人教版高中生物选修一教材用书：专题5 DNA和蛋白质技术 课题2 多聚酶链式反应扩增DNA片段 Word版含答案

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1、 1．DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从3′端延伸DNA链。 2．DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸。 3．PCR反应需要DNA模板、引物、四种脱氧核苷酸、耐热的DNA聚合酶等条件。 4．PCR原理：DNA热变性的原理。 5．PCR每次循环都包括变性、复性和延伸三步。 6．PCR扩增DNA片段可以使目的片段呈指数增长。 课题2多聚酶链式反应扩增DNA片段 PCR扩增的原理和过程 [自读教材·夯基础] 1．细胞内DNA复制的条件 原料 4种脱氧核苷酸 模板 2条DNA母链　 酶 解旋酶和DNA聚合酶 引物 使DNA聚合酶能够从引

2、物的3′端开始连接脱氧核苷酸 2．PCR扩增的原理及条件 (1)PCR技术：即多聚酶链式反应，是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。它能以极少量的DNA为模板，在短时间内复制出上百万份的DNA拷贝。 (2)引物：DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从3′端延伸DNA链，因此，DNA复制需要引物。 (3)扩增方向：总是从子链的5′端向3′端延伸。 (4)原理：DNA的热变性原理，即： 双链DNA单链DNA (5)条件 3．PCR的反应过程 (1)过程： (2)结果：DNA聚合酶只能特异地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列呈指数扩增。 1．D

3、NA复制时为什么需要引物？ 提示：DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从3′端延伸DNA链。 2．PCR扩增DNA过程中是否还需要解旋酶？ 提示：不需要。 3．PCR缓冲液相当于细胞内的什么成分？ 提示：因为缓冲液为DNA的复制提供场所，相当于细胞内DNA复制的场所，所以缓冲液相当于核基质。 4．PCR循环之前，常要进行一次预变性，预变性的目的是什么？ 提示：预变性的目的是增加大模板DNA彻底变性的概率。 5．利用PCR技术扩增1个DNA分子n次，所得DNA分子中，不含引物的脱氧核苷酸链所占的比例是多少？含引物的DNA分子所占的比例是多少？ 提示：1/2n；100%。

4、 [跟随名师·解疑难] 1．细胞内DNA复制与体外DNA扩增(PCR技术)的比较 项目 细胞内DNA复制 PCR 不同点 解旋 解旋酶，边解旋边复制 80～100 ℃高温解旋，双链完全分开 酶 DNA解旋酶、DNA聚合酶、DNA连接酶 TaqDNA聚合酶 引物 RNA DNA或RNA 温度 体内温和条件 高温 子链合成 一条链连续(先导链)，另一条链不连续，先合成片段，再由DNA连接酶连接(滞后链) 两条子链均连续合成 相同点 ①提供DNA模板 ②四种脱氧核苷酸作原料 ③子链延伸的方向都是从5′端到3′端 2．PCR反应过程 (1)变性：当温

5、度上升到90 ℃以上时，双链DNA解聚为单链，如图： (2)复性：系统温度下降至50 ℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合，如下图： (3)延伸：当系统温度上升至72 ℃左右，溶液中的四种脱氧核苷酸(A、T、G、C)在DNA聚合酶的作用下，据碱基互补配对原则合成新的DNA链，如下图： [特别提醒]PCR反应的结果 ①PCR一般要经历三十多次循环，每次循环都包括变性、复性、延伸三步。 ②两引物之间的固定长度的DNA序列呈指数扩增。 实验操作及DNA含量的测定 [自读教材·夯基础] 1．实验操作程序 2．DNA含量的测定 (1)原理：利用D

6、NA在260_nm的紫外线波段的吸收峰曲线来测定相应含量。 (2)计算公式：DNA含量(μg/mL)＝50×(260 nm的读数)×稀释倍数。 [跟随名师·解疑难] 1．实验操作注意事项 (1)为避免外源DNA等因素的污染，实验中使用的一些用具在使用前必须进行高压灭菌。 (2)所用的缓冲液和酶应分装成小份，并在－20 ℃储存。 (3)在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头必须更换。所有成分都加入后，通过手指轻轻弹击管的侧壁，使反应液混合均匀。 2．结果分析与评价 DNA在260 nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰，可以利用DNA的这一特点进行DNA含量的测

