酶解实验步骤

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1、第四节：凝胶蛋白质点的酶解 一. 蛋白质点酶解 准备工作： 1. 检查冻干机，调好水浴锅（37C, 56C） 2. 检查各种试剂的量是否足够（DTT IAA NH4HCO3） 3. 检查酶解房卫生状况 每一步注意事项： 1. 每一步加入的液体量视胶块大小定，一般是 50uL/管 2. 每次震荡后随手甩一下，以便把胶块和管壁上的液滴甩下来 3. 每次打开EP管盖子前，确认胶块在管内，并将胶块甩至管底。开盖子动作尽量 轻巧，以免胶块弹出。 4. 在冻干样品后，要确保样品在管底，以防样品与封口膜一起被去掉。 酶解前配制 1） 、100 mmol/L 的 NH4HCO3 参考

2、配制10mL称79.06mg NH4HCO3溶于10mL水中 以后每一步 25 mmol/L 的 NH4HCO3可用 100 mmol/L 的 NH4HCO3稀释。 2） 、1mol/L 的 DTT 参考配制10ML称1.55gDTT溶于10 mL水中，1mL分装，避光贮存（锡 箔包），-20度永久保存 酶解步骤：调水浴锅到37C以便做脱色用，此外，调水浴锅到57C,以便做还原用。 1•冲洗胶块：用水洗衣胶块2次， 2. 脱色：用含有25mmol/L的NH4HCO3的50%的乙腈37C保温30min。如第一次脱 色不完全可再脱一次 3. 干燥：吸出液体后，先加 50%^腈，再

3、加100%勺乙腈。 4. 还原：加入还原剂，圭寸口， 57T水浴一小时，还原蛋白质 还原剂：25mmol/L 的 NH4HCO3 （含 10mmol/L DTT ） 参考配制方法（4mL）: 6.2mgDTT 溶于 4mL 25mmol/L 的 NH4HCO3 中 注意事项：1.注意在水浴锅上写纸条标明使用者名字，水温和使用的时间段，方便实验之间的 协调和发生停电等意外情况时别的同学帮助临时处理样品。 2 •水浴锅用完后恢复到还原前的初始状态，以免后来的同学做实验时因为习惯或者经验忽略此 处造成不必要的失误。 5. 烷基化 将样品从水浴锅中取出后，室温冷却，去掉液体，迅速加入同样体

4、积的 烷基化试剂室温暗处放置45mi n,使之碘乙酰胺化。 烷基化试剂：25 mmol/L 的 NH4HCO3 （含 55 mmol/L IAA ） 参考配制方法（4mL）: 40.69mg IAA 溶于 4mL 25 mmol/L 的 NH4HCO3 中 注意事项：1、样品多的时候，可以将先加了烷基化试剂的样品先放入暗处， 并记住放入顺序和 时间，以便取出时按时间顺序处理。 2、注意实验时暗处的卫生情况，应该放在干净处，且建议在取出后先用酒精把样品盒擦拭后再 做后续实验。 6. 反应完成后去掉液体，依次用 25mmol/L的NH4HCO3溶液，50%勺乙腈，100%勺 乙腈冲洗胶

5、块，每次振荡后放置 10mi n，去掉液体。 7. 重复6的操作。 8. 去掉液体后，用封口膜封口，扎孔，冻干 30min,注意该步要完全冻干，这对蛋白 质点的酶解很重要。（乙腈效果好可不需此步） 9. 酶解 每管加入适量（约25ul）的酶液（切胶仪切的胶块每管加 4uL酶液），冰 上放置30min（吸胀就好，时间自己控制）。 取20uL 1mM HCl加入Trypsin酶中，得1ug/uL的原液，按2uL每管分装 每2uL酶液用98uL覆盖液（10%S腈，25mmol/L的NH4HCO3）稀释至V 0.02ug/uL （即20ug酶稀释到1ml），现用现配。 参考覆盖液配制（2

6、mL 100mmol/L NH4HCO3 500uL 100% 乙腈 200 uL 双蒸水 1.3mL 注意事项：酶从冰箱取出后所有操作过程，包括样品加酶后，都要放到冰上。 10. 检查酶液吸胀情况，多余的酶液吸走，酶液不够，即胶块中仍有白色，则再加 入适量酶液。 11. 加覆盖液80uL封口，37C保温16-18小时。 蛋白质酶解后样品的提取 1. 将样品从37度水浴锅中取出后，1%终止酶解。10000 g/1 min. 2. 将上清转移到干净的EP管中。 3. 在剩余胶块中加入萃取液(2.5 % TFA ,67% ACN for MALDI ,5% Formic Aci

7、d 67% ACN for ESI) ,37%保温 30min。 4. 超声15min，间隔5min重复超声15 min。水温不超过40度。 5. 10000 g/1mi n,合并上清。 6. 冷冻离心干燥至2-5 ul供质谱检测。 二. 银染蛋白质点酶解 准备工作： 4. 检查冻干机，水浴锅能否正常使用 5. 检查各种试剂的量是否足够 6. 检查酶解房卫生状况 每一步注意事项： 1. 每一步加入的液体量视胶块大小定，一般是 50uL/管 2. 每次震荡后随手甩一下，以便把胶块和震荡在管壁上的液滴甩下来 3. 每次打开EP管盖子前，确认胶块在管内，并将胶块甩至管底。开

