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1、大肠杆菌DH10B （Streptomycin resistan）电转化感受态制备
1 •从保存的甘油管中取出 200儿菌液到100 mL的LB液体中，37C, 200 rpm
培养约13~16小时后（对数期），按2%接种到SOB培养基中；
2. 37oC，约2~2.5小时后，OD600约0.5左右，取出，冰上缓慢摇育 30 min。
3. 预先4C降温的冷冻离心机离心收集菌体，用预冷的离心管，并时刻保持在 冰上，5000 rpm 离心 5 min ；
4. 用50~60 mL的冰预冷灭菌超纯水洗菌体两次，用枪吸打时一定要轻柔，并 时刻保持在冰上，第二次洗时可以将 2管的菌体并到一
2、管，水洗过程离心的 转速要高一些，约6000 rpm离心5 min，因为离心得不是很实，离心完后要 立即倒掉上清，以免菌体重新悬浮造成损失；
5. 用50 mL的冰预冷灭菌10%甘油洗菌体两次，用枪吸打时一定要轻柔，并时 刻保持在冰上，离心后立即倒掉上清；
6. 最后一次甘油洗涤后立即倒掉上清，视菌体量加入0~x的10%冰预冷甘油 重新悬浮细胞，75~200」L/管,分装到预冷的离心管中，电转化或立即放入 -80C冰箱保存，该感受态可以在-80C保存半年。
SOB培养基（1L）:
20 g Tryptone； 5 g Yeast Extract; 0.6 g NaCI; 0.19 g
3、KCl， 8 磅灭菌 20 min。
注意事项：
种子一定要新鲜，最好是从甘油管中直接液体活化的。
OD600控制在0.5左右，建库用的话千万不要过！过了 0.6感受态效率不会太 高，做一般克隆和质粒转化的要求可以适当放低。
菌体时刻保持冰上（4 C以下）！尽量减少离开冰的时间。
最后分装的菌体浓度要浓。
对待菌体要尽量轻柔。
收集菌体用的管和枪头要灭菌，并在超净台操作。
电击转化
1. 75儿的感受态细胞加入TE溶解的质粒和连接产物最好不要超过 0.6」L ,不
然容易击穿，如果质粒是用纯水溶解的可以适当提高，冰上放置 10~30 min；
2. 洗干净并烘干的电转杯冰
4、上预冷，快速将上述感受态细胞转到电转杯里，感 受态细胞要位于杯子底部；
3. 此步骤动作要快：将杯子外壁擦干，2 mm的杯子用电转化程序Ec2， 1 mm 杯子用电转化程序Ec1,电击后立即加入900~1000 JL37C预热的SOC （见分子 克隆），轻柔吸打，转到2 mL的离心管中，37C摇床，150 rpm，45~60 min后 取适量涂平板。
感受态细胞转化效率检测
1.取已知浓度的pUC19质粒（例如0.1 ngA1 L） 0.2 JL到制备好的75 JL感受态 细胞中，按上述方法转化；
2 .转化后取1 JL涂氨苄LB平板，37C过夜；
3 •数平板上的菌落数，转化效率为每微克DNA (即质粒)转化所长出的单菌落 数，即cfu/」g。举例说明：平板上长出750个单菌落，则转化效率=750 cfu -[(0.20.1 ng/儿)-1000]=3.75X 1010 cfu/
建库用的感受态效率要大于108 cfu/：g DNA。
DH10B菌株感受态制备,电击转化及转化效率检测
