CRISPRprotocol-Cas9介导的同源重组

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1、更好的基因科技 ・■・■・ c* I m I I ■ < ■ n • I eo w Cas9介导的同源重组 Cas9介导同源重组（HDR）的基本操作和做基因敲除（K0 ）基本一致（Fig 1 ）,除了 需要多引入 多复模板（repair template \丿顶利的情况下整套操作下来至少需要4周时间 （心急吃不到热豆腐囁1,其中单克隆的获取和鉴定是最大的限速步骤（/」'伙伴在这一涉 可以开开脑洞优化一下1 WT的Cas9 （这里指spCas9 ）是引起双链断裂（DSB ），进而引起NHEJ（ nonhomologous end joining，意思就是断裂的末端重新连起

2、来,这T2程容易产生indels ）或者HDR （修复 模板存在）；但有T突变体（D10A）却只保留了切口酶的活性（nickase ） （ spCas9n ）, —®不会引起NHEJ ,但会？ |起HDR （修复模板存在1大家周知WT的spCas9会有些微的 R淄G效应,因此利用cas9n代替WT的cas9产生deletion （需要两条sgRNA同时作用）或 者HDR可以降部分0腑的效果（Fig 2 1 Fig 1. Cas9敲除敲入基因时间安排⑴。 sgRNA pair design for double nicking sgRNA offset (0 to 20 b

3、p) —・■ Top strand target PAM y . NNNNNCCMNNNNHNNNNNNNNNNNk^NH \ …门 Z U 小.NG( NNNNN. 3* llllllllllllllllllllllllllll llllllllllllllllllllllllllll 3* ・・NNNNNG(：「W 小 J N T ・・hVf .. . .NNHNMNNNNNNNNNNNNNNNNCCNNNNN. . 5’ PAM Bottom strand target ♦ 5' overtiang F NNNNNNNNNNNNNNNNN・・・.N' hh nnmjgg

4、nnnnn. . 3* IIIIIIIIIII NNNNCCNNNNN. .5* Double nicking by Cas9n 5’ ・・NNHNNCCNNNN IIIIIIIIIII 3'・ NNNNNGGK NNNNNNNINNNNNNNM Repair by NHEJ or HDR Fig 2. Cas9 (D10A)突变体(Cas9n )只保留nicka*活性。这一变体不会^ |起NHJEO 如果同有两条sgRNA靶向一gene的不同位点• Cas9n会51起T片段(两个sgRNA之 间)的deletion0修复模板存在的情况下可以引起HDR(1)O 今天的内容主

5、要讲讲利用Cas9怎么做同源重组(修复X HDR \其实基因的敲入(KI) 也是T莫一样的做法。 _、 同源臂的设计：和做K0比较，做HDR最大的不同就是要有同源模板的 存在。同源模板有以下两种类型(Pg 3) 1. 单梃摸板:手动设计单侧同源臂长度不低于40 nt，但强烈挂荐设计~90 nt。 找引物合成公司合成较长单连oligo即Rj(90+9CH-Insertion),针对正链或者反链合成都 ok。没有必要使用PAGE纯化。为了验证方便，建议弓I入酶切位点(RPLP法).当然， 同源模板也可以是线性化的双链DNA片段，可以通过线性化载体或者基因合成/PCR 获得。溶解礎冬浓度10

6、叫 -20°C分装保存。 2 线性化双链模板：同源臂在1000 nt左右；线性化载体或者PCR产物作为转染 模板； 转染: 更好的基因科枚 ・•■• I a a « ©■■■ v ■ < ■ ■❷ 板：JxlQ5 cells/well (50-70% confluency) 500 ng Cas9 （或者 Cas9n ） -sgRNA 1M单链同源模板（iorM） 三.鉴定方法： 通过GFP或者puromycin富集成mixture然后直接PCR测序或者^用Restriction-fragment length polymoiphism (RFLP)分析方法 四・

7、结论： 1 WT的Cas9直接切割双链,引起DSB ,重组效果最好,但会51起3錠； 2 单链oligo作为模板优于线性化载体作为模板； 3 貌彳贩义oligo的檯板效果优于正链。 a Genomic locus Plasmid repair »rx>lato HDR-Fwd HDR-Rev HDA Hindill HDR-Fwd PCR ampimoMion HORRev Hndlli Ogosi ssODN ropoir qmplag b Genomic locus or Hmdiil or antisense (a> 3* . 5* 90 bp