7、定，以判断DNA片段的扩增是否成功。具体方法如下： (1)稀释：取2 μL PCR反应液，加入98 μL蒸馏水，即将样品进行50倍稀释。 (2)对照调零：以蒸馏水作为空白对照，在波长260 nm处，将紫外分光光度计的读数调节至零。 (3)测定：取DNA稀释液100 μL至比色杯中，测定260 nm处的光吸收值。 (4)计算：检测DNA片段的扩增情况，可以通过计算DNA含量来评价扩增的效果，计算公式为： DNA含量(μg/mL)＝50×(260 nm的读数)×稀释倍数 如果扩增不成功，则要分析失败原因。可能的原因有：漏加了PCR的反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等。

8、 [特别提醒]　公式中的50代表在波长260 nm紫外波段照射下，吸收峰为1时，DNA含量为50 μg/mL。 PCR技术的原理 [例1] 多聚酶链式反应(PCR)是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。PCR过程一般经历下述三十多次循环：95 ℃下变性(使模板DNA解旋)→55 ℃下复性(引物与DNA模板链结合)→72 ℃下延伸(形成新的脱氧核苷酸链)。下列有关PCR过程的叙述中错误的是(　　) A．变性过程中破坏的是DNA分子内碱基对之间的氢键，生物体内复制时是通过解旋酶实现的 B．复性过程中引物与DNA模板链的结合是依靠碱基互补配对原则完成的 C．延伸过程中需要DNA聚合

9、酶和四种核糖核苷酸 D．PCR与细胞内DNA复制相比所需要酶的最适温度较高 [解析]　变性是为了使DNA内部的氢键断裂，双螺旋打开，体内复制时借助解旋酶来实现；借助碱基互补配对原则，引物可与DNA模板链结合；延伸时是形成新的DNA分子，需要以脱氧核苷酸为原料；PCR过程的温度高，会导致一般的DNA聚合酶失活，需特定的耐高温DNA聚合酶。 [答案]　C 归纳拓展 (1)DNA母链的3′端对应着子链的5′端，即DNA的两条链是反向平行的。 (2)解旋酶的作用是使DNA两条链的氢键断开，而DNA聚合酶与DNA连接酶都是催化形成磷酸二酯键的。 (3)DNA聚合酶是将单个核苷酸加到已有的单

10、链片段的3′端上，需要模板；而DNA连接酶连接的是两条DNA片段的缺口，不需要模板。 PCR反应过程及产物 [例2] 在遗传病及刑侦破案中常需要对样品DNA进行分析，PCR技术能快速扩增DNA片段，在几个小时内复制出上百万份的DNA拷贝，有效地解决了因为样品中DNA含量太低而难以对样品进行分析研究的问题。据图回答相关问题： a链 5′－G－G……T－C－3′　5′－G－G－OH(引物Ⅰ) b链3′－C－C……A－G－5′　　　　　　　(引物Ⅱ) 　　　　　　　　 95 ℃↓ 5′－G－G……T－C－3′　　3′－C－C……A－G－5′ 　　　　　　　　 55 ℃↓

11、 5′－G－G……T－C－3′　　3′－C－C……A－G－5′ 　　　　　　　　　　　　 5′－G－G－OH 　 　　　　　　 72 ℃↓ 　________________　 ________________ (1)在相应的横线上写出引物Ⅱ，并在复性这一步骤中将引物Ⅱ置于合适的位置。 (2)在相应的横线上写出循环一次后生成的DNA分子。 (3)若将作为原料的四种脱氧核苷酸用32P标记，请分析循环一次后生成的DNA分子的特点是______；循环n次后生成的DNA分子中不含放射性的单链占总单链的比例为______。 [解析]　(1)DNA聚合酶不能从头开

12、始合成DNA，只能从3′端延伸DNA链，引物就提供了3′端。子链延伸方向为5′→3′，引物Ⅰ与b链部分碱基互补，引物Ⅱ则与a链部分碱基互补，且连接到a链的3′端，故引物Ⅱ的结构为5′－G－A－OH，复性结果为： 　HO－A－G－5′ 5′－G－G……T－C－3′。 (2)经过一次循环后，产生的两个DNA分子分别含有引物Ⅰ和引物Ⅱ。(3)由于作为原料的四种脱氧核苷酸被32P标记，所以新合成的子链均含有放射性，一次循环后的两个DNA各有一条链含32P，若复制n次，产生子链共2n×2，其中只有亲本的两条母链不含32P，则其所占比例为2/(2n·2)＝1/2n。 [答案]　(1)5′－G－A－

