微生态活菌制品总论

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1、微生态活菌制品总论 1概述 微生态活菌制品系由人体内正常菌群成员或具有促进正常菌群生长和活性作用的无害外籍 细菌,经培养、收集菌体、枯燥成菌粉后,参加适宜辅料混合制成.用于预防和治疗因菌群失 调引起的相关病症和疾病. 微生态活菌制品必须由非致病的活细菌组成,英在生产过程.制品贮存和使用期间均应保 持稳左的活菌状态.它可由一株、多株或几种细菌制成单价或多价联合制剂.根据其不同的使 用途径和方法可制备成片剂、胶囊剂、颗粒剂或散剂等多种剂型. 2根本要求 微生态活菌制品的制备方法、工艺应能保证成品含有足够的活菌数量,保持其稳定性,同 时应预防外源因子的污染. 生产和检左用设施、原材料及辅

2、料、水、器具、动物等应符合〃凡例"的有关要求. 3制造 3 1 生产用菌种 生产用菌种应符合"生物制品生产检左用菌毒种治理及质量限制"的有关规龙. 3.1.1名称及来源 选用的生产用菌种应来自人体内正常菌群,或对人体无毒无害.具有促进正常菌群生长和 活性作用的外籍细菌.细菌的别离过程和传代背景应淸晰,应具备稳立的生物学和遗传学特性, 并能保持稳泄的活菌状态,经实验室和临床试验证实平安、有效. 3.1.2种子批的建立 生产用菌种应根据〃生物制品生产检左用菌毒种治理及质量限制〃的有关规圧建立种子批系 统.三级种子批应分别冻干,宜适宜温度保存；种子批传代应限泄传代次数,原始种子批和主

3、种子批启开后传代次数不得超过10代,工作种子批启开后至发酵培养传代次数不得超过5代. 3.1.3种子批的检定 菌种的属、种型分类鉴左,应依拯最新版伯杰氏细菌系统鉴左手册(Bergeyt Manual of Systematic Bacteriology)和伯杰氏细菌命名手册(Bergey's Manual of Determinative Bacteriology) 的有关规左进行,包括形态、生长代谢特性检査.原始种子或主种子还应做遗传特性和抗生素 敏感性等检查. 三级种子批常规检查包括以下3项： (1) 培养特性及染色镜检 将菌种接种于适宜培养基,宜有氧或厌氧环境中培养,观察英生 长

4、情况,确立菌种为需氧性细菌或厌氧性细菌；以划线法观察在琼脂平皿上生长的单个菌落的 形状、大小、表而.边缘、透明度、色泽等特征；也可观察菌种在不同温度.pH值或不同浓度 的氯化钠溶液等条件下的生长特性等. 取菌种的新鲜培养物涂片做革兰氏染色,在显微镜下观察菌体的染色反响、形态、大小和 排列等,有芽泡的细菌应同时观察芽抱的形状、大小和位置(也可增做芽沦染色).检查结果均 应符合原始菌种的特性. (2) 生化反响 按细菌生化反响培养基(通那么3605)选择相应的培养基或其他适宜的方法进 行,结果应符合原始菌种的特性. (3) 毒性试验 毒性试验是通过动物试验检査菌种是否存在不平安因素.以保证人

5、体使用安 全. 用体重18〜22g小鼠5只,每只腹腔注射0.3ml新鲜菌液(不少于1.0xl09CFU/03ml),连 续观察3天,小鼠均应健康存活、体重增加；或每只小鼠经口灌胃0・5ml新鲜菌液(不少于 1.0xl09CFUA).5ml),每天1次,连续3天,从第1天灌胃起连续观察至第7天,小鼠均应健康 存活.体重增加. 除妇有规左外,原始种子或主种子批还需进行以下检査. (1) 细菌代谢产物一一脂肪酸测左 照气相色谱法(通那么0521)或其他适宜的方法进行,应 符合该菌种的特性. (2) 遗传特性分析 可采用16S rRNA序列测定或其他适宜方法进行,应符合该菌种的遗传特 IT

6、(3) 抗生素敏感性试验采用琼脂扩散纸片法或英他适宜方法进行菌株的抗生素敏感性检 査,应符合该菌种的特性. (4) 稳上性试验 菌种在适宜培养基中,连续传代30代次后,将第30代培养物做种子批检 定,全部检査结果应与原始菌种的特性一致. 3.1.4种子批的保存 原始种子和主种子应冻干保存于8C以下,工作种子应置于适宜温度保存. 3.2菌粉制造 应包括种子液制备、大罐培养、收获菌体(或芽抱)和菌体枯燥制成菌粉*如生产多价制 品时,应每种菌分别培养,制备单价菌粉. 32.1 生产用种子 启开工作种子批菌种,接种于适宜培养基进行多级种子扩增,应涂片做革兰氏染色,在显 微镜下观察5〜10

