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1、分子克隆第三版有详细介绍，结合其中的示意图很容易理解
GST融合蛋白沉降技术利用了 GST对谷胧甘肤偶联球珠的亲和性，从非相互作用蛋白的溶液中
纯化相互作用蛋白。 GST融合的探针蛋白从细菌中表达和纯化，并平行制备细胞裂解液 （可被
35S标记或非标记），再将GST融合蛋白探针和细胞裂解液在谷胧甘肤琼脂糖球珠存在下混合并 孵育，以使蛋白结合。GST融合探针蛋白和任何结合分子被离心收集，获得的混合物经洗涤后， 用过量游离的谷胧甘肤洗脱或直接在 SDS-PAGE上样缓冲液中煮沸。蛋白质经SDS-PAGE分离后
进行下一步的 western印迹、放射自显影及蛋白质染色分析。 GST沉降技术对
2、探测蛋白在溶液
中的相互作用特别有用，而这种相互作用在膜的分析中可能是检测不到的。
GST沉降实验通常有两种应用 ：确定融合（或探针）蛋白与未知（或靶）蛋白间
新的相互作用（Kaelin et al. 1991, Grlinick and Chao 1996）, 以及证实探针蛋白与已知蛋白质间可
疑的相互作用（例子请见 Posern et al. 199$, Grgureaich et al. 1999, Hunteret al. 1999, Sun et al.
1999）。这两种实验的设计和实施都有所不同。
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GST pull down 是一种在体外研究蛋白质相互作用的方法，基本原理是这样的：假定 A 蛋白和 B 蛋白可能有相互作用，我们就将其中一个蛋白比如 A 蛋白融合 GST 标签，然后将 GST-A 和 B 以 及能特异结合 GST 的 Sephrose 4B beads 孵育一定时间，然后充分洗涤未结合的蛋白，煮沸 beads 进行
4、 SDS-PAGE 电泳， 然后进行放射自显影 （如果两个蛋白通过体外翻译并且 S35 标记的 话），就可以看见 GST-A和B分别对应的条带， 表明GST-A和B因相互作用而被 GST-A pull down ,
如果没有相互作用，就只有 GST-A 相对应的一条带。我们实验室就是这么做的，当然也有细菌 表达 GST-A 蛋白，而 B 蛋白通过细胞裂解液中得到，电泳后直接 western blot 检测。
1、 首先你的目的是 “要检测这两种蛋白是否与寄主细胞之间存在相互作用 ”，也即是说要寻找这
两种蛋白的相互作用蛋白 --- 在寄主细胞表面，也就是说你要寻找的相互作用蛋白是膜蛋白，
5、对
吗？ pulldown似乎不是达到你目的的最佳办法，因为你首先要提膜蛋白。而膜蛋白一般都疏水， 量少，好像难以 pulldown 缓冲液系统不适合。我想，你真正的目的是检测寄主细胞表面是否
有你这两个蛋白的受体或配体， 细胞 ELISA 应该可以胜任这个目的。 其他方法你可以在查查看？
2、 如何保证你融合蛋白（细胞提取物）的尽可能大的活性，只有一条：快速、低温纯化。即，
要保证你纯化过程尽量低温，时间尽量短，得到蛋白后立刻冻纯 -70 。当然，你还是有必要做下
你蛋白活性到底丧失有多快。
3、 如果你还是执意要做 pulldown ，最好还是直接买珠子，试剂盒太贵了，不划算。
GST-Pull-Down原理