13、OH a链5′－G－G……T－C－3′ 　　　　 HO－A－G－5′ (2)5′－G－G……T－C－3′　3′－C－C……A－G－5′ 　 3′－C－C……A－G－5′　5′－G－G……T－C－3′ (3)每个DNA分子各有一条链含32P标记　1/2n [随堂基础巩固] 1．下列说法错误的是(　　) A．一条DNA母链只有一个3′端，即羟基末端 B．DNA的两个3′端位于相反的两端 C．Taq DNA聚合酶只能与引物的3′端结合并延伸子链 D．DNA的合成方向是从子链3′端向5′端延伸的 解析：选D　我们通常将DNA单链的羟基(—OH)末端称为3′端，而磷酸基团的

14、末端称为5′端，一个DNA分子有两个3′端和两个5′端，它们分别位于DNA分子的两端，即每一端都有一个3′端和一个5′端。Taq DNA聚合酶只能与引物的3′端结合并开始延伸DNA链，即子链总是从5′端向3′端延伸。 2．标准的PCR过程一般分为变性、复性、延伸三大步，这三大步需要的温度依次是(　　) A．92 ℃、50 ℃、72 ℃　 　B．72 ℃、50 ℃、92 ℃ C．50 ℃、92 ℃、72 ℃ D．80 ℃、50 ℃、72 ℃ 解析：选A　当温度上升到90 ℃(90～96 ℃)以上时，双链DNA解聚为单链，称之为变性；当温度下降到50 ℃(40～60 ℃)左右时，两种引

15、物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合，称为复性；当温度上升到72 ℃左右(70～75 ℃)时，溶液中的四种脱氧核苷酸(A、T、C、G)在Taq DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链，称为延伸。 3．使用PCR仪的具体实验操作顺序应为(　　) ①设计好PCR仪的循环程序 ②按配方准备好各组分 ③用微量移液器在微量离心管中依次加入各组分 ④进行PCR反应 ⑤离心使反应液集中在离心管底部 A．②③⑤④① D．①⑤③②④ C．②③⑤①④ D．④②⑤③① 解析：选C　PCR反应的操作步骤一般分为准备(包括配制配方及将各配方放于实验台上)―→移液―→混合―

16、→离心―→反应。因PCR仪是一种自动控制温度的仪器，设计好循环程序就可以进行反应了。 4．下列对操作过程的叙述，错误的是(　　) A．PCR反应中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌 B．PCR所用的缓冲液和酶应分装成小份，并在－20 ℃储存 C．PCR所用的缓冲液和酶从冰箱拿出之后，迅速融化 D．在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的吸液枪头都必须更换 解析：选C　为了防止外源DNA等因素的污染，PCR反应中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌；所用的缓冲液及酶应分装成小份保存，并使用一次性吸液枪头，

17、即A、B、D均正确。在冰箱中放置的缓冲液和酶取出后应放在冰块上缓慢融化，而不能迅速融化，故C错误。 5．PCR(多聚酶链式反应)技术是一项在生物体外复制特定的DNA片段的核酸合成技术，下图表示合成过程，请据图分析回答问题： (1)A过程高温使DNA变性解聚，对该过程原理的叙述，正确的是________。 A．该过程用到耐高温的解旋酶破坏氢键 B．该过程用到限制酶破坏磷酸二酯键 C．该过程不需要解旋酶的作用 D．该过程与人体细胞的过程完全相同 (2)C过程要用到的酶是________________。这种酶在高温下仍保持活性，因此在PCR扩增时可以________加入，____

18、____(填“需要”或“不需要”)再添加。PCR反应除提供酶外，还需要满足的基本条件有：______________________________________________ ________________________________________________________________________。 (3)如果把模板DNA的两条链用15N标记，游离的脱氧核苷酸不做标记，控制“94 ℃―→55 ℃―→72 ℃”温度循环3次，则在形成的子代DNA中含有15N标记的DNA占_____。 解析：PCR技术用高温使DNA两条链解开，该过程不需要解旋酶的作用。C过程是链的