7、个视野,细菌的染色反响、形态应一致并符合原始菌种的特征.制备过程应 预防污染,菌种传代次数应符合规定. 3.2.2生产用培养基 采用经批准的培养基用于生产. 3.2.3培养 采用液体培养.将种子液置适宜条件下培养(包括厌氧或需氧.温度、时间等),培养过程中 取样涂片做革兰氏染色镜检、pH值检测等,芽抱菌需进行芽抱形成率的检测,均应符合规左. 培养结束后取样做纯菌检查,如发现污染应予废弃. 生产多价制品的单价菌粉时,应分别培养. 3.2.4收获菌体和制成菌粉 培养结朿后离心收获湿菌体,与适宜的分散剂、稳左剂混合.采用真空冷冻枯燥法枯燥菌 体,芽泡菌可采用加热枯燥方法,再经粉碎.过筛

8、制成粉末状菌粉. 3.2.5菌粉的保存及有效期 应通过活菌稳立性试验确立保存温度和有效期. 3.2.6菌粉检定 按4.1项进行,符合规左前方可进行半成品配制. 3.3半成品 3.3.1配制 同一工作种子批菌种生产的最多2批单价菌粉可按批准的比例与辅料混合均匀后制成半成 品.配制多价制品时,应将各单价菌粉、辅料按配方比例和配制程序混合均匀,配制过程应防 止污染. 3.3.2半成品检泄 按4.2项进行,应符合规左. 3.4成品 3.4.1剂型制备 根据制品的用途、使用对象和用药途径等因素确泄剂型.制备过程应符合通那么“制剂通那么〃 项下相关剂型的规定. 3.4.2分批

9、成品批号应在半成品配制后确左.配制日期即为生产日期.同一批号的制品,应来源一致、 质量均一.按规泄要求抽样检验后,能对整批制品作岀评左.应根据验证结果,规立半成品的 分装时间,如超过24小时,应分为不同的亚批. 3.4.3分装.规格和包装 制品的分装应符合通那么“制剂通那么〃的有关规吐 包装应符合〃生物制品分包装及贮运治理〃 的有关规立.规格应符合批准的规格要求. 4检定 微生态活菌制品质量检龙应包括菌粉检宦、半成品检左和成品检泄. 4.1菌粉检定 4.1.1外观 应为白色、灰白色或灰黄色粉末. 4.1.2目的菌检査 取少量菌粉参加适量火菌0.85%〜0.90%氯化钠溶液或英

10、他适宜稀释液后,涂布在适宜琼脂 平皿上,在适宜条件下培养,其培养物的生长特性和染色镜检的特征应符合生产用菌种特征. 4 13 杂菌检查 方法和材果判断见本总论附录3.如不符合规泄应废弃. 4.1.4 枯燥失重 菌粉中剩余水分的含量会直接影响活菌的生存,须进行菌粉枯燥失重的检查.应按通那么 0831或仪器方法测定. 4.1.5活菌数测主 测左每lg菌粉中含有的活菌数量.方法见本总论附录2. 4.2半成品检建 半成品须做杂菌检查,根据用药途径确左杂菌检查的质控指标.方法和结果判断见本总论 附录3° 4.3成品检立 4.3.1鉴别试验 检查成品中所含的目的菌是否符合生产用菌种的

11、特性.按3.1.3项方法进行生长特性.染色 镜检和生化反响检査,应符合规泄.对于多价制品,那么须逐一检查单价菌特性. 4.3.2理化检查 (1) 外观 根据剂型,观察制品的外观、色泽. 片剂外观应完整、光洁,呈白色或类白色,间有菌粉色斑；颗粒剂.散剂和胶囊剂内粉末 的粒子大小、色泽应均匀,间有菌粉色斑. (2) T燥失重 按通那么0831或仪器方法测左,除另有规泄外.减失重量应不得超过5.0%, 芽鞄菌制品应不得超过7.0%. (3) 粒度散剂和颗粒剂应进行粒度检查. 按通那么0982第二法,采用单筛分法或双筛分法检查,应符合规立. (4) 装量(重量)差异 各剂型按通那么〃制剂

