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1、江苏农业科学2016年第44卷第12期 —529 —
张 迹，李 智，张 字，等.一步法制备大肠杆凿BL21(DE3)菌株感受态细胞及转化条件优化［J］・江苏农业科学,2016,44(12):529 -532. doi：10. 15889/j. iasn. 1002 -1302.2016. 12・ 156
一步法制备大肠杆菌BI21 (DE3 )菌株
感受态细胞及转化条件优化
张迹，李智，张宇，袁巧云
(淮阴师范学院生命科学学院/江苏省环洪泽湖生态农业生物技术重点实验室，江苏淮安223300)
摘要:大肠杆菌BL2KDE3)菌株是大肠杆菌表达系统最常用的宿主菌株,因此人们需要1
2、种便捷有效的感受态 细胞制备和转化方法。一步法感受态细胞制备操作方便，只加1种试剂即可，更快捷稳定，转化也更方便，不需要热 激，研究大肠杆菌感受态细胞一步法制备对BI21菌株的适用性，并对转化过程中的关键参数进行探索和优化。结 果表明，该一步法制备的B⑵菌株感受态细胞可获得106 CFU/pg DNA转化效率，完全能够满足常规转化要求。转 化过程中相关参数的最佳条件为冰水浴30 min,室温放置10 min,37 %： J50 r/min振荡复苏40 mina
关键词:感受态细胞制备;一步法;大肠杆菌BI21 ( DE3 )菌株;转化条件
中图分类号：X172 文献标志码：A 文章编号：1
3、002 - 1302(2016) 12 -0529 -03
江苏农业科学2016年第44卷第12期 —529 —
江苏农业科学2016年第44卷第12期 —529 —
在分子生物学试验中,DNA重组技术和外源基因的表达 是最常用的研究手段之一，质粒转化进入大肠杆菌感受态细 胞是其频繁使用的一项基本操作技术。这项技术分为2个部 分，即大肠杆菌感受态细胞的制备和质粒DNA的转化。目 前，制备感受态细胞最常用的方法是CaCl2法"2】和电穿孔 法⑶。电转化法转化效率高，但是需要一套特殊仪器，操作 过程也很繁琐;CaCl2法不需要特殊仪器，操作简便,重复性 好,但耗时较长⑷o
4、 1989年Chung等报道了一步法制备大肠 杆菌感受态细胞,该法操作简便、快捷、重复性好,获得单位质 量转化效率达到IO? ~ 108个/pg单位质量的转化子,能够满 足常规试验要求,并可在-70七下长期保存。一步法感受态 细胞制备及其转化法适用于DH5a、HB101 JM109等多个大 肠杆菌常用菌株⑸。
大肠杆菌表达系统是目前最常用的外源蛋白表达系 统⑹，而大肠杆菌B12KDE3)菌株是该表达系统最常用的宿 主菌株⑴，需要便捷有效的感受态细胞制备和转化方法。本 研究采用一步法制备大肠杆菌BL21菌株的感受态细胞，研 究该方法对BI21菌株的适用性，并对转化过程中的关键参 数进行探索和优
5、化
1材料与方法
1.1茵株与质粒
供试菌株:大肠杆菌B121( DE3)菌株，由笔者所在实验 室保存。
供试质粒：PUC19 (2 686 bp )、pET29a (5 371 bp )、
收稿日期：2015-11 -04
基金项目：国家自然科学基金青年科学基金(编号：31300099)；江苏 省高等学校大学生创新训练计划(编号：2O131O323O46X)o
作者简介:张 迹(1982-),男，江苏宿迁人，博士，讲师，主要从事环 境污染物微生物降解及污染环境微生物修复硏究 zhan^jihnu@ 163・ com0
pET29a-gfp(5 948 bp)c
1.2试刑
6、
质粒抽提试剂盒，购自爱思进生物技术(杭州)有限公 司;IPTG、X - GaL、PEC335O、相关抗生素，均购自生工生物工 程(上海)股份有限公司。其他常规试剂均为国产分析纯。 1.3主要培养基和溶液配方
LB 培养基(1 L)：蛋白腺(Tryptone, OXC1D )10.0 g；酵母 提取物(Yeast extract, 0XC1D )5.0 g;NaCl 5. 0 g;用去离子水 补足1 000 mL,121 高压蒸汽灭菌30 min。配制固体培养 基时加入2%琼脂。
转化与贮存溶液(TSS)：液体LB培养基调pH值为6. 5, 含 10% PEC3350,5%X甲基亚?H.(
7、 DMSO) , 10% 甘油，MgCl2 10 mmol/L,MgS04 10 mmol/L,高压蒸汽灭菌;，
5 x KCM 溶液：KC1 0. 5 mol/L,CaCl2 0. 15 mol/L, MgCl2 0.25 mol/L0该溶液仅需少量配制(以mL计)，过滤除菌，分 装成小份于・20 Y保存备用,可反复冻融二
1.4大肠杆菌BI21苗株一步法感受态细胞的制备
制备方法参照文献［5］所介绍的一步法。活化大肠杆菌 B121菌株，从37七培养过夜的新鲜LB平板中挑取BL21单 菌落,接种到3mLLB液体培养基中,37 X. .200 r/min振荡培 养过夜;取1 mL过夜培养
8、菌液接种入100 mL液体LB培养基 中,37弋.200 r/min振荡培养至久)"=0. 3 ~ 0. 5 (约3 h)； 将培养液转移到灭菌的50 mL离心管中，置冰上10 min； 4七、6 000 r/min离心5 min,弃上清；用10 mL预冷的无菌 TSS重悬菌体细胞;冰上放置10 min,分装120 管(在冰上 操作),-7or保存备用。
1.5 大肠杆苗一步法感受态细胞转化
取无菌的1.5 mL离心管，加入1 jiL待转化质粒,5 x KCM 10 p.L,ddH2O 39 jiL,置冰上;从-70七冰箱中取岀大肠 杆菌B121菌株感受态细胞，立即融化;吸取50 puL感受态细 胞加人上述离心管中,轻轻吹吸使之与上述试剂混匀,冰水浴 20 min,室温放置10 min；加入500 口新鲜液体LB培养基,
一步法制备大肠杆菌BL21(DE3)菌株感受态细胞及转化条件优化