19、延伸，需要DNA聚合酶参与；PCR反应除提供酶外，还需要满足的基本条件有：DNA模板，分别与两条模板链相结合的两种引物，四种脱氧核苷酸，同时通过控制温度使DNA复制在体外反复进行等。循环3次共形成8个DNA分子，其中两个DNA分子含15N标记，占总数的25%。 答案：(1)C　(2)DNA聚合酶　一次　不需要　DNA模板、分别与两条模板链相结合的两种引物、四种脱氧核苷酸、同时要控制好温度　(3)25% [课时跟踪检测] (满分50分　时间25分钟) 一、选择题(每小题3分，共24分) 1．下列有关PCR技术的叙述，不正确的是(　　) A．PCR技术利用的是碱基互补配对原则 B．P

20、CR技术可用于基因诊断，判断亲缘关系等 C．PCR技术需在体内进行 D．PCR技术可分为变性、复性、延伸三个阶段 解析：选C　PCR技术是聚合酶链式反应的简称，是在体外快速大量复制DNA片段的一种新技术。 2．PCR一般要经过三十多次循环，从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链作模板时将(　　) A．仍与引物Ⅰ结合进行DNA子链的延伸 B．与引物Ⅱ结合进行DNA子链的延伸 C．同时与引物Ⅰ和引物Ⅱ结合进行子链延伸 D．无需与引物结合，在酶的作用下从头合成子链 解析：选B　当由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链作模板时，此单链引物端为5′端，

21、因此与它互补的子链应从另一端开始合成，即与引物Ⅱ结合延伸DNA的子链。 3．在PCR扩增实验中，引物是很重要的。下列属于引物特点的是(　　) ①引物长度一般是80～100个碱基对(bp)为宜 ②DNA聚合酶能从引物的5′端开始延伸DNA链 ③引物是一小段DNA或RNA ④引物能与DNA母链的一段碱基序列互补配对 A．①②　　　　　　　 　B．③④ C．①③ D．②④ 解析：选B　引物长度一般以20～30个碱基对(bp)为宜，包括引物Ⅰ和引物Ⅱ两种。引物太短或太长，都可能降低产物的特异性。引物是一小段DNA或RNA，它能与DNA母链的一段碱基序列互补配对；DNA聚合酶不能从头

22、开始合成DNA，只能从3′端延伸DNA链，当引物与DNA母链结合后，DNA聚合酶就能从引物的3′端开始延伸DNA链。 4．在PCR扩增DNA的实验中，根据设计，一分子DNA经30次循环后，应得到约230个DNA分子，但结果只有约210个DNA分子。出现该现象的原因可能是(　　) ①循环次数不够 ②Taq DNA 聚合酶活力不够或其活性受到抑制 ③引物不能与母链结合 ④系统设计欠妥 A．①②③ D．①②④ C．①③④ D．②③④ 解析：选B　解答本题应从PCR扩增过程的条件进行分析： ①循环次数过少，产物的量比预期的少； ②Taq DNA聚合酶活力不够或其活性受到抑制

23、，导致催化效率降低，得到的产物比预期的少； ③如果引物设计不合理，则无法进行扩增； ④PCR系统设置不妥，达不到预期的效果。 5．下列有关PCR技术的叙述，不正确的是(　　) A．聚合酶链式反应，是用DNA聚合酶在体外扩增DNA片段的技术 B．在用PCR技术扩增DNA时，DNA的复制过程与细胞内DNA的复制类似 C．PCR反应需在一定的缓冲溶液中进行，只需提供DNA模板以及四种脱氧核苷酸即可 D．PCR一般经历三十多次循环，每次循环均分为变性、复性和延伸三个阶段 解析：选C　PCR反应需要在一定的缓冲溶液中进行，需提供DNA模板、分别与两条模板链相结合的两种引物、四种脱氧核苷酸

24、、耐热的DNA聚合酶，同时通过控制温度使DNA复制在体外反复进行。 6．右面为DNA变性和复性示意图，下列相关说法不正确的是(　　) A．向右的过程为加热(80～100 ℃)变性的过程 B．向左的过程是DNA双链缓慢降温复性 C．变性与在生物体内解旋过程的条件、实质都相同 D．图中DNA片段共有2个游离的磷酸基、2个3′端 解析：选C　DNA体外的变性同体内的解旋实质是相同的，都是使氢键断裂，DNA双螺旋打开，只是体内需解旋酶，体外是高温条件。 7．复性温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度冷却至40～60 ℃，可使引物和模板发生结合。PCR的结果可不考虑原来解旋开的两个