12、通那么〃的相应规宦进行,应符合规定. (5) 朋解时限 胶囊剂、片剂按通那么0921进行,应符合规定. 4.3.3活菌数测定 按本总论附录2方法测左每lg制品中的活菌数,应符合规左.多价制品应分别测立各单价 活菌数. 4.3.4杂菌检查 目的是检查成品中外源微生物的污染情况,以保证人体使用平安. 方法和结果判断与半成品的係菌检查"项相同. 5保存、运输及有效期 按批准的温度保存和运输.自生产之日起,按批准的有效期执行. 附录 附录1已批准上市的微生态活菌制品 附录2微生态活菌制品活菌数测立法 附录3微生态活菌制品杂菌检查法 6使用说明 应符合“生物制品分包装及贮运治

13、理〃规泄和批准的内容. 附录1已批准上市的微生态活菌制品 制品名称 细苗种类 双歧杆asa胶寰 青春型双歧杆菌 双歧杆ass散 青春型双歧杆菌 双歧杆菌二联活菌胶妻 长型双歧杆菌 嗜酸乳杆菌 粪肠球菌 双歧杆苗二联活苗肠溶胶襄 长型双歧杆菌 嗜酸乳杆苗 粪肠球菌 双歧杆菌二联牙菌散 长型收歧杆菌 嗜酸乳杆菌 粪肠球菌 双歧杆菌乳杆苗三联活苞片 长型双歧杆菌 保加利亚乳杆菌 嗜酸乳杆菌 地衣芽抱杆菌牙菌胶粪 地衣芽抱杆菌 地衣芽抱杆菌活苗颗粒 地衣芽抱杆菌 地衣芽抱杆ass片 地衣芽砲杆菌 蜡样芽抱杆苗牙苗胶異 蜡样芽抱杆菌 蜡样芽砲杆苗活苗片

14、 蜡样芽抱杆菌  双歧杆菌四联活菌片 婴儿型双歧杆菌 嗜酸乳杆菌 粪肠球菌 蜡样芽砲杆菌 酪酸梭菌活苗胶襄 酪酸梭状芽抱杆菌 酪酸梭菌牙菌散 酪酸核状芽砲杆菌 豁酸梭菌牙菌片 酪酸梭状芽抱杆菌 凝结芽砲杆菌牙菌片 凝结芽砲杆菌 酪酸梭菌二联活菌胶衰 酪酸梭状芽抱杆菌 婴儿型收歧杆菌 酪酸梭菌二联活菌散 酪酸梭状芽抱杆苗 婴儿型双歧杆菌 枯草杆菌牙苗胶表 枯草芽抱杆菌 枯草杆菌肠球菌二联活菌多维颗粒 枯草芽砲杆菌 屎肠球菌 枯草杆菌肠球苗二联活菌胶翼 枯草芽砲杆菌 屎肠球菌 阴道用乳杆胶裘 德氏乳杆菌 附录2微生态活菌制品活菌数测左法 帥〔C

15、FU加二竺巴譬空 xlOx最终稀释度 无菌称取3・0g制品或菌粉〔胶囊取内容物〕,参加27.0ml稀释液中,充分摇匀,做20倍系 列稀释〔最终稀释度根据不同的指标要求而泄〕.取最终稀释度的菌液100kL滴入选择性琼脂 培养基平皿上,共做3个平皿・并以玻棒涂布均匀,垃适宜条件下培养,到期观察每个平皿菌 落生长情况,并计数.当平皿菌落数小于10或大于300时,应调整最终稀释度,重新测左.根 据3个平皿菌落总数按以下公式il•算活菌数. 【附注】〔1〕活菌数用"CFU"表示,即为细菌集落单位. (2) 稀释液使用火菌0.85%〜0.90%氯化钠溶液或其他适宜的稀释液. (3

16、) 选择性琼脂培养基,是指最适宜制剂(或菌粉)中活菌生长的培养基,须经批准前方 可使用. 附录3微生态活菌制品杂菌检查法 微生态活菌制品杂菌检查法系检査微生态活菌制品的菌粉、半成品及成品受外源微生物污 染程度的方法.检查工程包括限制菌检査,非致病性杂菌、真菌计数. 杂菌检查应在环境洁净度不低于D级背景下的B级单向流空气区域内进行.检验全过程必 须严格遵守无菌操作,预防再污染.单向流空气区域、工作台而及环境应圧期按?医药工业洁 净室(区)悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法?的现行国家标准进行洁净度验证. 除另有规左外,本检査法中细菌培养温度为30〜35C；真菌培养温度为20〜25°C.

