ProteinA、ProteinG与抗体的结合

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1、Protein A 、Protein G 与抗体的结合 1 Protein A Sepharose 、rProtein A Sepharose 亲和层析介质与抗体的结合 目前，约70-80%的抗体纯化使用 Protein A、Protein G 亲和层析。蛋白 A (Protein A)来源于金黄色葡萄 球菌的一个株系，它含有 5个可以和抗体IgG分子的Fc段特异性结合的结构域。蛋白 A作为亲和配基被 偶联到琼脂糖基质上，可以特异性的和样品中的抗体分子结合， 而使其他杂蛋白流穿，具有极高的选择性， 一步亲和层析就可达到超过 95%的纯度。1个蛋白A分子至少可以结合 2个IgG。蛋白A也

2、可以结合另一 些免疫球蛋白，如用于某些种属的 IgA、IgM的纯化。 天然(Native Protein A) 和重组的蛋白 A (rProtein A) 对于IgG的Fc段有着相似的特异结合。重组的蛋 白A经改造后含有一个 C末端半胱氨酸，可以单一位点偶联于琼脂糖上， 降低了空间位阻，增加了与 IgG 的结合能力。蛋白 A与IgG的结合强度很大成度上依赖于该抗体的种属和亚型，而其动态结合能力则决 定于结合强度(解离常数)及传质阻力等多种因素(例如上样时样品在柱内的停留时间 )。 2 Protein G Sepharose 亲和层析介质与抗体的结合 蛋白G是一种源自链球菌 G族的细

3、胞表面蛋白，为三型 Fc受体。其通过类似于蛋白 A的非免疫机制与 抗体的Fc段结合。像蛋白 A 一样，蛋白G可以与IgG的Fc区域特异性结合，不同的是， Protein G Sepharose 可以广泛、更强地结合更多类型的 IgG,多克隆IgG及人IgG，同时血清蛋白结合水平更低， 纯度更高，配基脱落也相对更低。此外，蛋白 G还可以和某些抗体的 Fab和F (ab ' )2段结合。 Protein G 是从G类Streptococci 细菌中分离出来的胞壁蛋白，与多数哺乳动物的 IgG Fc段结合(包括： 人、山羊、绵羊、兔、豚鼠、马、猪、猴、小鼠等)，分子量：25kDa。

4、Protein G可用于纯化不能与 Protein A很好结合的哺乳动物单抗和多抗 IgG的纯化。相对于 Protein A ，Protein G 对于大多数哺乳动物的IgG 有着更高的亲和力， 尤其是对于IgG的亚基，如人IgG3，小鼠lgG1和鼠IgG2a。与Protein A不同，Protein G不与狗IgG结合、不结合人IgM，IgD，或IgA。 重组蛋白G(Recomb Protein G)已经除去了与白蛋白及细胞表面结合位点，减少了交叉反应和非特异性结 合。因此，它比天然蛋白 G和蛋白A有更大的亲和力。可以代替二抗，广泛应用于免疫化学等领域。在 亲和力、稳定性等方面好。

5、 本产品将我公司自主设计和生产的新型重组蛋白 G偶联到环氧活化的琼脂糖凝胶 6B上，成为用于抗体分 离纯化的亲和层析介质 本产品稳定性好，基团脱落少，使用寿命长，使用方便，可从腹水或培养液中直接分离纯化抗体。 由于采用了环氧活化的方法，与溴化氰活化方法相比，可获得长短更适合的结合臂，使抗体纯化获得更好 的效果。并且这种方法活化的琼脂糖凝胶没有离子交换的作用，因而其死吸附少。 亲和介质特性 特点 基团脱落少，结合特异性强 基质 6%的交联琼脂糖凝胶 配基 重组蛋白G 配基密度 ~6mg重组蛋白 G/ml 吸附载量 3-7mg 鼠 lgG2a/ml 亲和介质的颗粒大

6、小 50-160 卩 m 最大流速 200cm/h pH范围 3-10，在位清洗时pH范围可到2-11 使用温度 常温 保存温度 +4~8°C 保存液体 20%乙醇 三、适用范围 Protein A和Protein G的相对结合强度 物种物种 亚类亚类 protein A 结合 protein G 结合 人 IgA 可变 - igD - - igD - - igG1 ++++ ++++ igG2 ++++ ++++ igG3 - ++++ igG4 ++++ ++++ ig

7、M 可变 - 鸡蛋黄 igY - - 牛 ++ ++++ 狗 ++ + 山羊 - ++ 豚鼠 igG1 +++ ++ igG2 +++ ++ 仓鼠 + ++ 马 ++ ++++ 考拉 - + 骆驼 - + 猴（恒河） ++++ ++++ 小鼠 igG1 + ++++ igG2a ++++ ++++ igG2b +++ +++ igG3 ++ +++ lgM 可变 - 猪 +++ +++ 兔 ++++ +++ 大鼠

8、lgG1 - + lgG2a - ++++ lgG2b - ++ lgG3 - ++ 绵羊 +/- ++ ++++ =强结合，++ =中等结合，-=弱或不结 四、缓冲液配制 建议采用磷酸缓冲液，洗脱后不影响下游的标记。 A 缓冲液 1mol/L Na2HPO4.12H2O(MW358.14) 358.14g 1500 mM NaCI l(MW68.08g/mol) 87.7g 溶于1升水，滤膜过滤 B 缓冲液 1mol/L NaH2P04 (MW156.01) 156.01g 1500 mM NaCl l(MW68.0