25、DNA模板链的重新结合，原因不包括(　　) A．由于模板DNA比引物复杂得多 B．引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞 C．加入引物的量足够多而模板链数量少 D．模板链加热解旋已经变性不可能再次结合 解析：选D　复性的原理是碱基互补配对，解旋后DNA分子变成单链，碱基序列未发生改变，冷却后仍可以进行复性。 8.“X基因”是DNA分子上一个有遗传效应的片段，若要用PCR技术特异性地拷贝“X基因”，需在PCR反应中加入两种引物，两种引物及其与模板链的结合位置如图1所示。经4轮循环后产物中有五种不同的DNA分子，如图2所示，其中第⑤种DNA分子有几个(　　) 图

26、1 图2 A．2 D．4 C．6 D．8 解析：选D　PCR技术扩增时，由两种引物决定所扩增的片段的特定序列，上一次循环的产物为下一次循环的模板。第一次循环形成①和②，第二次循环形成①②③④四个DNA，以此类推4次循环后共形成16个DNA，其中①②各一个，③④各三个，⑤共8个。 二、非选择题(共26分) 9．(13分)资料显示，近十年来，PCR(聚合酶链式反应)技术成为分子生物实验的一种常规手段，其原理是利用DNA半保留复制的特性，在试管中进行DNA的人工复制(如下图)，在很短的时间内，将DNA扩增几百万倍甚至几十亿倍，使分子生物实验所需的遗传物质不再受限于活的生物体。

27、请据图回答下列有关问题： (1)加热至95℃的目的是使DNA样品的________键断裂，此过程在生物体细胞内是通过________酶的作用来完成的。 (2)新合成的DNA分子与模板DNA分子完全相同的原因是____________________和________________________________________________________________________。 (3)通过PCR技术使DNA分子大量复制时，若将一个用15N标记的模板DNA分子(第一代)放入试管中，以14N标记的脱氧核苷酸为原料，连续复制到第五代时，含15N标记的DNA分子单链数占全部D

28、NA总单链数的比例为________。 (4)PCR技术不仅为遗传病的诊断带来了便利，而且改进了检测细菌和病毒的方法。若要检测一个人是否感染了艾滋病病毒，你认为可用PCR技术扩增他血液中的(　　) A．白细胞DNA D．病毒的蛋白质 C．血浆中的抗体 D．病毒的核酸 解析：通过PCR技术使DNA分子大量复制时，同样遵循碱基互补配对原则，其复制方式仍然是半保留复制；复制到第5代即复制了4次；检测一个人是否感染了艾滋病病毒，可以通过检测该人的血液中是否含有病毒核酸来判定。 答案：(1)氢　解旋　(2)DNA分子独特的双螺旋结构　复制过程中严格遵循碱基互补配对原则 (3)　(4)

29、D 10．(13分)请回答PCR技术方面的有关问题： (1)利用 PCR 技术扩增目的基因，其原理与细胞内DNA复制类似(如下图所示)。图中引物为单链 DNA 片段，它是子链合成延伸的基础。 ①从理论上推测，第四轮循环产物中含有引物 A 的 DNA 片段所占的比例为________。 ②在第________轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的 DNA 片段。 (2)设计引物是 PCR 技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)都不合理(如下图)，请分别说明理由。 ①第 1 组：__________________________________

30、_______________________； ②第 2 组：_________________________________________________________。 (3)PCR 反应体系中含有热稳定 DNA 聚合酶，下面的表达式不能正确反映 DNA 聚合酶的功能，这是因为___________________________________________________。 解析：(1)①依据图解特点，第四轮循环产物中可以得到16个DNA分子，其中有15个含引物A的单链，以及一个不含引物A的模板链。②从图解原DNA与引物A、B的比例关系分析，经三次复制后开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段。(2)比较第一组引物的碱基顺序，可以发现引物Ⅰ与引物Ⅱ有两对碱基能发生互补配对形成局部双链结构而失效；而第二组引物中，引物Ⅰ′折叠后会发生碱基互补配对而导致失效。(3)在PCR反应体系中，引物首先与模板DNA单链互补配对形成局部双链DNA片段，然后在DNA聚合酶的作用下将单个脱氧核苷酸依次连接到引物链上。 答案：(1)①　②三 (2)①引物Ⅰ和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效 ②引物Ⅰ′自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效 (3)DNA聚合酶只能将单个脱氧核苷酸连续结合到双链DNA片段的引物链上