8、 90 t>p Target ▼ PAM 5"・• CAGAAGAAGAAGGGC... CCAATGCGGAGGACATCGATGTCACC1CCAATGACTAGGGTGGTGCGCAAC ・・ CTCTGGCCACTCCCT ・・・$ lllllllllll Illi lllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllll Illi lllllllllll y- . .CTCTTCTKnCCCC. . .GCTTACCCCTaTGTA6CTACAGTCGAWTTACTGAKCCACCACCCGTTG.. .WU^CCCTCAGGOA

9、.. -5 W ssODN repair template (a) c Repair template: Left arm (90 bp) Insert (12 bp> Ri^it arm (90 bp> 6'・ CAGAAGAAGAACGCX . AC ATCGATGTCACCKCAATGM AA6CTTGCTA^CC6TGGGCMCCACAAK . CKTCGCCACTCCCT -X Htfvdlll or 3*- GTCTTCTTCTTCCCG. TGTA4CTACA6TG6AGCTTACTCT1CCAACGATCGCCACCCGTTG6TGTTK. . GAGA

10、CCWTWGGGA •& Hndlll HEK HUES9 ssODN (ft) &sODN (a) Plasmid mODN (a) ssOON (a) Plawrwl WT D10A - WT D10A - WT D10A - WT D10A - WT D10A - WT D1OA - HDR (%): 20 2 4 43 018 Fig 3. Cas9介导同源重组⑴ 五.多说几句 目前这中修复基因的方法比较适合在细胞系（包括ES细胞等）/受精卵（Zygote ） 即使如此，研究者依然可以去hy ,比如2 斤生翩寸期利用AAV-saCas9逬行局部注5寸

11、编 更好的墓因科技 中操作■因为效率还是比较髙的。对于操作细胞系来说,结合单克隆挑取,往往可以获 得100%的矫正。对于小鼠受精卵注射操作,也可以达到＞50%的效率（被矫正的后代占 全部后代的百分比）（2, 3）。已有报道AAV介导的spCas9在小鼠的脑内可以有效编辑 目的基因（4）,但对于成年动物其他组织的矫正则未必能work.虽然现在有更小的 Cas9-saCas9可以被包装成AAV高效特异性的导入到小鼠某个组织或者器官 但由于编 辑工具的局限性整体效果往往并不理想（5, 6）；再力吐同源重组的效率会进甘降低。 辑和重组效果可能会子一些。AAV・Cas9作为目前最流行的工具组

12、合起来使用， 将来几年最热门的研究热点（汉恒生物提供多种血清型的高滴度AAV_$gRNA_saCas9 X 将来某一天，也许会产生可以上市的AAV・Cas9基因治疗药物。 1. Ran FA、Hsii PD, Wriglit J, Agarwala V, Scott DA, and Zhang F. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 2013;8(ll):2281-308. 2. Wang H, Yang H, Sliivalila CS, Dawlaty MM, Cheng AW, Zliang F

13、, and Jaeiiisch R・ One・step generation of mice canying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 2013;153(4):910-& 3. Wu Y, Liang D, Wang Y, Bai M, Tang W, Bao S, Yan 乙 Li D, and Li J. Conection of a genetic disease in mouse via use of CRISPR-Cas9・ Cell Stem Cell.

14、 2013;13(6):659・62. 4. Swiech L、Heidenreich M, Baneijee A, Habib N, Li Y, TYombetta J. Sur M, and Zhang F. hi vivo interrogation of gene fiuiction in the mammalian brain using CRISPR-Cas9. Nat Biotechnol. 2015;33(l):102-6. 5. Ran FA, Cong L, Yan WX, Scott DA, Gootenberg JS, Kriz A J, Zetsche B, Sh

15、alem O, Wu X, Makarova KS, et al. hi vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9・ Nature. 2015;520(7546):186-91. 6. Nelson CE, Hakim CH、Ousterout DG, Tliakore PI、Moreb EA, Castellanos Rivera RM, MacUiavail S, Pan X, Ran FA. Yan WX, et al. Ill vivo genome editing improves muscle ftmction in a mouse model of Duchenne muscular dystrophy. Science. 2016;351(6271):403-7. 更好的基因科技 V • a ・ ■■■■