17、 由于供试品本身含有大量活菌,可能在杂菌检查所用的培养基上生长,干扰杂菌回收或结 果判断,在建立或修订方法时应考虑其适用性,充分了解供试品活菌在杂菌检查培养基上的生 长特性.除本附录收载的杂菌检査用培养基之外,亦可采用其他经验证的培养基. 如果供试品本身对某些试验菌具有较强的抑菌性能,影响试验菌的回收.在此情况下,应 根据原辅料的杂菌负载、生产工艺及产品特性进行风险评估,保证检验方法的可靠性；在药品 生产.贮藏各个环节中,应严格遵循GMP的指导原那么,以降低产品受杂菌污染的风险. 限制菌检查法检出疑似致病菌时,可参考〃微生物鉴上指导原那么(指导原那么9204) 〃的提示 进行后续确证,确证

18、的方法应选择已被认可的菌种鉴定方法. 检验量及供试品的准备 检验量,即一次试脸所用的供试品量(g).检验时,应从2个以上最小包装单位中随机抽 取不少于3倍检验用量的供试品. 菌粉、半成品以及成品为散剂和颗粒剂的可直接称取备用；成品为片剂、胶囊剂的需研碎 后备用. 限制菌检查 限制菌检查用培养基的适用性检查 限制菌检査用的培养基,即成品培养基、由脱水培养基或按培养基处方配制的培养基,均 应进行培养基的适用性检査.检査工程包括促生长、指示和抑制特性水平. 菌种试验所用的菌株传代次数不得超过5代(从菌种保藏中央获得的冷冻枯燥菌种为第0 代),并采用适宜的菌种保藏技术,以保证试验菌株的生

19、物学特性. 大肠埃希菌(Escherichia coli) (CMCC (B) 44102] 金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus) [CMCC (B) 26003] 乙型副伤寒沙门菌(Salmonella paratyphi B) [CMCC (B) 50094] 铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) [CMCC (B) 10104] 生泡梭菌(Clostridium sporogenes) [CMCC (B) 64941] 白色念珠菌(Candida albicans) [CMCC (F) 98001] 痢疾志贺菌(Shigella

20、 dysenteriae) [CMCC ( B) 51252] 菌液制备 接种大肠埃希菌、金黄色衙萄球菌、乙型副伤寒沙门菌、铜绿假单胞菌的新鲜 培养物至胰酪大豆陈液体培养基或胰酪大豆腺琼脂培养基中,接种生抱梭菌的新鲜培养物至硫 乙醇酸盐流体培养基中,培养18〜24小时：接种白色念珠菌的新鲜培养物至沙氏匍萄糖液体培 养基或沙氏匍萄糖琼脂培养基中,培养24〜48小时.用0.85%〜0.90%无菌氯化钠溶液制成每 lml含菌数为10-100CFU或100-1000CFU的菌悬液. 菌悬液制备后应在2小时内使用,假设保存在2〜8°C的菌悬液可以在24小时内使用. 适用性检查 限制菌检査用培养基的

21、适用性检查所用的菌株及检测工程见表1. 表1限制菌检査用培养基的促生长、抑制和指示水平检查 限制菌 培祥基 特性 试验菌株 胆盐乳糖 促生长肓訪 大肠埃希苗 大肠 埃希菌 培薜基 抑制水平 金黄色葡萄球苗 曙红亚甲 蓝琼脂培 粽基 促生长肓幼十 指示水平 大肠埃希菌 胆盐乳糠 培薜基 促生长肓廿〕 乙型副伤寒沙门苗、 痢疾志贺苗 沙门 苗、心、 贺菌 抑制水平 金黄色葡萄球菌 沙门、志 力口 菌属琼脂 倍羔茎 促生长审訪+ 指示水平 乙型副伤寒沙门苗、 痢疾志贺菌  限制菌 培养基 特性 试验菌株 铜绿假

22、NAC液体 培粽基 促生长水平 洞绿假单胞菌 抑制水平 金黄色葡萄球菌 NAC琼脂 陪养基 促生长水平 洞绿假单胞菌 单胞菌 抑制水平 大肠埃希菌 绿脓菌素测 定用培蘇基 促生长水平+ 指示水平 洞绿假单胞菌 金黄色 葡萄球菌 7.5%B化衲 肉汤培养基 促生长水平 金黄色葡萄球菌 抑制水平 大肠埃希菌 甘需醇氯 化钠琼脂 陪薜基 促生长水平+ 指示水平 金黄色葡萄球菌 抑制水平 大肠埃希菌 核菌 梭菌増菌 陪殊基 促生长水平 生砲梭菌 哥伦比亚琼 脂培养基 促生长水平 生砲梭菌 白色 念珠菌 沙氏葡萄糖 液体培粽基 促生

