蛋白相互作用Pull-Down试验

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1、蛋白相互作用Pull-Down实验 实验原理：Pull-Down技术是通过蛋白相互作用来研究细胞通路的有力工具。是 确定两种或更多蛋白之间相互作用的体外方法。 Pull-Down实验可用来检测已知 的蛋白相互作用条件，并且可用来筛选未知的蛋白相互作用。 用作诱饵的蛋白是重组蛋白，会含有一个用于纯化的亲和标签。这个融合标 签就是用于Pull-Down实验的基础。最常见的标签为谷胱甘肽 S-转移酶（GST） 和多组氨酸（6X His）。其分别使用固相化的谷胱甘肽和固相化的金属螯合物亲 和配体（如Ni2+和Co2+）。 Ptiase 1 In vitro Proy Protein Synl

2、hosis (TNT*T7SySl«n) PhasB 2 Immobilization of Bair tG ST-fusion) Protein onto MagneGST™ Panides Wash Elute J |gst|-C + Q proy prntGin detocied Wash 5 Figure 1 Overview of the MjgneGST™ Pnll-Dtnvii System protocoL P h Prey Protein, M = MAgneGST™ PjtftKk. 实验准备： 实验仪器：谷胱甘肽琼脂糖凝胶(镍离

3、子琼脂糖凝胶) 、离心机、 实验材料：表达的含标签的纯化蛋白、细胞裂解液 实验试剂： Binding Buffer/Washing Buffer: 4.2mM Na2HPO4、2mM KH 2PO4、 140mM NaCl 、10mM KCl SDS loading Buffer: 50mM Tris-CI(pH6.8)、2%SDS、0.1%溴酚蓝、10%甘油、 10mM DTT 裂解缓冲液：20mM Tris-CI(pH8.0)、 200mM NaCl、 1mM EDTA (pH8.0)、 0.5% Nonidet P-40 使用前加入加入蛋白酶抑制剂。 (蛋白酶抑制剂： 2ug/u

4、l 抑肽酶 (aprotinin )、1ug/ul 白胃素( leupeptin )、0.7ug/ml 胃酶抑素( pepstatin)、25ug/ml 苯甲磺酰 氟( PMSF)) 实验方法： 方法一： 1 、预清除细胞裂解液： 将细胞裂解液与50ul的50%谷胱甘肽琼脂糖球珠悬液和25ug GST在4C混 合孵育 2h。 离心机12,000g在4°C离心2min。 将上清转移至新的离心管中。 2、探测细胞裂解液 两个含等量预清除细胞裂解液及 50ul 谷胱甘肽琼脂糖球珠的微量离心管。 在 一管中加约10ug的GST蛋白，另一管中加约10ug的GST融合探针蛋白。 两个反应中加入

5、的探针和对照蛋白质的量应该是等摩尔的。将离心管在 4C 翻转混合孵育 2h。 最大速度在4C离心样品2min。 在新的微量离心管中收集上清。 用1ml冰冷的裂解液洗球珠。在离心机上以最大速度离心 1ml。弃去上清。 重复洗三次。 加入50ul 20mmol/L的还原型谷胱甘肽到球珠中，洗脱 GST融合蛋白及任何 与其结合的蛋白质。在离心机上最大速度离心 2min。 将洗脱蛋白质与等体积的2X SDS-PAGE上样buffer混合。 3、检测相互作用蛋白质 将样品煮沸4min，进行SDS-PAGE凝胶电泳分析。 方法二： 1、 5ug 目的 GST 融合探针蛋白和 GST 蛋

6、白分别和谷胱甘肽琼脂糖凝胶球珠 在4C孵育结合30min。 2、 结合 GST 融合探针蛋白的谷胱甘肽琼脂糖凝胶球珠与 100ul 细胞裂解液 结合在4C作用4h。 3、 3000rpm在4C离心5min，除去上清。 4、 用洗涤缓冲液重悬谷胱甘肽琼脂糖凝胶球珠， 3000rpm在4C离心5min, 除去上清，重复 5 次。 5、 取谷胱甘肽琼脂糖凝胶球珠进行 SDS-PAGE电泳分析。 方法三： 实验试剂：PBS( 140mM NaCI、2.7mM KCI、10mM Na2HPO4、1.8mM KH2PO4) Elution Buffer: 50mM Tris-Cl(pH8.0)

