmol/l Tris-HCI pH8.0 ，0.1mmol/l EDTA，置65C水浴5分钟保温，使凝胶完全溶解。待放至室温，加等量酚（TE 饱和，TE封在上层，取下层酚），轻轻混匀（不用混匀），12000rpm, 3分钟离 心。反复1-2次。取上层液，加0.1体积3mol/L醋酸钠（pH5.2）和2.5倍体积 无水乙醇，进行乙醇沉淀。将纯化的 DNA加适量TE溶解，测定含量，备用（可 用于目的基因结构分析，探针制备等）。 3） 扩增特异性好的PCF回收 如果PCRT增特异性好，只是简单的PCF产物纯化回收，可以在PCF

9、产物中加入 50ug/ml的蛋白酶K, 37度1h，酚/氯仿抽提一次，氯仿抽提一次，上清加入 0.1 体积的醋酸钠， 2.5 体积的无水乙醇沉淀回收。 三. 不需胶回收就可直接连接的方法 1） 低温冷冻析出法 跑电泳时用低熔点的 agarose 胶，跑到一定时候， 将目的条带所在的那一段胶切 下，尽量切干净，让核酸直接暴露在胶的表面，并且，把底下没有脱氧核酸的那 点胶也尽量切掉，然后放入 1.5ml EP 管中，然后放在负 75度冰箱中 10－30分 钟，接着1, 300rpm离心5- 10分钟，取10ul上清，加入连接体系中。将其余 的液体也吸出，储存在另一个管子中，做好标记，放在－

10、20 度备用。 2） 酶切后的直接连接 在你酶切后可以直接的加入连接酶和另外的片断进行连接是可以筛选出连接好 的片断的 . 四、 一些注意事项 1. 电泳的 buffer 和 gel 都是新制的， 切胶的台子清理干净， 刀片最好洗净灭菌， 总之一句话就是保证切下的带没有外源 DNA亏染。 2. 切胶是要把整个目的片断所在位置的胶全部回收。 为了减少胶的体积， 可以用 相对比较薄的胶来做，只要够点样即可，也可采用薄而宽的梳子来跑胶。 3. 关于防护， 在一般有机玻璃后就足够了， 戴上防护面具以保护眼睛， 如果你戴 树脂眼镜就可以了。 4. 琼脂糖对回收率有一定影响， 如果琼脂糖较多

11、， 可以增加溶胶液， 保证体系盐 浓度。影响回收率的因素主要是柱子填料必须在适宜的缓冲环境中 （如果用柱子 的话）。对于小于10 Obp的片段回收，可加至 30%异丙醇。 5. 如果是用PAG创收，用水或TE溶解，枪头捣碎，过夜浸泡，即可。当然你要 将100bp在胶中位置定好切下。已标记的探针用 X片，未标记的用EB 6. 选用回收效率较高的柱子，比如进口的 Qiaquick spin column 。 7. 参照分子克隆用低熔点胶回收。除低熔点凝胶回收法外，如用一般凝胶可用透 析带短暂电泳，离心管低部加玻璃棉，高速离心等方法回收 DNA片段。 附注： 1 •影响DNA在琼脂糖

12、凝胶中迁移速率的因素： 1） DNA分子大小 迁移速率U与logN成反比（N为碱基对数目）。分子大小相等， 电荷基本相等（DNA结构重复性）。分子越大，迁移越慢。等量的空间结构紧密 的电泳快（超螺旋 ＞线性DNA 2） 琼脂糖浓度：logU=logUO Krt胶浓度，U为迁移率，U0为DNA的自由电泳 迁移率，t为胶浓度，Kr为介质阻滞系数。不同的凝胶浓度，分辨不同范围的 DNA Agarose: 0.5% : 1-30 kb ; 0.7% : 0.8-12 kb 1.2%: 0.4-7 kb ; 1.5%: 0.2-3 kb. 3） DNA构象：一般迁移速率超螺旋环状 ＞线状DN

13、A单链开环。当条件变化时，情 况会相反，还与琼脂糖的浓度、电流强度、离子强度及 EB含量有关。 4） 所加电压：低电压时，线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。 使分辨效 果好，凝胶上所加电压不应超过 5V/cm 5） 碱基组成与温度：一般影响不大 4 -30 C 6） 嵌入染料的存在：降低线性 DNA迁移率，（不提倡加在电泳液中） 7） 电泳缓冲液 （0.5 X TBE的组成及其离子强度影响 DNA的迁移率，无离子存 在时，核酸基本不泳动，离子强度过大产热厉害，熔化凝胶并导致 DNA变性，一 般采用 1X TAE 1X TBE 1X TPE（均含 EDTA pH8.0。 2•溴化乙锭（EB为致癌剂，操作时应戴手套，尽量减少台面污染。 3.电泳指示剂：核酸电泳常用的指示剂有两种，溴酚蓝（bromophenol blue, Bb） 呈蓝紫色；二甲苯晴（xylene cyanol, Xc ）呈蓝色，它携带的电荷量比溴酚蓝 少，在凝胶中的的迁移率比溴酚蓝慢。