23、长水平 白色念珠菌 沙氏葡萄糖 琼脂培兼基 促生长水平+ 指示水平 白色念珠菌 念珠菌显 色培养基 促生长水平+ 指示水平 白色念珠菌 抑制水平 大肠埃希菌 〔1〕增菌培养基促生长水平检査 分别接种不超过100CFU的试验菌于被检培养基和对照 培养基中,在相应限制菌检查规左的培养温度及最短培养时间下培养.与对照培养基比拟,被 检培养基试验菌应生长良好. 〔2〕 固体培养基促生长水平检查 取试验菌1OORI｛含菌数50〜100CFU〕分别涂布于被检 培养基和对照培养基平皿中,每种培养基每一试验菌株平行制备2个平皿,在相应限制菌检查 规定的培养温度及最短培养时间下培养.被检

24、培养基与对照培养基相比,生长的菌落大小、形 态特征应一致. 〔3〕 培养基抑制水平检查 接种不小于100CFU的试验菌于被检培养基中,任相应限制菌 检查规定的培养温度及最长时间下培养,试验菌应不得生长. 〔4〕 培养基指示水平检查分别接种不超过100CFU的试验菌于被检培养基和对照培养基 平皿上,在相应限制菌检查规宦的培养温度及时间下培养.被检培养基中试验菌生长的菌落形 态、大小.指示剂反响情况等应与对照培养基一致. 供试品检查 供试品的限制菌检查应按下述方法进行. 阳性对照试验供试品进行限制菌检查时,应做阳性对照试验.取阳性对照菌于相应选择 性培养基平皿上划线接种,按供试品的限制菌

25、检査方法培养,观察菌落生长情况.阳性对照试 验应检出相应的限制菌. 阴性对照试验 取增菌液100Rl,照相应限制菌检査法检查,作为阴性对照.阴性对照应无 菌生长. 1. 大肠埃希菌〔Escherichia coli〕 〔1〕 增菌培养 称取供试品lg,加到至少9ml灭菌胆盐乳糖培养基中,培养28〜24小时. 〔2〕 特异培养 将上述增菌液摇匀,取100山滴加到曙红亚甲蓝琼脂平皿上,以玻棒涂匀, 一式3份,培养18〜24小时,观察菌落生长情况. 〔3〕 结果判左 阳性对照平皿应长出紫黑色、圆形、稍凸起、边缘整洁.表而光滑、带有 金属光泽的菌落. 供试品平皿上假设有疑似菌落生长,应进行

26、别离、纯化及适宜的鉴左试验,确证是否为大肠 埃希菌或制品中的目的菌：假设平皿上未见菌落生长,或虽有菌落生长但鉴圧结果为非限制菌, 判供试品未检岀大肠埃希菌. 2. 志贺菌〔Shigella〕% 沙门菌〔Salmonella〕 〔1〕 增菌培养 称取供试品lg,加到至少9ml灭菌胆盐乳糖培养基中,培养28〜24小时. 〔2〕 特异培养 将上述增菌液摇匀,取100W滴加到沙门.志贺菌属琼脂平皿上,以玻棒 涂匀,一式3份,培养24〜48小时,观察菌落生长情况. 〔3〕 结果判泄 阳性沙门菌对照平皿应长出无色透明或半透明、圆形、光滑、稍隆起菌落, 中央呈黑褐色.阳性志贺菌对照平皿应长出无色、半

27、透明、圆形、微凸、光滑的菌落. 供试品平皿培养24小时.48小时各观察结果1次.假设有疑似菌落生长,应进行别离、纯 化及适宜的鉴左试验,确证是否为志贺菌、沙门菌或制品中的目的菌：假设平皿上未见菌落生长, 或虽有菌落生长但鉴定结果为非限制菌,判供试品未检出志贺菌、沙门菌. 3・铜绿假单胞菌〔Pseudomonas aeruginosa〕 〔1〕 增菌培养 称取供试品加到至少9ml的NAC液体培养基中,培养18〜24小时. 〔2〕 特异培养 将上述增菌液摇匀,取lOOyl滴加到NAC琼脂平皿上,以玻棒涂匀,一式 3份,培养18〜24小时,观察菌落生长情况. 〔3〕 结果判左 阳性对照平皿