8、盖子动作尽量轻 巧，以免胶块弹出。 4. 在冻干样品后，要确保样品在管底，以防样品与封口膜一起被去掉。 酶解前配制100 mM的NHHCO 参考配制10mL称79.06mg NHHCO溶于10mL水中 以后每一步25 mM的NHHCO可用100 mM的NHHCO一份，力卩3份 水稀释。 酶解步骤： 1. 水洗：用双蒸水洗银染以后的胶，摇床上洗2-3次,每次10分钟 2. 成像，取点（如果还没有成像的话，以及用自动取点仪操作时，但一般情况下， 胶是做完后便要扫描的） 3. 脱色，水洗 脱色工作液：30mmol/L KsFe（CN）6 : 100mmol/L Na 2$Q=1:

9、1 参考配制方法（4mL： 2 mL 30mmol/L KsFe（CN）6 （称 19.8g KsFe（CN）6溶于 2ml 便配 成 30mM勺溶液）：2mL100 mmol/L NqS2Q（ 1mLAmershan公司银染试剂盒中的 5% NaSQ 加1mL双蒸水） 注意事项：每次加5个样，加完脱色液后 震荡，置白纸上观察，颜色脱去后马上 加水200ul冲洗停止反应，震荡，2分钟内吸出，再加200ul水，震荡，直到完全洗 掉脱色液颜色（胶变得透明）。 4. 加入50%乙腈，震荡，洗1-2遍，每次15min 5. 脱水：100%乙腈脱水至胶块变成白色，若震荡后一次反应胶块没有变白，

10、可将乙 腈吸出，再加入100%乙腈脱水一次。 6. 吸胀：加入25mM勺NHHCO震荡后静置吸胀5min,再吸出。 7. 脱水：同步骤5 8. 冻干：用封口膜封口，扎孔，冻干机中冻干 20min,取出时轻敲EP管底，其中白 色胶块在管中轻快跳跃即可。 注意事项：注意冻干机靠右边的按钮打到“ LoW' —档，在操作过程中有不小心把该 挡碰到“ High” 一档的现象，所以离开前一定要检查 调水浴锅到57C，以便做还原时不用等。 9. 还原： 加入还原剂，封口，57T水浴一小时 还原剂：25mM勺 NH4HCO）（含 10mM DT） 参考配制方法（4mL： 6.2mgDTT溶于4

11、mL 25mM勺NHHCO中 注意事项：1.注意在水浴锅上写纸条标明使用者名字，水温和使用的时间段，方便实验之间的 协调和发生停电等意外情况时别的同学帮助临时处理样品。 2 •水浴锅用完后恢复到还原前的初始状态，以免后来的同学做实验时因为习惯或者经验忽略此 处造成不必要的失误。 10. 烷基化：从水浴锅取出样品后，室温冷却，去掉过量的液体，迅速加入同体积 的烷基化试剂室温暗处放置 30mi n. 烷基化试剂：25mM勺NHHCO （含55mM IAA 参考配制方法（4mL： 40.69mg IAA溶于4mL 25mM勺NHHCO中 注意事项：1、样品多的时候，可以将先加了烷基化试剂

12、的样品先放入暗处，并记住放入 顺序和时间，以便取出时按时间顺序处理。 2、注意实验时暗处的卫生情况，应该放在干净处，且建议在取出后先用酒精把样品盒擦拭后再 做后续实验。 11. 终止烷基化反应，洗掉IAA 用25mM勺NHHC册胶块两次 12. 脱水：同步骤5 13. 吸胀：加入25mM勺NHHCQ震荡，静置5分钟，吸出。 14. 脱水：同步骤5 15. 冻干：用封口膜封口，扎孔，冻干30分钟，注意该步要完全冻干。 16. 加酶：每管加入适量的酶液（切胶仪切的胶块每管加 4uL酶液），冰上放置 30mi n 酶液的配制：将12M HCl稀释到1mM HCl, 稀释过程：1

13、2M ~6Ml 1M* 200mM 1mM — 取20uL 1mM HCl加入酶中，得1ug/uL的原液,按2uL每管分装 每2uL酶液用98uL覆盖液（10聽腈，25mM勺NH4HCQ稀释到 0.02ug/uL 参考覆盖液配制（2mL 100mM N4HCO 500uL 100% 乙腈 200 uL 双蒸水 1.3mL 注意事项：酶从冰箱取出后所有操作过程，包括样品加酶后，都要放到冰上 。 17•检查酶液吸胀情况，多余的酶液吸走，酶液不够，即胶块中仍有白色，则加 入适量酶液。 18.加覆盖液20uL封口，37E保温16-18小时。 三. 蛋白质酶解后样品的提取 7. 将样品从37度水浴锅中取出后，10000 g/1 min. 8. 将上清转移到洗干净的EP管中。 9. 在剩余胶块中加入萃取液(2.5 % TFA ,67% ACN for MALDI ,5% Formic Acid 67% ACN for ESI) ,37%保温 30min。 10. 超声15min，间隔5min重复超声15 min。水温不超过40度。 11. 10000 g/1mi n,合并上清。 12. 冷冻离心干燥至2-5 ul供质谱检测。