9、8g/mol) 87.7g 溶于1升水，滤膜过滤 C吸附和洗涤缓冲液 根据所需PH值，按下表3配制。按照所列比例量取后混合， 然后再加9倍体积的水，稀释成应用溶液。 如果洗脱下的抗体有些杂带，可加吐温 -20至终浓度0.05% D中和缓冲液:A液77.4ml、B液22.6ml;两液混合成 PH7.4的中和缓冲液 E 洗脱液 0.1mol/L NaH2P04 (M W156.01) 15.601g 150 mM NaCl l(MW68.08g/mol) 8.77g 溶于1升水，滤膜过滤，HCI调整PH至3.0 五、应用举例 A实验名称：从小鼠腹水中分离纯化 lgG

10、2a 1、 重组蛋白G琼脂糖凝胶装柱，柱床体积为 1ml，流尽20%乙醇溶液； 2、 以缓冲液C平衡5-10个床体积，流速为1ml/min ;(缓冲液C配制方法：取A液35.2ml、B液64.8ml, 再加900ml水，混合后PH6.5). 3、 将0.2ml小鼠腹水用缓冲液 C稀释到2ml, 0.45卩n滤膜过滤，上样。流速为 1ml/min ; 4、 用缓冲液C再洗5-10个床体积，流速为1ml/min ; 5、 用洗脱液E,洗脱3体积。 6、 在洗脱液加入0.2体积中和缓冲液，以 PH试纸确认溶液为中性。溶液太酸，会损伤抗体活性(中和缓 冲液配制方法：A液77.4ml、B液

11、22.6ml;两液混合成 PH7.4的中和缓冲液 7、 将分离纯化的lgG2a与对照品同时进行 SDS-PAGE电泳分析。 8、 用纯水流洗10个柱床体积，再用 20%的乙醇流洗10个柱床体积，流速为 2ml/min , 柱子置于+4~8 C环境中保存 表三，25C下0.1mol/L磷酸钠缓冲液的配制 pH A液 1mol/L Na 2HPO(ml) B液 1mol/L NaH2PQ(ml) 5.8 7.9 92.1 6.0 12.0 88.0 6.2 17.8 82.2 6.4 25.5 74.5 6.6 35.2 64.8 6.8 46.

12、3 53.7 7.0 57.7 42.3 7.2 68.4 31.6 7.4 77.4 22.6 7.6 84.5 15.5 7.8 89.6 10.4 8.0 93.2 6.8 根据比例量取混合，然后在加 9倍体积的水，稀释成应用溶液。 B 免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP): (1) 蛋白样品的准备： 1) 对于10厘米细胞培养皿中的贴壁细胞，吸除细胞培养液， PBS洗涤一次，然后加入 500微升至2毫升 细胞裂解液裂解细胞。 3) 对于组织样品参考贴壁细胞使用裂解液的比例进行裂解。 4) 对于悬浮细胞，离心收集

13、细胞后， PBS洗涤一次，然后参考贴壁细胞的裂解方法进行裂解。 注：详细的裂解方法参考不同裂解液的详细使用方法。对于不同的培养器材，参考 10厘米培养皿的裂解 液的用量进行裂解。如果裂解获得的蛋白样品浓度过高， 可以用裂解液或PBS适当稀释，如果蛋白样品浓 度过低，在以后的裂解过程中宜适当减少裂解液的用量。 (2) .去除非特异性结合(可选做): 1).取200微升至1毫升蛋白样品，蛋白量约为200微克至1毫克，加入约1微克和免疫沉淀时使用的 IgG 种属相同的普通IgG和20微升充分重悬的 Protein A+G Agarose，4 C缓慢摇动30分钟至2小时。 2） . 250

14、0rpm（约1000g）离心5分钟，取上清用于后续的免疫沉淀。 注： 所谓种属相同的 IgG 是指，例如后续免疫沉淀时用的是小鼠 IgG ，则在本步骤中可以加入 normal mouse IgG，如无normal IgG可以加入其它不影响后续检测的其它 mouse IgG类型的抗体。通过和 normal IgG和 Protein A+GAgarose 的孵育，可以充分降低非特异性的结合，降低背景。 （3） . 免疫沉淀： 1） .加入0.2-2微克用于免疫沉淀的一抗， 4 C缓慢摇动过夜。 2） .再加入20微升充分重悬的 Protein A+G Agarose , 4C缓慢摇动1

15、-3个小时。（为方便后续的洗涤操作可 以把加入充分重悬的 Protein A+G Agarose 的量调整为 40 微升。 ） 3） . 2500rpm（约1000g）离心5分钟，或瞬时高速离心，小心吸除上清，注意宁可留下少量上清也不能吸掉 Protein A+GAgarose 。 4） .用准备蛋白样品时的裂解液或 PBS洗涤沉淀5次，裂解液或PBS的用量每次为0.5-1毫升。洗涤时离 心条件和吸除上清的要求同上面的步骤 C3。 5） . 完成最后一次洗涤后，去除上清，加入 20-40 微升 1XSDS-PAGE 电泳上样缓冲液 Vortex 重悬沉淀， 瞬时高速离心把样品离心至管底。 6） . 100 C或沸水浴处理 3-5分钟，取部分或全部样品用于 SDS-PAGE电泳，暂时不用的样品可以 -20 C保 存。