28、应长出产绿色色素的菌落,可使整个培养基呈绿色. 供试品平皿上假设有疑似菌落生长,取菌落别离、纯化后采用氧化酶试验及适宜的鉴左试验, 确证是否为制品中的目的菌或铜绿假单胞菌；假设平皿上未见菌落生长,或虽有菌落生长但鉴左 结果为非限制菌,判供试品未检出铜绿假单胞菌. 氧化酶试验 取洁净滤纸片置于平皿内,用无菌玻棒取别离纯化的培养物涂于滤纸片上, 滴加新配制的1%二盐酸二甲基对苯二胺试液,在30秒内假设培养物呈粉红色并逐渐变为紫红色 为氧化酶试验阳性,否那么为阴性. 假设别离纯化的培养物为非革兰氏阴性无芽抱杆菌或氧化酶试验阴性,均判供试品未检岀铜 绿假单胞菌.否那么,应继续进行适宜的鉴泄试验,

29、确证是否为铜绿假单胞菌. 4. 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) (1) 增菌培养 称取供试品lg,加到至少9ml7・5%灭菌氯化钠肉汤培养基中,培养18〜 24小时• (2) 特异培养 将上述增菌液摇匀,取100山滴加到甘露醇氯化钠琼脂平皿上,以玻棒涂 匀,一式3份,培养18〜24小时,观察菌落生长情况. (3) 结果判左 阳性对照平皿应长出产金黄色素的圆形.凸起、边缘整洁的菌落. 供试品平皿上假设有疑似菌落生长,应进行别离.纯化及适宜的鉴宦试验,确证是否为金黄 色葡萄球菌或制品中的目的菌：假设平皿上未见菌落生长,或虽有菌落生长但鉴左结果为非限制 菌,判

30、供试品未检出金黄色匍萄球菌. 5. 梭菌(Clostridium ) (1) 增菌培养 取供试品ig, 2份,英中1份宜80C保温10分钟后迅速冷却.上述2份 供试品直接或处理后分别接种至至少9ml的梭菌增菌培养基中,置厌氧条件下培养48小时. (2) 特异培养 取上述每一培养物100山,分别涂布接种于含庆大霉素的哥伦比亚琼脂培 养基平H11上,一式3份,置厌氧条件下培养48〜72小时. (3) 结果判左 阳性对照平皿应长岀典型的梭菌菌落.假设供试品平皿上有疑似菌落生长, 应挑选2〜3个菌落分别进行革兰氏染色和过氧化氢酶试验及适宜的鉴左试验,确证是否为梭菌 或制品中的目的菌：假设供试品

31、平皿上未见菌落生长,或虽有菌落生长但鉴定结果为非限制菌. 判供试品未检岀梭菌. 过氧化氢酶试验 取上述平皿上的菌落,置洁净玻片上,滴加3%过氧化氢试液,假设菌落表 而有气泡产生,为过氧化氢酶试验阳性,否那么为阴性. 6・白色念珠菌(Candida albicans) (1) 增菌培养 取供试品lg,接种至至少9ml的沙氏匍萄糖液体培养基中,培养24〜48 小时. (2) 特异培养 取上述培养物lOOpL滴加到沙氏匍萄糖琼脂培养基平皿上,以玻棒涂匀, 一式3份,培养24〜48小时(必要时延长至72小时)° (3) 结果判左 阳性对照平皿应长出乳白色偶见淡黄色的菌落,菌落表而光滑,有浓酵

32、母 气味,培养时间稍久那么菌落增大、颜色变深、质地变硬或有皱褶.如供试品平皿上有疑似菌落 生长,应挑选2〜3个菌落分别接种至念珠菌显色培养基平皿上,培养24〜48小时(必要时延长 至72小时)；假设疑似菌在念珠菌显色培养基平皿上生长的菌落呈阳性反响,应进一步进行适宜 的鉴左试验,确证是否为白色念珠菌：假设供试品在沙氏衙萄糖琼脂培养基平皿上未见菌落生长, 或虽有菌落生长但鉴左结果为非限制菌,或疑似菌在念珠菌显色培养基平皿上生长的菌落呈阴 性反响,判供试品未检岀白色念珠菌. 非致病性杂菌、真菌计数 计数培养基的适用性检査 非致病性杂菌、真菌讣数用的培养基,即成品培养基、由脫水培养基或按培养基