7、 、10mM 还原型谷胱甘肽 0.154g溶解到 50ml 50mM Tris-CI(pH8.0)中配制 Elution Buffer。 1 、细胞裂解 取 1ml 细菌培养液离心去上清，加 200ul 细胞裂解液到菌丸，在室温下重 悬并轻柔的混匀。将其在室温下晃动孵育 20-30min。 2、固定 GST 融合蛋白到柱子上 将谷胱甘肽琼脂糖凝胶颠倒混匀后取 20ul 到 1.5ml 离心管中，小心去除上 清，加 250ul Binding Buffer 或 wash Buffer 到凝胶中，混匀。重复洗 3 次以上。 平衡好的凝胶用 100ul Binding Buffer 或 wa

8、sh Buffer 重悬。加 200ul 含 GST 融合蛋白的细菌裂解液，在旋转的台子上室温下孵育 30min。 小心移去上清，(保存以便分析，)将 250ul Binding Buffer 或 wash Buffer 加到凝胶中，轻柔混匀，在室温下孵育5min。小心移去上清。加入250ulBinding Buffer 或 Washing Buffer 再次清洗，将凝胶用 20ul Binding Buffer 或 wash Buffer 重悬。 3、捕获猎物蛋白 将 5ul 固定 GST 融合蛋白的凝胶中加入 20ul 含猎物蛋白的溶液，将 155ul Binding Buffer

9、 或 wash Buffer 和 20ul 10%BSA 加入凝胶中，在室温下旋转孵 育1h。移去上清。 将 400ul Binding Buffer 或 wash Buffer 加入凝胶中， 轻柔混匀， 在室温下孵 育5min，移去上清。加400ul Binding Buffer或wash Buffer再次清洗凝胶。 小心移去上清。 分析：加20ul SDS-PAGE loading Buffer,在室温下混合5min。取出上清用于 分析。 His Pull-Down 方法 实验试剂： Binding Buffer: 20mM Tris-CI(pH8.0)、150mM NaCI、20

10、mM 咪唑 Elution Buffer: 20mM Tris-Cl(pH8.0) 、 300mM NaCl、 500mM 咪唑 实验步骤： 1、 结合蛋白裂解后，经0.45um滤膜过滤， 2、 与Ni-NTA树脂(1ml蛋白裂解液上清结合5ul树脂)4C混合孵育3h。 3、 待树脂沉淀后用 1 0倍柱体积的镍柱洗涤缓冲液洗去杂蛋白。 4、 用 6 倍柱体积镍柱洗脱目的蛋白。 5、 纯化后的蛋白用PBS和超纯水透析，冻干。 6、 SDS-PAGE电泳分析 7、 纯化的蛋白与 Ni-NTA 树脂冰浴作用 2h， 8、 10 倍柱体积洗涤缓冲液洗涤， 9、 然后加入过量 100u

11、g/ml 蛋白溶液，冰浴作用 2h， 10、 用 10 倍柱体积的镍柱洗涤缓冲液清洗， 11 、加入 1 倍柱体积洗脱缓冲液洗脱， 12、 洗脱蛋白进行SDS-PAGE和Western-blot分析鉴定。 13、 阴性对照为结合蛋白溶液加入Ni-NTA树脂中冰浴作用2h。10倍柱体积 的镍柱洗涤缓冲液清洗，加入 1 倍柱体积洗脱缓冲液洗脱， 注意事项： 1、 所有过柱的液体都要经过 0.45um 或 0.22um 的滤膜。 2、 平衡柱子： 2.1 用 3-5 个柱体积蒸馏水洗柱 2.2 用 3-5 个柱体积的 binding buffer 平衡柱子。 3、 洗柱： 如谷胱甘肽琼脂糖凝胶的柱子失去结合能力，需要洗去柱子上的杂质 3.1除去变性物质，用2个柱体积的的6M盐酸胍洗柱子，然后用5个柱体积 的 PBS 洗柱 3.2除去疏水性物质， 用 3-4个柱体积的 70%乙醇或 2个柱体积的含 1%Triton X-100的PBS洗柱，然后用5个柱体积的PBS洗柱 4、 柱子的保存 用 3-5 个柱体积的超纯水洗柱后，用 3-5 个柱体积 20%的乙醇洗柱后将柱子 保存于4C冰箱 5、 Ni离子柱的洗柱程序和柱子的保存同带 His标签融合蛋白纯化的步骤。