33、处方配制 的培养基,均应进行培养基的适用性检査. 菌种 对试验菌种的要求同限制菌培养基的适用性检查.枯草芽抱杆菌活菌制品不应选择 枯草芽抱杆菌作为试验菌株. 大肠埃希菌(Escherichia coli) [CMCC (B) 44102] 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)[CMCC⑻26003] 枯草芽泡杆菌(Bacillus subtilis) [CMCC (B) 63501] 白色念珠菌(Candidaalbicans) [CMCC (F) 98001] 菌液制备 接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽抱杆菌的新鲜培养物至胰酪大豆腺 液体培养基或胰酪

34、大豆腕琼脂培养基中,培养18〜24小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至沙 氏葡萄糖液体培养基或沙氏匍萄糖琼脂培养基中,培养24〜48小时.上述培养物用0.85% 0.90%无菌氮化钠溶液制成每lml含菌数为50-100CFU或500〜2000CFU的菌悬液. 菌悬液制备后应在2小时内使用,假设保存在2〜8°C的菌悬液可在24小时内使用. 适用性检查 取大肠埃希菌、金黄色匍萄球菌、枯草芽抱杆菌菌液各2ml〔含50〜200CFU〕, 分别注入无菌平皿中,立即倾注营养琼脂培养基.每株试验菌平行制备2个平皿,混匀,凝固, 置30〜35°C培养48小时,计数；取白色念珠菌液2ml 〔含50〜100

35、CFU〕,注入无菌平皿中,立 即倾注玫塊红钠琼脂培养基,每株试验菌平行制备2个平皿,混匀,凝固,置20〜25°C培养72 小时,计数.或采用涂布法,取上述菌液各100山〔含菌数50〜iOOCFU〕,分别涂布于相应琼脂 培养基平皿上,以玻棒涂布均匀,一式2份,同法培养,计数°同时,用相应的对照培养基替 代被检培养基进行上述试验. 结果判左 被检培养基的菌落平均数与对照培养基的菌落平均数的比值应在0.5〜2范围 内,且菌落形态、大小应与对照培养基上的菌落一致,判该培养基的适用性检查符合规泄. 供试品检查 供试品的非致病性杂菌、真菌检査应按下述方法进行. 阳性对照 当采用营养琼脂培养基和玫瑰

36、红钠琼脂培养基进行检查时,真菌计数以白色念 珠菌为对照菌,非致病杂菌计数以金黄色匍萄球菌为对照菌. 因供试品为活菌制品,应选用能排除目的菌干扰的培养基进行检查.除另有规左外,营养 琼脂培养基用于非致病性杂菌的计数,玫魂红钠琼脂培养基用于真菌计数,也可采用其他经验 证的培养基. 〔1〕真菌汁数 称取供试品址 加到9ml 0.85%〜0.90%无菌氯化钠溶液或其他适宜稀释 液中,混匀,做10倍系列稀释,取适宜稀释度供试品溶液100山加到已备好的琼脂培养基上, 以玻棒涂匀,一式3份,倒置,于恒温培养箱中培养96小时,每天观察结果,记录平皿上生长 结果计算：以3个平皿上生长的菌落平均数讼算.

37、真苗数〔CFU /g〕 = 3个平皿菌落数之和 X 10 X稀释倍数 〔2〕 非致病性杂菌汁数 称取供试品lg＞加到9ml 0.85%〜0.90%无菌氯化钠溶液或其他 适宜稀释液中,混匀,做10倍系列稀释,取适宜稀释度供试品溶液100山加到已备好的琼脂培 养基上,以玻棒涂匀,一式3份,倒置,恒温培养箱中培养48小时,每天观察结果,记录平皿 上生长的菌落数. 结果计算：方法同真菌计数. 结果判定 盂试品检岀限制菌或其他致病菌时,按一次检出结果为准,不再复试. 供试品的菲致病性杂菌总数、真菌数,任何一项不符合规泄,不再复试. 限制菌检查、非致病性杂菌总数、真菌数3项结果均符合规

38、左.判供试品杂菌检查合格： 假设其中任何一项不符合规能,判供试品杂菌检査不合格. 稀释液 除另有规宦外,微生态活菌制品杂菌检查用稀释液釆用0.85%〜0.90%无菌氯化钠溶液.稀 释液配制后,应采用验证合格的灭菌程序灭菌. 1. PH7.0无菌氯化钠■蛋白丿1东缓冲液 照无菌检查法〔通那么M02制备九 2・0.85%〜0.90%无菌氯化钠溶液 称取氯化钠适量,加水溶解使成lOOOmL过滤,分装,火菌. 培养基及其制备方法 照无菌检查法〔通那么1101〕.非无菌产品微生物限度检查：微生物汁数法〔通那么1105〕和 非无菌产品微生物限度检査：限制菌检查法〔通那么1106〕中〃培养

39、基及其制备方法啲处方制备, 未收录的培养基可根据以下配方配制,也可使用按该处方生产的符合要求的脱水培养基.配制 后,应采用验证合格的灭菌程序灭菌. 1. 7.5%氯化钠肉汤培养基 蛋白陈lO.Og 氯化钠75.0g 牛肉浸粉3.0g 水1000ml 取上述成分混合,微温溶解,调pH值为弱緘性,煮沸,滤泳 调pH值使火菌后为7・2±0・2, 分装,灭菌. 茶唳酮酸0.015g 磷酸氢二钾0.3g 水 1000ml 2. NAC液体培养基 蛋白腺20.0g 硫酸镁0.3g 0.3g 浪化十六烷基三甲鞍 取上述成分,混合,微温溶解,调pH值使火菌后为7.5±0.1,分装,灭菌.

40、 茶咙爾酸0.015g 磷酸氢二钾0.3g 澳化十六烷基三甲钱0.3g 3・NAC琼脂培养基 蛋白腺20.0g 硫酸镁0.3g 琼脂14.0g 水 1000ml 除琼脂外,取上述成分,混合,微温溶解.调pH值使火菌后为7.5±0.1,参加琼脂,加热 溶胀后,分装,火菌,冷至60C,倾注平皿. 4. 营养肉汤培养基 月东lO.Og 氯化钠5.0g 牛肉浸出粉3.0g 水1000ml 取上述成分混合,微温溶解,调pH值为弱碱性,煮沸,滤淸,调pH值使火菌后为7・2±0・2, 分装,灭菌. 5. 营养琼脂培养基 按上述营养肉汤培养基的处方及制法,参加14・0g琼脂,调pH值使灭

41、菌后为7.2 ± 0.2, 分装,灭菌. 6. 胆盐乳糖培养基〔BL〕 磷酸二氢钾1.3g 牛胆盐2.0g 〔或去氧胆酸钠0.5g〕 水 1000ml 腺 20.0g 乳糖5.0g 氯化钠5.0g 磷酸氢二钾4・0g 除乳糖、牛胆盐或去氧胆酸钠外,取上述成分混合,微温溶解,调节pH值使灭菌后为7・4±0・2, 煮沸,滤清,参加乳糖、牛胆盐或去氧胆酸钠,分装,灭菌. 7. 曙红亚甲蓝琼脂培养基〔EMB〕 营养琼脂培养基100ml 曙红钠指否液2ml 20%乳糖溶液5ml 亚甲蓝指示液13—1.6ml 取营养琼脂培养基,加热熔化后,冷至60°C,按无菌操作参加火菌的其他3种

42、溶液,摇匀, 倾注平皿. 8. 沙门、志贺菌属琼脂培养基〔SS〕 腺5・0g 硫代硫酸钠8.5g 牛肉浸出粉5・0g 乳糖lO.Og 牛胆盐8.5g 枸橡酸钠8.5g 枸椽酸铁鞍l.Og 中性红指示液2.5ml 亮绿试液0.33ml 琼脂16.0g 水 1000ml 除乳糖、中性红指示液、琼脂外,取上述成分,混合,微温溶解,调肖pH值使火菌后为 7.2±0.1,滤过,参加琼脂,加热熔化后,再参加其余各成分,摇匀,灭菌,冷至60C,倾注平 皿. 限度标准 杂菌检査的限度标准是基于药品的给药途径和对患者健康潜在的危害以及活菌制品的特殊 性而制定的. 1. 口服微生态活菌制品 〔

43、1〕菌粉 大肠埃希菌 金黄色葡萄球菌 铜绿假单胞菌 沙门菌及志贺菌 每lg不得检出. 每lg不得检出. 每2g不得检出. 每lg不得检出. 非致病性杂菌数 每lg不超过500CFU. 真菌数 每lg不超过100CFIK 〔2〕半成品、成品 大肠埃希菌每lg不得检出. 金黄色匍萄球菌 每lg不得检出. 铜绿假单胞菌 每lg不得检出. 沙门菌及志贺菌每lg不得检出. 非致病性杂菌数 每lg不超过lOOOCFUo 真菌数每lg不得超过1OOCFU. 2.阴道微生态活菌制品 菌粉、半成品及成品： 金黄色葡萄球菌 每lg不得检岀. 铜绿假单胞菌每lg不得检出. 梭菌 每lg不得检出. 白色念珠菌每lg不得检岀. 真菌每lg不得检出. 非致病性杂菌数 每lg不超过1OOCFU.